汪麗娜，彭 琴，蔡碧雅，黃鳴清，許 文，吳水生

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

澤瀉為澤瀉科植物東方澤瀉Alisma orientale（Sam.）Juzep.或澤瀉Alisma plantago-aquaticaLinn.的干燥塊莖，具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂的功效，臨床主要應(yīng)用于小便不利、水腫脹滿、熱淋澀痛等［1］。澤瀉主產(chǎn)于福建、四川、江西、廣西等省，福建澤瀉因其質(zhì)佳，素有“建澤瀉”之稱［2-3］，其基原為東方澤瀉Alisma orientale（Sam.）Juzep.；四川為“川澤瀉”，其基原為澤瀉Alisma plantago-aquaticaLinn.。澤瀉是大宗藥材，其主要藥效成分為三萜類化合物［4-5］，如澤瀉醇 A、澤瀉醇 B、23-乙酰澤瀉醇 B、23-乙酰澤瀉醇C 等成分［6-7］?，F(xiàn)代藥理研究表明，澤瀉中三萜成分具有利尿、抗動(dòng)脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)等活性［8-9］。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）獲得基因信息并進(jìn)行生物信息學(xué)分析的方法應(yīng)用廣泛［10-11］。利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)RNA 反轉(zhuǎn)錄成的cDNA 文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，以期獲得特定組織或細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本及其表達(dá)水平［12］。RNA-Seq 在中草藥功能基因鑒定、次生代謝調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用［13-14］，目前在藥用植物葫蘆巴、黃參、澤瀉等中均有報(bào)道［15-17］。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)首次對(duì)建澤瀉與川澤瀉全生長(zhǎng)階段（包括花前、花中、花后、果前、果中、果后）的全植株（包括根、莖和葉）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)分析，以期獲得建澤瀉與川澤瀉的轉(zhuǎn)錄組注釋信息、三萜類成分生物合成基因及簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）信息，為澤瀉生長(zhǎng)發(fā)育和三萜類活性成分生物合成的分子調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 藥用植物建澤瀉和川澤瀉采自南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，并由福建中醫(yī)藥大學(xué)范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為澤瀉科植物東方澤瀉Alisma orientale（Sam.）Juzep.和澤瀉Alisma plantago-aquaticaLinn.，采集建澤瀉、川澤瀉全生長(zhǎng)階段（包括花前、花中、花后、果前、果中、果后）的全植株（包括根、莖和葉）樣品于液氮中速凍并置于-80 ℃冰箱中保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RP3201 總RNA 快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；RK20400 cDNA第一鏈合成試劑盒（湖北愛(ài)博泰克生物科技有限公司）；引物（上海生物工程股份有限公司）；瓊脂糖（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；EB 緩沖液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Nanodrop 2000 超微量分光光度計(jì)（美國(guó)NanoDrop 公司）；Agilent 2100 生物分析儀（美國(guó)Agilent 公司）；7900HT 熒光定量PCR 儀（湖北愛(ài)博泰克生物科技有限公司）；DYCP-31E 瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；HVE-50 高壓滅菌鍋（華粵行儀器有限公司）。

1.2 RNA 提取、檢測(cè) 通過(guò)Trizol 法分別提取建澤瀉、川澤瀉全生長(zhǎng)階段全植株的總RNA，利用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度，使用生物分析儀檢測(cè)RNA 的完整性。用帶有Oligo 的磁珠富集mRNA，加入打斷試劑將mRNA 打成短片段，以其為模板，合成cDNA 的第一條鏈；加入緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、核糖核酸酶H 和DNA 聚合酶合成第二條鏈；使用試劑盒純化加緩沖液后做末段修復(fù)，加多聚腺苷酸并連接測(cè)序接頭，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。將檢測(cè)合格的RNA 委托上海人類基因組研究中心進(jìn)行測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與數(shù)據(jù)組裝 本實(shí)驗(yàn)采用Trinity 2.0.6 軟件對(duì)2 個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行組裝，并對(duì)得到的轉(zhuǎn)錄本（Transcripts）、單基因簇（Unigene）、堿基、N50 大小以及GC 含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 基因功能注釋及SSR 檢測(cè) 采用BLASTX 法將測(cè)序得到的Unigene 提交至蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（SwissProt，http：//www.ebi.ac.uk/swissprot/）、蛋白質(zhì)家族集合數(shù)據(jù)庫(kù)（Pfam，http：//pfam.xfam.org/）、信號(hào)肽預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)（SignalP，http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、蛋白跨膜區(qū)信號(hào)肽預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)（TMHMM，http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)（GO，http：//www.geneontology.org）、蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)（COG，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）和京都基因與基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG，https：//www.kegg.jp/）進(jìn)行比對(duì)分析，從而獲得有關(guān)功能基因的注釋信息。使用微衛(wèi)星識(shí)別工具（MISA）軟件對(duì)獲得的Unigene 進(jìn)行SSR 位點(diǎn)挖掘。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及質(zhì)量評(píng)價(jià) 通過(guò)Illumina HiseqTM2500 高通量測(cè)序，建澤瀉、川澤瀉的原始序列分別有 112 559 910、86 442 594 條。數(shù)據(jù)過(guò)濾后，2 個(gè)樣品平均剩余94.02%的高質(zhì)量序列，GC 含量均為44.53%，且堿基質(zhì)量值Q30 都在90%以上，說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量良好，見(jiàn)表1。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

2.2 轉(zhuǎn)錄組組裝與分析 利用Trinity 軟件對(duì)上述的高質(zhì)量序列進(jìn)行組裝，建澤瀉獲得186 733個(gè)Transcripts和 167 109 條 Unigene，川澤瀉得到 171 526 個(gè)Transcripts 和 152 757 條 Unigene，本實(shí)驗(yàn)兩樣品的N50 均超過(guò)800 bp，表明序列完整性及測(cè)序正確率良好，見(jiàn)表2。對(duì)Unigene的長(zhǎng)度分布特征進(jìn)行分析，兩樣品所占比例最大的Unigene 為200～500 bp，≥1 000 bp 的Unigene 約占15.00%。結(jié)果表明，Unigene 的整體長(zhǎng)度分布均勻，組裝序列完整性較好，便于后續(xù)的分析，見(jiàn)圖1。

表2 建澤瀉與川澤瀉的轉(zhuǎn)錄本和單基因簇?cái)?shù)據(jù)組裝

圖1 建澤瀉與川澤瀉Unigene 長(zhǎng)度分布

2.3 基因功能注釋及分類 基于BLASTX 算法將Unigene 比對(duì)到 SwissProt、Pfam、SignalP、TMHMM、COG、GO、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)。建澤瀉共注釋 53 566 條Unigene，其中注釋數(shù)目最多的是KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，有22 695 個(gè)Unigene 獲得同源匹配信息，占比42.37%；川澤瀉共注釋49 448 條Unigene，在KEGG 庫(kù)中有19 124 個(gè)Unigene 獲得同源匹配信息，匹配比例為38.67%。以下為建澤瀉與川澤瀉在7 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋結(jié)果，見(jiàn)表3。

表3 在7 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋結(jié)果［條（%）］

2.4 GO 注釋及分類 將建澤瀉與川澤瀉的Unigene 在GO 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行功能分類，見(jiàn)圖2。其功能可分為三大類：生物過(guò)程（biological process）、分子功能（molecular function）和細(xì)胞組分（cellular component），這三類功能包含30 個(gè)亞類。在生物過(guò)程的大類中，最具代表性的是DNA 集成（DNA integration），注釋數(shù)量最多；分子功能大類中最多聚集于鋅離子結(jié)合（zinc ion binding），在細(xì)胞組分的大類中細(xì)胞核（nucleus）和膜的有機(jī)組成（integral component of membrane）占比最高，建澤瀉與川澤瀉在GO功能分類中有相似的特點(diǎn)。

圖2 建澤瀉與川澤瀉GO 功能分類圖

2.5 COG 注釋及功能分類 通過(guò)對(duì)Unigene 進(jìn)行COG 注釋及功能分類，這些基因分屬于24 個(gè)功能類別，見(jiàn)圖3。建澤瀉與川澤瀉在不同功能分類中有共同的特點(diǎn)，其中可移動(dòng)基因組：原噬菌體，轉(zhuǎn)因子（mobilome：prophages，transposons）基因數(shù)量最多；其次是翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)及生物起源（translation，ribosomal structure and biogenesis）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（signal transduction mechanisms）；RNA 加工與修飾（RNA processing and modifications）、細(xì)胞骨架（cytoskeleton）所占Unigene 最少。但從圖中可知還有部分未知功能的Unigene，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

圖3 建澤瀉與川澤瀉COG 功能分類

2.6 KEGG 功能注釋及澤瀉中三萜類成分生物合成相關(guān)基因鑒定 對(duì)建澤瀉和川澤瀉的Unigene 進(jìn)行KEGG 代謝通路富集分析，分別有 22 695、19 124 條Unigene 被注釋，與萜類生物合成相關(guān)的基因涉及5 個(gè)次生代謝通路，建澤瀉與川澤瀉分別有276、241 條Unigene 參與其中。建澤瀉中Unigene 數(shù)量最多的代謝通路是萜類化合物骨架生物合成（terpenoid backbone biosynthesis，ko00900）、泛醌和其他萜類醌生物合成（ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis，ko00130），各有89 條；其次為二萜類生物合成（diterpenoid biosynthesis，ko00904），有61 條；倍半萜和三萜生物合成（sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis，ko00909）與單萜生物合成（monoterpenoid biosynthesis，ko00902）最少，分別有13 和24 條。川澤瀉中Unigene 數(shù)目最多的是萜類化合物骨架生物合成，有84 條；泛醌和其他萜類醌生物合成、倍半萜和三萜生物合成次之，各為72、45 條；單萜生物合成與二萜類生物合成最少，分別是23、17 條。

根據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋，見(jiàn)圖4，結(jié)合澤瀉中已經(jīng)被報(bào)道的三萜類成分，推測(cè)澤瀉的生物合成途徑，乙酰輔酶A（acetyl-CoA）在羥甲基戊二酰輔酶A 合酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA synthetase，HMGS）、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（hydroxy methyl glutaryl-CoA reductase，NADPH）、甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase，MK）、甲羥戊酸磷酸激酶（mevalonic acid phosphate kinase，MAPK）、焦磷酸甲羥戊脫羧酶（pyrophosphomevalonate decarboxylase，MVD）催化下經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)生成焦磷酸法尼酯（farnesyl-PP），然后焦磷酸法尼酯在法尼基焦磷酸合酶（farnesyl-diphosphate synthase，F(xiàn)PPS）催化下生成前喹啉（presqualene-pp），其通過(guò)角鯊烯合酶（naringenin 3-dioxygenase，SQS）生成角鯊烯（squalene），隨后在角鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）催化下生成骨架類型為原萜烷型的澤瀉三萜，見(jiàn)圖5。

圖4 建澤瀉與川澤瀉三萜類生物合成途徑KEGG 注釋圖

圖5 建澤瀉與川澤瀉三萜類潛在生物合成途徑圖

2.7 SSR 分析 利用MISA 軟件對(duì)建澤瀉與川澤瀉Unigene 進(jìn)行SSR 分析，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的序列總長(zhǎng)度分別為33 731 649、29 651 576 bp，各有4 263、3 725 個(gè)SSR，見(jiàn)表4。建澤瀉與川澤瀉單堿基重復(fù)的SSR數(shù)量最多，有 1 871、1 672 個(gè)，其中 A/T 類型的比例最高，分別是 1 668、1 488 個(gè)；五堿基重復(fù) SSR 最少，均為6 個(gè)，見(jiàn)表 5。

表4 建澤瀉與川澤瀉SSR 分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表5 SSR 重復(fù)類型分布

3 討 論

研究表明，澤瀉不同部位均含有活性的萜類成分，但不同采收期澤瀉萜類成分的積累與質(zhì)量存在差異［18-20］。秦霞等［17］已對(duì)建澤瀉、川澤瀉、窄葉澤瀉的幼嫩葉片進(jìn)行了高通量測(cè)序，表明澤瀉SSR數(shù)量及類型較為豐富。但目前關(guān)于不同生長(zhǎng)時(shí)期不同部位的建澤瀉與川澤瀉轉(zhuǎn)錄組研究尚未見(jiàn)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)選擇建澤瀉與川澤瀉全生長(zhǎng)階段（包括花前、花中、花后、果前、果中、果后）全植株（包括根、莖和葉）進(jìn)行第二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。利用Trinity軟件組裝，建澤瀉獲得186 733 個(gè)Transcripts 和167 109 條 Unigene，川 澤 瀉 得 到 171 526 個(gè) Transcripts 和 152 757 條 Unigene，組裝結(jié)果質(zhì)量評(píng)估可從N50 數(shù)值來(lái)評(píng)估（一般認(rèn)為N50≥800 bp 的序列組裝完整性較好）。本實(shí)驗(yàn)兩樣品的N50 均超過(guò)800 bp，且堿基質(zhì)量值Q30（堿基正確識(shí)別率達(dá)99.9%）均在90%以上，表明序列完整性及測(cè)序正確率較好。將測(cè)序得到的Unigene 在7 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋，建澤瀉注釋53 566 條Unigene，川澤瀉共注釋49 448 條Unigene。其中，注釋數(shù)目最多為KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，有 22 695、19 124 條；在 GO 數(shù)據(jù)庫(kù)中各注釋 3 451、3 348 條 Unigene；在 COG 數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋2 519、2 391 條Unigene，其中仍有部分未知功能的Unigene，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

通過(guò)KEGG 通路富集分析，與萜類生物合成相關(guān)的基因涉及5 個(gè)次生代謝通路，建澤瀉與川澤瀉分別有276、241 條Unigene 參與其中。澤瀉的主要藥效成分為三萜類化合物，如澤瀉醇A、澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C 等成分。根據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋，篩選出與三萜類成分合成相關(guān)的酶，主要包括 HMGS、NADPH、MK、MAPK、MVD、FPPS、SQS、SE，這些發(fā)現(xiàn)對(duì)挖掘其次生代謝物的生物合成途徑關(guān)鍵基因提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物研究的各個(gè)領(lǐng)域，其中SSR 是目前應(yīng)用較為廣泛的一種標(biāo)記技術(shù)。對(duì)建澤瀉與川澤瀉進(jìn)行SSR分析，挖掘到4 263、3 725 個(gè)SSR 位點(diǎn)，其在6 種不同的堿基重復(fù)類型中均有分布，單堿基重復(fù)的SSR 數(shù)量最多，有1 871、1 672 個(gè)，其中單堿基A/T 重復(fù)類型的比例最高。上述結(jié)果為深入開(kāi)發(fā)澤瀉SSR 分子標(biāo)記提供理論基礎(chǔ)。

本研究對(duì)建澤瀉與川澤瀉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了大量的轉(zhuǎn)錄本序列信息，利用生物信息學(xué)對(duì)測(cè)序得到的Unigene 進(jìn)行功能注釋、代謝通路富集分析及SSR 位點(diǎn)的研究，初步揭示了不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同部位建澤瀉與川澤瀉轉(zhuǎn)錄組的整體特征，為研究澤瀉的生長(zhǎng)發(fā)育及其活性成分生物合成的分子調(diào)控機(jī)制提供參考。