鄭 婕 莊遠(yuǎn)航 郭梓琪 許 藝 鐘俊杰 黃維峰 胡 芳 李海渤 雷建軍，2* 吳 昊*

（1 韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005；2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642；3 廣東省粵北食藥資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東韶關(guān) 512005）

辣椒（spp.）是茄科辣椒屬的重要蔬菜作物，也是我國(guó)栽培面積最大的蔬菜作物（鄒學(xué)校 等，2020；王立浩 等，2021）。廣東省作為我國(guó)重要的南菜北運(yùn)基地，辣椒年種植面積達(dá)9.92 萬(wàn)hm（李穎 等，2020）。隨著廣東省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及脫貧攻堅(jiān)的大力開(kāi)展，粵北地區(qū)辣椒種植面積逐年增大，辣椒病害發(fā)生也日趨嚴(yán)重。辣椒炭疽病是一種世界性的辣椒病害，每年全球因炭疽病導(dǎo)致辣椒減產(chǎn)約50%，熱帶或亞熱帶地區(qū)受到的影響最為嚴(yán)重（Than et al.，2008；Ridzuan et al.，2018）。印度每年因炭疽病造成辣椒減產(chǎn)10%～54%，越南因炭疽病導(dǎo)致辣椒產(chǎn)量下降最高可達(dá)80%（Saxena et al.，2016）。辣椒炭疽病在我國(guó)可導(dǎo)致辣椒減產(chǎn)30%～40%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)50%左右（林清 等，2005；周黛媛 等，2022），廣東省地處亞熱帶和熱帶，是辣椒炭疽病的高發(fā)地區(qū)。

辣椒炭疽病的典型癥狀是在病果和病葉上出現(xiàn)同心輪紋狀病斑，病原菌不僅為害生長(zhǎng)期的辣椒果實(shí)和莖葉，還能在采后貯運(yùn)過(guò)程中持續(xù)造成果實(shí)腐爛，嚴(yán)重影響干鮮椒的產(chǎn)量和品質(zhì)。引起辣椒炭疽病的病原菌屬于半知菌亞門(mén)炭疽菌屬（），該屬種類(lèi)繁多且類(lèi)別復(fù)雜，常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)種有（異名）、（曾被鑒定為）以及（曾被鑒定為）（Mongkolporn，2019）。我國(guó)已報(bào)道的辣椒炭疽病致病菌至少有15種，且不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種差異較大（Diao et al.，2017）。由于不同的炭疽病菌對(duì)殺菌劑的敏感性存在差異（滿(mǎn)益龍 等，2016），而殺菌劑的不合理施用不僅會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥浪費(fèi)和環(huán)境污染，還可能導(dǎo)致病原菌出現(xiàn)耐藥性甚至抗藥性。因此有必要針對(duì)辣椒主要產(chǎn)區(qū)的炭疽病菌進(jìn)行分離和鑒定，為指導(dǎo)田間高效防治藥劑的施用奠定基礎(chǔ)。為此，本試驗(yàn)對(duì)采集自廣東省韶關(guān)市南雄市辣椒種植區(qū)的辣椒炭疽病病果進(jìn)行病原菌分離純化和微生物學(xué)、分子生物學(xué)方法鑒定，并利用12 種殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，以期為粵北地區(qū)辣椒炭疽病防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離純化

2020 年10 月于廣東省韶關(guān)市南雄市湖口鎮(zhèn)辣椒基地，采集疑似感染炭疽病的朝天椒果實(shí)樣本。將獲得的果實(shí)樣本帶回實(shí)驗(yàn)室，通過(guò)組織分離法將病果的病健交界處剪成5 mm × 5 mm 小塊，用0.1%HgCl消毒1 min，滅菌ddHO 沖洗5～6 次后用無(wú)菌吸水紙吸干水分，接種到番茄燕麥瓊脂（tomato oatmeal agar，TOA）培養(yǎng)基中進(jìn)行分離培養(yǎng)及菌落純化。TOA 培養(yǎng)基：番茄汁150 mL、CaCO0.6 g、燕麥片40 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min。

1.2 病原菌孢子懸液制備

用打孔器在TOA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 周的菌落邊緣打取直徑0.3 cm 的小菌塊，取3～5 個(gè)菌塊置于50 mL 液體TOA 培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫?fù)u床中130 r·min培養(yǎng)72 h。在超凈工作臺(tái)中將培養(yǎng)好的菌塊轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入滅菌的蒸餾水，28 ℃光照條件下培養(yǎng)12 h。之后去除培養(yǎng)皿中的蒸餾水，置于28 ℃黑暗條件下處理12 h。待孢子囊成熟后，將菌塊轉(zhuǎn)移至無(wú)菌試管中，加5 mL 滅菌蒸餾水，利用渦旋儀振蕩2 min 使孢子囊脫落。孢子懸液用于顯微觀察和針刺接種。

1.3 病原菌的致病力測(cè)定

為了確定病原菌致病性，依據(jù)柯赫氏法則將病原分離物重新接種朝天椒，發(fā)病后再進(jìn)行分離鑒定（方中達(dá)，1998）。取新鮮健康的朝天椒綠果，對(duì)果實(shí)表面進(jìn)行消毒，采用針刺接種法將5 μL 病菌孢子懸浮液（孢子濃度為1 × 10個(gè)·mL）接種至果實(shí)表面，對(duì)照組接種等量滅菌ddHO，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度80%，每個(gè)處理進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

觀察并記錄病原菌菌落在TOA 培養(yǎng)基上的形態(tài)、大小及顏色等特征。誘導(dǎo)病菌的孢子懸浮液并進(jìn)行顯微制片，通過(guò)顯微鏡觀察并記錄病原菌的分生孢子形態(tài)特征。

1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

利用真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒〔生工生物工程（上海）股份有限公司，B518229〕，對(duì)病原菌的基因組DNA 進(jìn)行抽提和純化。對(duì)病原菌的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔序列（internal transcribed spaces，ITS）、β-微管蛋白基因（β-tubulingene，）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene，）、幾 丁質(zhì)合成酶A 基因（chitin synthase A gene，）和肌動(dòng)蛋白基因（actin gene，）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所用引物見(jiàn)表1。PCR 的反應(yīng)體系包括病原菌基因組DNA 100 ng，引物4 mmol·L，KOD 酶0.4 μL，2× KOD buffer 10 μL，dNTP 4 mmol·L，ddHO 補(bǔ)足至20 μL。PCR 程序設(shè)置為：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，68 ℃延伸30 s；共35 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增長(zhǎng)度符合預(yù)期的PCR產(chǎn)物連接到pEASY-blunt zero 載體上，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序及進(jìn)一步的序列分析。

表1 病原菌分子鑒定相關(guān)基因克隆所用引物

1.6 多基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

將、、、和基 因片段的測(cè)序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)，利用數(shù)據(jù)庫(kù)中的炭疽菌屬模式菌株的、、、和基因序列作為參考序列（Diao et al.，2017）。將上述基因序列進(jìn)行串聯(lián)分析，利用Geneious v4.8.3 軟件對(duì)組合數(shù)據(jù)集進(jìn)行鄰接（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)聚類(lèi)分析，通過(guò)自展法（bootstrap analysis）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)化枝的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，重復(fù)1 000 次。本試驗(yàn)涉及的炭疽菌屬模式菌株的相關(guān)信息詳見(jiàn)表2。

表2 用于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析的炭疽菌菌株

1.7 藥劑室內(nèi)毒力測(cè)定

供試12 種常用殺菌劑購(gòu)買(mǎi)于本地市場(chǎng)（表3）。先將12 種殺菌劑配制成待測(cè)母液，然后按比例加至TOA 培養(yǎng)基中：在無(wú)菌條件下，按10、100、1 000 μg·mL的終濃度將所需母液量加入培養(yǎng)基中，空白對(duì)照為加入等量無(wú)菌水的培養(yǎng)基。用接種針挑取直徑為3 mm 的菌塊接種至培養(yǎng)基的中央，28 ℃培養(yǎng)7 d，每個(gè)濃度梯度進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。采用“十”字交叉法對(duì)菌落直徑進(jìn)行測(cè)量并記錄數(shù)據(jù)。將抑菌效果較好的6 種有效藥劑挑出進(jìn)行第2輪試驗(yàn)，其中咪鮮胺、苯甲·丙環(huán)唑和甲基硫菌靈濃度梯度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg·mL，腈菌唑、唑醚·代森聯(lián)和醚菌酯濃度梯度為5、10、20、40、80 μg·mL。采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定和計(jì)算不同藥劑的抑菌率。根據(jù)各殺菌劑濃度對(duì)數(shù)值及對(duì)應(yīng)的抑菌率作回歸分析，計(jì)算各殺菌劑的毒力回歸方程（=+）、抑菌有效中濃度（EC）及相關(guān)系數(shù)（）。

表3 供試藥劑及生產(chǎn)廠家

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-接種菌餅直徑）× 100%

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，利用DPS v7.05 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 南雄朝天椒炭疽病的危害及病原菌的分離

辣椒炭疽病多發(fā)生于每年7 月初至9 月中旬，正是成熟辣椒大量采收和貯運(yùn)的關(guān)鍵時(shí)期。2020年，廣東省韶關(guān)市南雄市朝天椒種植區(qū)大面積暴發(fā)辣椒炭疽病，嚴(yán)重地塊的病果率高達(dá)80%。該病原菌主要為害紅熟后的辣椒果實(shí)，并在采后貯運(yùn)過(guò)程中持續(xù)造成果實(shí)腐爛。發(fā)病初期，被害果實(shí)出現(xiàn)褐色不規(guī)則病斑。貯運(yùn)過(guò)程中密封的濕熱環(huán)境加速病害的蔓延，病斑上出現(xiàn)橘黃色的孢子團(tuán)。發(fā)病后期，病斑擴(kuò)散至整個(gè)果實(shí)，病果失水干枯并發(fā)生脫落（圖1-a）。

圖1 南雄辣椒炭疽病發(fā)病癥狀及病原菌形態(tài)

通過(guò)組織分離法，在TOA 培養(yǎng)基上分離到白色的真菌菌落（圖1-b）。對(duì)分離得到的病原菌進(jìn)行純化，菌落在培養(yǎng)基上呈圓形，菌絲呈白色絨狀，后期逐漸變?yōu)榛疑⒂型沫h(huán)紋（圖1-c）。分生孢子為無(wú)色單胞，形狀為長(zhǎng)棒狀，長(zhǎng)軸為8～17 μm，短軸為4～6 μm（圖1-d）。

2.2 病原菌的致病性測(cè)定

利用針刺接種法對(duì)新鮮的朝天椒綠果進(jìn)行炭疽病菌孢子懸液的接種，2 d 后接種位置出現(xiàn)炭疽病病斑，病情發(fā)展迅速。接種后第6 天，炭疽病病斑凹陷，呈長(zhǎng)橢圓形，直徑可達(dá)10～15 mm，中央產(chǎn)生大量橙色粘稠的孢子團(tuán)，外周呈褐色；對(duì)照未出現(xiàn)病斑，針刺位置可清晰辨認(rèn)（圖2）。根據(jù)柯赫氏法則，將本次試驗(yàn)的發(fā)病組織重新進(jìn)行組織分離，得到的病原菌與之前分離的原始病原菌一致，確定該菌為南雄朝天椒炭疽病的致病菌，并將該菌株命名為NX-1。

圖2 辣椒炭疽病病原菌的致病性測(cè)定結(jié)果

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)南雄辣椒炭疽病菌NX-1 的、、、和基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度分別為558、759、248、291 bp 和 250 bp的DNA 序列（圖3）。對(duì)上述基因片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)多基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明病原菌NX-1 與炭疽菌模式菌株CBS 120708 為一個(gè)進(jìn)化支（圖4）。結(jié)合NX-1 的形態(tài)學(xué)特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果，將南雄辣椒炭疽病菌NX-1 鑒定為炭疽菌。

圖3 NX-1 分子鑒定相關(guān)基因的PCR 擴(kuò)增

圖4 炭疽病菌NX-1 的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果

2.4 12 種藥劑對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌效果鑒定

通過(guò)10、100、1 000 μg·mL3 個(gè)濃度梯度的12 種藥劑對(duì)炭疽病進(jìn)行初步的抑菌效果鑒定，結(jié)果表明：咪唑類(lèi)和三唑類(lèi)的單劑（咪鮮胺和腈菌唑）或復(fù)配劑（苯甲·丙環(huán)唑）均表現(xiàn)出良好的抑菌效果；取代苯基類(lèi)的甲基硫菌靈抑菌效果較好，但百菌清效果一般；甲氧基丙烯酸酯類(lèi)的單劑（醚菌酯）或復(fù)配劑（唑醚·代森聯(lián)）也表現(xiàn)出較好的抑菌效果；春雷·王銅和甲霜·噁霉靈這兩種復(fù)配劑只能在高濃度條件下具有抑菌作用；噁霉·絡(luò)氨銅的抑菌效果較差；烯酰嗎啉和噻菌酮幾乎沒(méi)有抑菌作用（圖5、6）。

圖5 不同濃度殺菌劑對(duì)炭疽病菌NX-1 菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

圖6 不同濃度殺菌劑對(duì)炭疽病菌NX-1 的抑制率

2.5 6 種有效藥劑對(duì)辣椒炭疽病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

采用咪鮮胺、苯甲·丙環(huán)唑、甲基硫菌靈、腈菌唑、唑醚·代森聯(lián)和醚菌酯6 種抑菌效果較好的殺菌劑對(duì)NX-1 進(jìn)一步進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果表明，6 種藥劑均能不同程度地抑制炭疽病菌菌絲的生長(zhǎng)，其抑菌作用由強(qiáng)到弱依次為：咪鮮胺＞苯甲·丙環(huán)唑＞甲基硫菌靈＞腈菌唑＞唑醚·代森聯(lián)＞醚菌酯（圖7）。咪鮮胺和苯甲·丙環(huán)唑的EC均在1 μg·mL以?xún)?nèi)，分別為0.019 6 μg·mL和0.282 8 μg·mL，抑菌效果較強(qiáng)；其次是甲基硫菌靈和腈菌唑，EC分別為1.694 6 μg·mL和7.475 6 μg·mL；唑醚·代森聯(lián)和醚菌酯的EC較高，分別為16.130 8 μg·mL和19.942 8 μg·mL（表4）。

圖7 6 種有效藥劑對(duì)炭疽病菌NX-1 菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

表4 6 種有效殺菌劑對(duì)炭疽病菌NX-1 的室內(nèi)毒力測(cè)定

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，廣東省南雄市的辣椒種植逐漸成為了具有地方特色的北運(yùn)蔬菜產(chǎn)業(yè)。然而，辣椒的炭疽病害也隨著南雄辣椒種植面積的擴(kuò)大而日趨嚴(yán)重。本試驗(yàn)從南雄市湖口鎮(zhèn)辣椒基地采集疑似辣椒炭疽病的自然發(fā)病朝天椒果實(shí)，獲得分離純化的辣椒炭疽病病原菌，通過(guò)致病性測(cè)定、微生物形態(tài)學(xué)分析和分子生物學(xué)研究方法確定南雄朝天椒炭疽病病原菌的種類(lèi)為。近年來(lái)，分子生物學(xué)在真菌的分類(lèi)研究中發(fā)揮了很大作用，序列分析、多基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析等方法被廣泛應(yīng)用（Marin-Felix et al.，2017）?；蚴欠肿訖z測(cè)中最常用的靶基因，但該基因沒(méi)有足夠的變異位點(diǎn)用以區(qū)分所有的菌種（Innis et al.，1991）。本試驗(yàn)使用的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析是基于、、、和5 個(gè)基因的串聯(lián)分析，該方法在親緣關(guān)系較近、外形相似的真菌間的分析比較與種類(lèi)鑒定中較單基因序列分析更具優(yōu)勢(shì)。

通過(guò)對(duì)12 種殺菌劑的抑菌效果鑒定和室內(nèi)毒力測(cè)定，表明咪鮮胺、苯甲·丙環(huán)唑、甲基硫菌靈、腈菌唑、唑醚·代森聯(lián)和醚菌酯均對(duì)南雄辣椒炭疽病菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。從EC來(lái)看，咪鮮胺和苯甲·丙環(huán)唑的抑菌作用最強(qiáng)，其EC分別為0.019 6 μg·mL和0.282 8 μg·mL。因此，咪鮮胺和苯甲·丙環(huán)唑均可用于南雄辣椒炭疽病的防治，可將咪鮮胺作為首選殺菌劑，或二者交替使用。此外，由于田間環(huán)境影響因素較多，殺菌劑的室內(nèi)毒力與田間實(shí)際防治效果可能有所差異，今后將進(jìn)一步測(cè)定咪鮮胺和苯甲·丙環(huán)唑在大田中對(duì)辣椒炭疽病菌的影響，以期在實(shí)際的辣椒生產(chǎn)中指導(dǎo)企業(yè)和農(nóng)民在辣椒炭疽病害管理過(guò)程中科學(xué)、高效用藥，降低生產(chǎn)成本和農(nóng)藥施用量，為食品安全和生態(tài)環(huán)境提供保障。