符小玲，蔡興權(quán)，夏 蘭

（1.海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心輸血科，海南 ?？?570311；2.海南省人民醫(yī)院輸血科，海南 ?？?570311）

人類(lèi)紅細(xì)胞血型是一種重要的遺傳學(xué)標(biāo)志，種族和區(qū)域的不同使得血型抗原基因頻率的分布具有差異性［1-4］。目前臨床重視的主要是ABO 和Rh兩 個(gè) 血 型 系 統(tǒng)，對(duì)Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 等血型系統(tǒng)的關(guān)注相對(duì)較少。這些稀有血型等位基因頻率分布存在較大的差異，且等位基因的對(duì)偶抗原不配合率較高，是反復(fù)輸血及多次妊娠的稀有血型患者血型鑒定困難和交叉配血不合的重要影響因素。因此，探討不同區(qū)域不同種族人群稀有血型的基因分布特征，建立稀有血型資料庫(kù)，是解決稀有血型患者輸血安全的有效途徑和精準(zhǔn)輸血治療的重要方向。本文采用PCR-SSP 方法對(duì) 海 南 黎 族 人 群 的Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 5 個(gè)稀有血型系統(tǒng)的抗原基因進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行多態(tài)性分析，以期為本地區(qū)稀有血型庫(kù)的建立奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

共收集血樣300 份，均為海南黎族人群，其中男女比例180∶120，年齡18～60 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：選擇海南省瓊中縣黎母山地區(qū)黎族志愿者，三代以內(nèi)為海南本地黎族人群、無(wú)血緣關(guān)系、身體健康未合并家族遺傳疾病及并發(fā)疾病。參與實(shí)驗(yàn)研究的人員均簽署了知情研究協(xié)議書(shū)，該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。對(duì)每位志愿者均采集EDTA 抗凝血5 mL，在離心力2 000g，4 000 r/min 的條件下，離心5 min,分離血漿和血細(xì)胞，將全部的血漿和血細(xì)胞于-20 ℃的冰箱保存。

1.2 試劑和儀器

血型基因檢測(cè)試劑盒涵蓋Scianna、Colton、Kell、MNS、Lutheran、Dombrock、Kidd、Diego、Duffy、Knops、Indian、Vel、Vt 13 個(gè)血型系統(tǒng)31 個(gè)紅細(xì)胞血型抗原（江蘇中濟(jì)萬(wàn)泰生物醫(yī)藥公司），檢測(cè)的等位基因與對(duì)應(yīng)SNP 見(jiàn)表1，等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表2；核酸提取純化試劑盒和BioReady rTaq 聚合酶（杭州博日公司）；瓊脂糖（生興生物公司）；10X TBE 緩沖液和RealBand DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker（上海生工公司）。核酸純化儀（Qiagen 公司，QIAcube），PCR 擴(kuò)增儀（黑馬醫(yī)學(xué)器械公司，HEMA9600），離心機(jī)（黑馬醫(yī)學(xué)器械公司，14D），凝膠成像系統(tǒng)（黑馬醫(yī)學(xué)器械公司，UV-3C），電泳儀（一六公司，DY-16）。

表1 試劑盒檢測(cè)的等位基因及對(duì)應(yīng)SNPTab 1 Alleles and corresponding SNP detected by the kit

表2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度與對(duì)應(yīng)的等位基因Tab 2 PCR product lengths and corresponding alleles

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA 提取 依據(jù)說(shuō)明書(shū)（核酸提取純化試劑盒）進(jìn)行血樣本DNA 的提取，隨后測(cè)定DNA的純度和濃度，并調(diào)整其濃度值為30～50 ng/L，OD260/280 比值為1.8～2.0，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR 擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系中：引物混合物7 μL，0.3～0.5 U 的Taq 酶1 μL，1 μLDNA 樣品，總 體積共9 μL。95 ℃5 min 后，PCR 擴(kuò) 增 程 序 按 以 下：95 ℃3 s；60 ℃30 s；72 ℃90 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，隨后延長(zhǎng)5 min（72 ℃條件下），4 ℃進(jìn)行保存。

1.3.3 PCR 產(chǎn) 物 電 泳 將0.5×TBE 溶 液1 μL 與5 μL 的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行充分混合均勻以后，添加至濃度為2.5%的瓊脂糖凝膠孔內(nèi)，在電壓為100 V，時(shí)間為45 min 的條件下進(jìn)行電泳，待電泳完成后拍攝電泳圖并保存。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 2 個(gè)對(duì)偶抗原引物在不同的PCR 反應(yīng)管中，若是條帶為2 條，說(shuō)明雜合子，若是1 條，說(shuō)明純合子，若是未形成擴(kuò)增物，則說(shuō)明是實(shí)驗(yàn)失敗，需要重復(fù)性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)凝膠電泳條帶的長(zhǎng)度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)指定受檢樣本的基因型Duffy、Kidd、Diego、Dombrock、Lutheran 5 個(gè)血型系統(tǒng)基因型分別為Fya+b-，Jka+b+，Dia-b+，Doa-b+，Lua-b+，Aua+b+。見(jiàn)圖1。

圖1 1 例海南黎族志愿者13 個(gè)血型系統(tǒng)等位基因PCR-SSP 分型圖Fig 1 Genotyping of thirteen rare blood group systems of a volunteer in Li ethnic group of Hainan Province by PCR-SSP

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

依據(jù)遺傳學(xué)基因計(jì)數(shù)方法對(duì)海南黎族人群的稀有血型基因頻率進(jìn)行計(jì)算，對(duì)基因表型的觀察值與期望值進(jìn)行Hardy-Weinberg 吻合度驗(yàn)證（P＞0.05）。通過(guò)χ2檢驗(yàn)分析海南黎族與其他不同區(qū)域民族的Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 5 個(gè)血型系統(tǒng)的基因頻率分布的差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。依據(jù)公式MP=2ab(1-ab)[2]計(jì)算等位基因的不配合率（MP),a,b 分別代表等位基因a和b 的頻率。

2 結(jié)果

2.1 海 南 黎 族 人 群Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 血型系統(tǒng)的等位基因頻率

海 南 黎 族 人 群Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 血型系統(tǒng)的等位基因頻率分別為：Fya=0.958 3、Fyb=0.041 7；Aua=0.835 0、Aub=0.165 0；Jka=0.450 0、Jkb=0.550 0；Dia=0.066 7、Dib=0.933 3；Doa=0.101 7、Dob=0.898 3。Fya/Fyb、Aua/Aub、Jka/Jkb、Dia/Dib、Doa/Dob對(duì) 偶 抗 原 的 不 配 合 率 分 別 為：7.67%、23.76%、37.25%、11.67%、16.60%。通過(guò)x2檢驗(yàn)比較基因表現(xiàn)型的觀察值和期望值，結(jié)果顯示Duffy、Lutheran、Diego、Dombrock 血 型 系 統(tǒng) 符 合Hardy-Weinberg 遺傳法則（P＞0.05），Kidd 血型系統(tǒng)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 海南黎族Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 血型系統(tǒng)等位基因頻率分布（n=300）Tab 3 Allele frequency distribution of Duffy，Lutheran，Kidd，Diego and Dombrock blood group systems of Li ethnic group of Hainan Province（n=300）

2.2 海 南 黎 族Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 血型系統(tǒng)等位基因頻率與我國(guó)其他地區(qū)不同民族比較

在Duffy 血型系統(tǒng)中，海南黎族人群Fya基因頻率（Fya=0.958 3）與新疆回族（0.872 7）、新疆維吾爾族（0.699 4）、新疆哈薩克族（0.757 6）、運(yùn)城漢族（0.896 7）、西安漢族（0.896 7）［5-7，11，15］相比明顯增高；Fyb基因頻率為0.041 7，顯著低于上述幾個(gè)民族的數(shù)據(jù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與西藏藏族、四川彝族、岳陽(yáng)漢族、成都漢族、大連漢族、廣西壯族和云南傣族［8-10，12-14］的Fya/Fyb基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 海南黎族與我國(guó)其他地區(qū)不同民族的Duffy 血型等位基因頻率分布比較Tab 4 Comparison of Duffy blood group allele frequency distribution between Li ethnic group of Hainan Province and other ethnic groups in China

海南黎族人群的Lutheran 血型系統(tǒng)Aua基因頻率Aua=0.835 0 明顯低于新疆回族（0.909 1）、西藏藏族（0.910 8）、成都漢族（0.893 1）［5，8，10］，Aub基因頻率為0.165 0，高于新疆回族、西藏藏族、成都漢族的數(shù)據(jù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與其他民族［5，6］的Aua/Aub基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

表5 海南黎族與我國(guó)其他地區(qū)不同民族的Lutheran 血型系統(tǒng)等位基因頻率分布比較Tab 5 Comparison of Lutheran blood group allele frequency distribution between Li ethnic group of Hainan Province and other ethnic groups in China

在Kidd 血型系統(tǒng)中，海南黎族人群Jka基因頻率（Jka=0.450 0）明顯低于西藏藏族（0.551 3）和哈爾濱滿族（0.565 0）［8，16］；Jkb基因頻率為0.550 0，高于西藏藏族和哈爾濱滿族的數(shù)據(jù)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相對(duì)于其他民族［5-10，17］的Jka/Jkb基因頻率，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表6。

表6 海南黎族與我國(guó)其他地區(qū)不同民族的Kidd 血型系統(tǒng)等位基因頻率分布比較Tab 6 Comparison of Kidd blood group allele frequency distribution between Li ethnic group of Hainan Province and other ethnic groups in China

在Diego 血型系統(tǒng)中，海南黎族人群Dia基因頻率：Dia=0.066 7 明顯高于新疆回族（0.015 9）、西藏藏 族（0.034 2）、四 川 彝 族（0.016 7）、岳 陽(yáng) 漢 族（0.498 3）［3，5，8，9］；Dib基因頻率為0.933 3，顯著低于新疆回族、西藏藏族、四川彝族和岳陽(yáng)漢族，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與其他民族［6，7，10，16］的Dia/Dib基因頻率比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表7。

表7 海南黎族與我國(guó)其他地區(qū)不同民族的Diego 血型系統(tǒng)等位基因頻率分布比較Tab 7 Comparison of Diego blood group allele frequency distribution between Li ethnic group of Hainan Province and other ethnic groups in China

在Dombrock 血型系統(tǒng)中，海南黎族人群Doa基因頻率（Doa=0.101 7）與新疆維吾爾族（0.234 2）、新疆哈薩克族（0.221 9）［6，7］比較，有顯著性差異，Dob基因頻率為0.898 3，高于新疆維吾爾族和新疆哈薩克族的數(shù)據(jù)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與新疆回族、西藏藏族、四川彝族、岳陽(yáng)漢族、成都漢族、廣西壯族、哈爾濱滿族［3，5-10，13，16］的Doa/Dob基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表8。

表8 海南黎族與我國(guó)其他地區(qū)不同民族的Dombrock 血型系統(tǒng)等位基因頻率分布比較Tab 8 Comparison of Dombrock blood group allele frequency distribution between Li ethnic group of Hainan Province and other ethnic groups in China

3 討論

人類(lèi)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)抗原的種類(lèi)和數(shù)量繁多，但是每個(gè)人紅細(xì)胞上表達(dá)的血型抗原不盡相同。目前臨床上關(guān)注的輸血原則是ABO、Rh（D）血型抗原配合性輸注，而對(duì)Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 血型系統(tǒng)的抗原未進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，這對(duì)首次輸血的患者可能影響不大，但對(duì)于反復(fù)輸血或者長(zhǎng)期依賴輸血的患者具有較大影響。血型抗原的不配合輸注容易刺激機(jī)體產(chǎn)生同種免疫、不規(guī)則抗體。臨床進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)的同種抗體不僅包含Rh 血型系統(tǒng)抗體，還可能存在Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 等 血 型 系 統(tǒng) 的 不規(guī)則抗體，這些抗體可能以單一抗體或者聯(lián)合幾種抗體的形式出現(xiàn)，可引起血型鑒定困難、交叉配血不合或者輸血后引起免疫性溶血反應(yīng)［18］。因此，了解不同民族人群Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 血型系統(tǒng)等位基因分布的差異，建立稀有血型數(shù)據(jù)庫(kù)，有利于在短時(shí)間內(nèi)尋找到與稀有血型患者相合適的血液，對(duì)臨床輸血安全具有重要的意義。

本研究顯示，在海南黎族人群中，Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 5 個(gè)血型的等位基因頻率分布呈現(xiàn)多態(tài)性的特征與文獻(xiàn)［2］的報(bào)道結(jié)果相似，其 對(duì) 偶 抗 原Fya/Fyb、Aua/Aub、Jka/Jkb、Dia/Dib、Doa/Dob的不配合率比較高。理論上抗原不配合率越高，在隨機(jī)輸血及妊娠等免疫過(guò)程中刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫性不規(guī)則抗體的概率就越高，從而增加反復(fù)輸血患者及多次妊娠者的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致免疫性溶血反應(yīng)發(fā)生率的增加，影響臨床輸血治療的效果。因此，臨床上應(yīng)重視ABO 和Rh 血型系統(tǒng)以外的血型抗原的配合性輸血，提高患者的輸血療效。

本研究顯示，海南黎族人群的Duffy、Lutheran、Diego、Dombrock 血型系統(tǒng)基因型頻率分布的觀察值和期望值符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡法則（P＞0.05）；Kidd 血型系統(tǒng)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這可能是由于海南黎族人群長(zhǎng)期的居住環(huán)境及婚俗等因素的影響，血型基因發(fā)生遺傳改變，使Kidd 血型具有獨(dú)特的分布特征，該結(jié)果對(duì)臨床用血安全的研究具有重要價(jià)值。

本研究顯示，在Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 5 個(gè)血型系統(tǒng)中，海南黎族人群的等位基因分布對(duì)比我國(guó)其他區(qū)域不同人群的數(shù)據(jù)差異顯著。海南黎族的Fya和Fyb基因頻率相對(duì)于新疆哈薩克族、運(yùn)城漢族、新疆維吾爾族和回族、西安漢族［5-7，11，15］的數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與西藏藏族、四川彝族、岳陽(yáng)漢族、成都漢族、大連漢族、廣西壯族和云南傣族［3，8-10，12-14］的數(shù)據(jù)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。海南黎族的Aua和Aub基因 頻 率 與 新 疆 回 族、西 藏 藏 族、成 都 漢 族［5，8，10］的 數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與新疆的維吾爾族和哈薩克族［5，6］的數(shù)據(jù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。海南黎族的Jka和Jkb基因頻率與西藏藏族、哈爾濱滿族［8，16］比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相對(duì)于四川彝族、新疆的哈薩克族、岳陽(yáng)漢族、新疆維吾爾族、成都漢族、新疆回族、河北漢族［3，5-10，17］的數(shù)據(jù)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。海南黎族的Dia和Dib基因頻率與新疆回族、西藏藏族、四川彝族、岳陽(yáng)漢族比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相對(duì)于新疆的維吾爾族及哈薩克族、成都漢族、哈爾濱滿族［6，7，10，16］的數(shù)據(jù)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。海南黎族的Doa和Dob基因頻率與新疆的維吾爾族和哈薩克族［6，7］比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與新疆回族、西藏藏族、四川彝族、岳陽(yáng)漢 族、成 都 漢 族、廣 西 壯 族、哈 爾 濱 滿 族［3，5-10，13，16］比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？梢?jiàn)，海南黎族人 群 的Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 稀有血型基因的遺傳及分布具有民族的特征，這可能與海南黎族人群多數(shù)居住在比較偏遠(yuǎn)的地區(qū)，相對(duì)比較封閉，特別是受居住環(huán)境、當(dāng)?shù)仫L(fēng)俗及族內(nèi)通婚等因素的影響有關(guān)，也進(jìn)一步說(shuō)明血型抗原基因分布的差異具有地域性和民族特異性［19，20］。

隨著海南自由貿(mào)易港建設(shè)的深入，來(lái)自全世界不同民族的人群日益增多，未來(lái)海南的醫(yī)療機(jī)構(gòu)將面臨著多種稀有血型系統(tǒng)患者的臨床用血需求。由于不同區(qū)域和民族人群的紅細(xì)胞稀有血型抗原基因的分布各不相同，因此，建立獻(xiàn)血者稀有血型庫(kù)對(duì)自由貿(mào)易港環(huán)境下醫(yī)療機(jī)構(gòu)患者的臨床輸血安全至關(guān)重要，能夠幫助稀有血型患者快速尋找到相匹配的血液［21］。另外，最大程度地降低臨床患者免疫性輸血反應(yīng)的發(fā)生率及科學(xué)、合理、有效輸血是精準(zhǔn)輸血的重要方向和輸血技術(shù)發(fā)展的要求［22］。目前我省稀有血型獻(xiàn)血者資料庫(kù)主要是以Rh（D）抗原陰性的資料為主，其他的稀有血型資料庫(kù)有待于進(jìn)一步完善。海南黎族人群Duffy、Lutheran、Kidd、Diego、Dombrock 血型系統(tǒng)等位基因獨(dú)特的分布特征有助于對(duì)稀有血型等位基因遺傳背景的研究，為海南多種稀有血型數(shù)據(jù)庫(kù)的建立提供參考數(shù)據(jù)，可提供海南黎族的數(shù)據(jù)于國(guó)家數(shù)據(jù)庫(kù)。由于本研究采集的黎族人群樣本量不是很大，后續(xù)的研究可擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步篩查多個(gè)稀有血型系統(tǒng)的抗原基因，通過(guò)大樣本數(shù)據(jù)對(duì)其血型基因位點(diǎn)及基因突變情況進(jìn)行分析，有助于建立更加完善的稀有血型數(shù)據(jù)庫(kù)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明

符小玲：負(fù)責(zé)構(gòu)思文章的內(nèi)容和擬寫(xiě)、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及研究結(jié)果的解釋?zhuān)徊膛d權(quán)：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施與可行性分析，對(duì)文章整體進(jìn)行監(jiān)督管理；夏蘭：負(fù)責(zé)樣本的采集及數(shù)據(jù)收集和整理。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。