袁學軍，吳 翼，趙潤江，王小妹，江萌萌 ，洪 柳

(1.海南熱帶海洋學院 民族學院，海南 三亞 572000；2.中國熱帶農業(yè)科學院椰子研究所，海南 文昌 571399)

0 引言

據(jù)《中國靈芝圖鑒》記載[1]，中國已知野生靈芝分4 屬，103種，其中海南分布的靈芝有72 種，約占全國靈芝總種數(shù)的70%。有藥用價值的靈芝達15種，其中11 種已被利用并報道[2]。目前，國內外學者已經(jīng)對藥用靈芝中的活性成分進行較多研究，例如靈芝活性蛋白[3]、靈芝多糖[4]、靈芝三萜[5]和靈芝酸[6]，但對靈芝品種的選育和改良研究則較少[7-8]。靈芝菌絲生長的溫度范圍為25～35 ℃，最適溫度為24～28 ℃，超過36 ℃菌絲停止生長。本試驗研究微波和紫外線誘導對菌絲生長的影響，選育出耐熱靈芝品種。同時為食用菌耐熱品種篩選方法提供依據(jù)。

紫外線誘變技術是人類最早使用的誘變育種技術之一，核酸紫外線最大的吸收峰在260 nm，因此，波長為260 nm的紫外線誘變最有效[9]。當紫外線被吸收后，會引起DNA分子突變，甚至可以使正常的DNA分子顛換、移碼突變、轉換、缺失等，對DNA分子造成不可逆轉的改變[10]。劉瑛穎[11]用紫外線照射豬苓菌絲后，菌絲的生長速率發(fā)生改變，照射7 min時產(chǎn)生的變異菌株U1-7生長速率最快；陳力力等[12]67用頻率為2 540 MHz的微波爐，處理菌種80 s，獲得優(yōu)勢突變株W8011，連續(xù)8代遺傳性能穩(wěn)定，并比較了紫外線、微波單因子對金針菇J05Y-c單細胞懸液的誘變效應，微波誘變的正突變率大于紫外誘變的正突變率，分別為85.0%和76.7%。因此，紫外線和微波照射對食用菌誘變育種是有效的。

1 材料與方法

1.1材料

靈芝菌種由海南省林業(yè)科學研究院提供：海南靈芝(Ganodermahainanense)、臺灣靈芝(Ganodermaformosanum)、四川靈芝(Ganodermasichuanense)、靈芝(Ganodermalucidum)。

1.2方法

1.2.1微波誘導

靈芝菌種接種到帶有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑8 cm)中，25 ℃培養(yǎng)24 h，分別放入微波爐(微波頻率2 450 MHz，波長122 mm)處理0 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 s，微波0 s處理設為對照，然后在恒溫培養(yǎng)箱中分別在不同溫度(39 ℃、40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃)下進行培養(yǎng)，每個處理設置3個平行樣，培養(yǎng)第8天測量菌絲半徑，計算其生長速度，單位為cm · d-1，分析微波對靈芝菌絲生長速度和誘導耐熱品種的影響。

1.2.2紫外線誘導

靈芝菌種接種到帶有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑8 cm)中，25 ℃培養(yǎng)24 h，分別進行紫外線照射(超凈工作臺中的紫外線燈管單只，紫外線波長253.7 nm，培養(yǎng)皿放置在燈管正下方，燈管與培養(yǎng)皿的距離為47 cm)0 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min，紫外線照射0 min設為對照，然后在恒溫培養(yǎng)箱中分別在不同溫度(38 ℃、39 ℃、40 ℃、41 ℃)下進行培養(yǎng)，每個處理設置3個平行樣，培養(yǎng)第8天測量菌絲半徑，計算其生長速度，單位為cm·d-1，分析紫外線對靈芝菌絲生長速度和誘導耐熱品種的影響。

1.2.3 DNA的提取和PCR擴增

DNA的提取步驟如下：

步驟1：DNA的提取按照試劑盒提取DNA的方法，取適量菌絲放置于2 mL離心管中，并加入鋼珠壓在樣品上方，然后加入400 μL緩沖液和6 μL的RNaseA(10 mg·mL-1)，漩渦震蕩1 min，室溫放置10 min。

步驟2：加入130 μL緩沖液FP，充分混勻，漩渦震蕩1 min。

步驟3：12 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉移至新的離心管中。

步驟4：重復步驟3一次。

步驟5：取500 μL的上清液，加入0.7 μL的異丙醇，充分混勻，此時會出現(xiàn)絮狀基因組DNA，12 000 r·min-1離心2 min，棄上清，保留沉淀。

步驟6：加入600 μL 70%的乙醇，漩渦震蕩5 s，12 000 r·min-1離心2 min，棄上清。

步驟7：重復步驟5一次；開蓋倒置，室溫5～10 min徹底晾干乙醇。

步驟8：加入適量洗脫緩沖液TE，65 ℃水浴10～60 min溶解DNA，其間數(shù)次顛倒助溶，最終得到DNA溶液。

靈芝與雙孢菇親緣關系較近，雙孢菇耐熱基因及對應引物已克隆[13]，參考其引物，靈芝全長基因PCR擴增所用的特異引物根據(jù)基因兩端的序列設計。

5′端引物為028-1F：5′-TCTTCACGTGCTGCCACCAA-3′，

3′端引物為028-1R：5′-TTTTTTTTTTAAAAGGCCCA-3′。

以上引物均由上海生工生物工程公司合成。

PCR擴增以上述提取的DNA為模板,用基因兩端特異引物028-1F和028-1R進行PCR擴增，退火溫度52 ℃。PCR結束后，在135 V的電壓下進行30 min的凝膠電泳以確定擴增條帶。

1.2.4統(tǒng)計分析

采用南京農業(yè)大學王韶華教授發(fā)明的stst軟件進行統(tǒng)計分析。

2.結果與分析

2.1 微波和溫度共同作用對臺灣靈芝生長速度的影響

微波和溫度共同作用對臺灣靈芝生長速度的影響見表1。隨著微波誘導時間的增長和溫度的升高，菌絲生長速度變慢，微波處理40 s的菌絲停止生長的溫度為43 ℃，其他所有處理的停止生長的溫度均為42 ℃。因此，微波處理40 s的效果最佳，能提高菌絲的耐熱性；微波處理60 s時,所有處理的菌絲全部死亡，可能是隨著微波誘導時間的增長，溫度越來越高的原因。對照菌絲停止生長的溫度為42 ℃，根據(jù)擬合方程y=-0.132 5x+5.489 3的擬合結果為41.43 ℃。

表1 微波和溫度共同作用對臺灣靈芝生長速度的影響

2.2 微波和溫度共同作用對海南靈芝、四川靈芝生長速度的影響

微波和溫度共同作用對海南靈芝生長速度的影響見表2。隨著微波處理時間的增長和溫度的升高，菌絲生長速度變慢，微波處理60 s的菌絲停止生長的溫度為44 ℃，而對照和其他處理的停止生長的溫度均為43 ℃。因此，微波處理60 s效果最佳，菌絲停止生長的溫度最高。微波處理70 s時，菌絲全部死亡。對照菌絲停止生長的溫度為43 ℃，根據(jù)擬合方程y=-0.097 5x+4.19的擬合結果為42.97 ℃。

表2 微波和溫度共同作用對海南靈芝生長速度的影響

四川靈芝、靈芝微波誘導和對照菌絲停止生長溫度均為40 ℃，微波誘導對其菌絲停止生長的溫度沒有影響。但在微波作用下臺灣靈芝和海南靈芝的耐熱性顯著提高，說明微波對靈芝耐熱性具有一定的誘導性。四川靈芝和靈芝微波誘導停止生長的溫度和對照相同(數(shù)據(jù)省略)。

2.3 紫外線和溫度組合對四川南靈芝生長速度的影響

紫外線和溫度組合對四川南靈芝生長速度的影響見表3。紫外線處理60 min，菌絲停止生長的溫度為41 ℃。隨著紫外線處理時間的延增長和溫度的升高，菌絲生長速度均呈下降趨勢。因此，紫外線處理60 min效果最佳，菌絲停止生長的溫度最高，可能分子結構發(fā)生變化。紫外線處理4 h，菌絲常溫25 ℃培養(yǎng)還沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。對照菌絲停止生長溫度為40 ℃，根據(jù)擬合方程y=-0.156x+6.177的擬合結果為39.59 ℃。

表3 紫外線和溫度共同作用對四川靈芝生長速度的影響

2.4 紫外線和溫度共同作用對靈芝、臺灣靈芝生長速度的影響

紫外線和溫度共同作用對靈芝生長速度的影響見表4。隨著紫外線處理時間的增長和溫度的升高，菌絲的生長速度逐漸變慢。紫外線處理60 min的菌絲停止生長溫度為41 ℃，而其他所有處理的停止生長溫度均為40 ℃，因此，紫外線處理60 min效果最好。對照菌絲停止生長溫度為40 ℃，根據(jù)擬合方程y=-0.156x+6.153 3的擬合結果為39.44 ℃。

紫外線處理后臺灣靈芝與對照菌絲的停止生長溫度相同，均為42 ℃，而海南靈芝均為43 ℃，由此可見，紫外線照射對這兩個品種耐熱性提高的效果不顯著。

表4 紫外線和溫度共同作用對靈芝生長速度的影響

2.5誘導耐熱靈芝品種分子鑒定

通過微波和紫外線誘導處理，本試驗誘導出4個耐熱品種，PCR結果如圖1所示。臺灣靈芝對照組和誘導組均有3個條帶，無差異；海南靈芝對照有1個條帶，而誘導的有3個條帶，比對照多2條；四川靈芝對照無條帶，而誘導的有3個條帶，比對照多3條；靈芝對照和誘導的均有3個條帶，無差異。因此，誘導的耐熱品種中臺灣靈芝和靈芝與對照在分子結構上相同，無差異；而海南靈芝誘導組比對照組多2個條帶，四川靈芝誘導組比對照組多3個條帶，誘導的和對照在分子水平上存在差異。誘導的海南靈芝菌絲停止生長溫度為43 ℃，誘導的四川靈芝停止生長的溫度為41 ℃。因此，通過分子鑒定，海南靈芝和四川靈芝各自的誘導組和對照組存在差異。

1.marker(分子量大小，DL2000);2.臺灣靈芝誘導組;3.臺灣靈芝對照組;4.海南靈芝誘導組;5.海南靈芝對照組;6.四川靈芝誘導組;7.四川靈芝對照組;8.靈芝誘導組;9.靈芝對照組。

3 結論

臺灣靈芝、海南靈芝、四川靈芝和靈芝的菌絲停止生長的溫度分別為42 ℃、43 ℃、40 ℃、40 ℃，微波誘導后臺灣靈芝、海南靈芝的菌絲停止生長的溫度分別為43 ℃、44 ℃，紫外線誘導后四川靈芝和靈芝的菌絲停止生長的溫度都為41 ℃，這說明微波和紫外線誘導對靈芝的耐熱性有一定的影響。微波爐在發(fā)出微波的同時伴隨著溫度的升高，因此微波誘變可能是微波和溫度共同作用的結果；紫外線具有殺菌的作用，一般情況下，紫外線殺菌僅用30 min細菌即可死亡，但靈芝菌絲在紫外線照射4 h后還能生長，因此，此現(xiàn)象還需繼續(xù)研究。

本試驗通過紫外線和微波誘導出靈芝的耐熱品種，其結果與陳力力等[12]69采用微波和紫外線誘導出新菌株結果一致。雙孢菇耐熱基因的引物在靈芝中的應用有明顯的效果。因此，雙孢菇的耐熱基因也可能在其他食用菌上試用。同時，誘導的突變體只有表觀指標和分子水平均存在差異，才能成為真正的突變體，才能遺傳。