秦錦濤，王亮，曹羽杰，賴玉婷，鄭欽華，林翰，黃卓欣，楊東生，王蘭英

（珠?？萍紝W(xué)院藥學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院，廣東 珠海 519041）

樺褐孔菌（Phaeoporus obliquus）又稱白樺茸、斜管纖孔菌、褐多孔菌[1]，具有良好藥用價值。白樺茸在我國主要分布于東北地區(qū)，國外多分布于俄羅斯遠(yuǎn)東等地，其次在朝鮮北部、日本北海道等地區(qū)也有一定的分布[2]。白樺茸在世界上享有“西伯利亞靈芝”的盛名，其成熟的子實體顏色呈現(xiàn)出深栗色或黃褐色或炭黑色，通常生長于樺樹樹皮的破損處，子實體外形多數(shù)為類球形或不規(guī)則的塊狀，質(zhì)地堅硬而無菌柄[3]。白樺茸具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗過敏、增強(qiáng)免疫能力、降血糖或血脂以及保肝護(hù)肝作用，被廣泛地用于胃部癌癥、胃潰瘍、胃炎等疾病的治療，具有較高的應(yīng)用價值[4-9]。目前已明確的白樺茸化學(xué)成分具有200余種，其中具有主要生物學(xué)活性的成分為多糖類物質(zhì)、萜類物質(zhì)等[10-11]。隨著藥用真菌被不斷深入地研究與開發(fā)，白樺茸逐漸成為當(dāng)下的研究熱點，基于其抗癌功效，現(xiàn)階段大部分研究主要集中于白樺茸培養(yǎng)條件的優(yōu)化，以及白樺茸生物活性物質(zhì)作用機(jī)制的研究，而對于培養(yǎng)過程中菌絲生物學(xué)特性及活性物質(zhì)含量變化的相關(guān)研究較為少見。本研究以不同碳源作為自變量，通過平板培養(yǎng)，得出不同碳源對白樺茸菌絲生長速度的影響，以及不同碳源對白樺茸菌落的生長狀態(tài)以及顯微結(jié)構(gòu)的影響；以液體培養(yǎng)的方式，擬得出碳源對菌絲生物量及活性物質(zhì)含量變化的影響，為白樺茸的人工培養(yǎng)及進(jìn)一步的深入研究與相關(guān)開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種

白樺茸菌株（菌種編號：JZ-2#）：珠?？萍紝W(xué)院藥學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院實驗教學(xué)中心210實驗室提供。

1.1.2 試驗試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）（純度＞97%）、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%）：北京酷爾化學(xué)科技有限公司；無水乙醇（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；苯酚（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；甘露醇、果糖、乳糖（均為生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；麥芽糖（生化試劑）、七水硫酸鎂（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖（分析純）、蔗糖（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、瓊脂粉（生化試劑）、氯化鈣（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；酵母浸粉lp0021（生化試劑）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；細(xì)菌學(xué)蛋白胨（生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；可溶性淀粉（分析純）：天津市百世化工有限公司；維生素B1（食品級）：河南萬邦實業(yè)有限公司；紅薯淀粉（食品級）：山東廚禾食品有限公司；玉米面粉、玉米淀粉、馬鈴薯（均為食品級）：市售。

1.1.3 儀器與設(shè)備

潔凈工作臺（VS-1300L-U）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；光學(xué)顯微鏡（XS-218）：江南光電（集團(tuán)）股份有限公司；數(shù)顯式恒溫水浴鍋（HH-S4）：金壇市朗博儀器制造有限公司；防爆冰箱（KRC180）：優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司；立式雙層氣浴恒溫?fù)u床（SKY-2112B）：上海蘇坤實業(yè)有限公司；電子天平（AR224CN）：美國奧豪斯儀器（上海）有限公司；干燥箱（GZX-9240MBE）：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-2450）：日本島津公司；高速離心機(jī)（1580R）：中國香港 Gene公司；酶標(biāo)儀（Epoch）：美國Bio Tek InstrumentsInc公司。

1.1.4 培養(yǎng)基配方

1.1.4.1 母種固體培養(yǎng)基

酵母浸粉1 g、葡萄糖3 g、瓊脂粉2 g、馬鈴薯20 g，去離子水補(bǔ)足100 mL，pH自然[12]。

1.1.4.2 母種液體培養(yǎng)基

酵母浸粉1 g、葡萄糖2 g、維生素B10.01 g、蛋白胨1 g、磷酸二氫鉀 0.025 g、七水硫酸鎂0.025 g，去離子水補(bǔ)足100 mL，pH自然。

1.1.4.3 不同碳源液體發(fā)酵培養(yǎng)基

碳源6 g、酵母浸粉0.12 g、蛋白胨0.3 g、磷酸二氫鉀0.1 g、七水硫酸鎂0.02 g、維生素B10.01 g、氯化鈣0.05 g，去離子水補(bǔ)足 100 mL，pH 自然[13]。

10種碳源分別為乳糖、甘露醇、麥芽糖、紅薯淀粉、玉米淀粉、玉米面粉、果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉。

1.1.4.4 不同碳源固體培養(yǎng)基

按照1.1.4.3方法配制成100 mL液體培養(yǎng)基，加瓊脂粉4.8 g，加熱溶解，pH自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種制備

1.2.1.1 平板菌種制備

取恢復(fù)至室溫26℃的白樺茸試管菌種，無菌操作，取0.5 cm2菌塊接種到母種固體培養(yǎng)基中，25℃避光恒溫培養(yǎng)10 d。

1.2.1.2 液體菌種制備

將配制的母種液體培養(yǎng)基分裝200 mL/500 mL錐形瓶，121℃下滅菌20 min后，冷卻至室溫26℃。取5塊0.5 cm2活化后的固體平板菌種，接種至液體培養(yǎng)基中。搖床25℃、150 r/min培養(yǎng)10 d。

1.2.2 不同碳源條件下菌絲生長速度的測定

按照不同碳源固體培養(yǎng)基的配制方法，配制固體培養(yǎng)基。每個配方3個平板。選用0.8 cm平板打孔器，在平板母種上打出均勻的菌塊，之后用接種針挑菌塊至不同碳源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：25℃避光培養(yǎng)13 d。接種3 d后分別用直尺對所有平板的菌落進(jìn)行測定，之后隔天測定1次，每個平板測定垂直兩條線上的菌落直徑，記錄、統(tǒng)計并分析結(jié)果。根據(jù)下列公式計算菌絲生長速度[14]。

1.2.3 不同碳源條件下菌落生長狀態(tài)及菌絲顯微結(jié)構(gòu)觀察

1.2.3.1 宏觀形態(tài)學(xué)鑒定

取1.2.2中培養(yǎng)13 d的平板進(jìn)行菌絲體觀察，比較菌落大小及顏色、菌絲密度、是否蓬松、是否有明顯的同心紋，并進(jìn)行記錄[14-15]。

1.2.3.2 微觀形態(tài)學(xué)鑒定

制作菌絲爬片：采用不同碳源的固體培養(yǎng)基進(jìn)行接種，在距接種點2 cm左右的培養(yǎng)基上圍繞菌塊，以40°～45°斜插入4片無菌的蓋玻片，25℃避光培養(yǎng)。待菌絲體長滿蓋玻片一半左右時，夾取蓋玻片，顯微鏡下觀察菌絲[16-17]。

1.2.4 不同碳源條件下液體發(fā)酵菌絲生物量的測定

按1.1.4.3配方配制液體培養(yǎng)基，121℃下滅菌20 min，冷卻至室溫26℃，無菌轉(zhuǎn)接10%的液體菌種。將接種好的培養(yǎng)瓶置于25℃的搖床，150 r/min回旋培養(yǎng)13 d。培養(yǎng)期間進(jìn)行6次取樣，每2 d取樣1次，每次隨機(jī)取出3瓶菌，13 d后全部取樣。取樣時，采用布氏漏斗抽濾法分離菌絲及菌液，用蒸餾水沖洗菌絲2次后，收集菌絲，置于50℃烘箱中烘干至恒重，稱質(zhì)量并保存。

1.2.5 菌絲多糖的提取

取烘干的白樺茸菌絲于研缽內(nèi)研磨，過40目篩網(wǎng)，按料液比1∶100（g/mL）加入去離子水，85℃恒溫浸提4 h，提取液10 000 r/min離心15 min，取0.6 mL上清液定容至10 mL，即得到多糖待測溶液。

1.2.6 多糖含量測定

采用苯酚硫酸法測定菌絲多糖含量。取0.005 g無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，去離子水定容至50 mL配制成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取 2、3、4、5、6、7 mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，去離子水定容并搖勻。分別從6個10 mL容量瓶中各取1 mL液體于試管中，加入0.5 mL、6%苯酚后，迅速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min，40℃水浴15 min，冷卻至室溫26℃，測定反應(yīng)液A490，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[12，18]。回歸方程為y=10.773x-0.004，R2=0.999 4。

取1 mL待測樣品溶液，按照上述方法加入苯酚與濃硫酸，測定反應(yīng)液A490，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程計算多糖含量。

1.2.7 多糖水提液抗氧化活性的測定

采用DPPH自由基清除法測定多糖水提液抗氧化活性。取1.2.5多糖水提液與無水乙醇按體積比1∶1混合，避光反應(yīng)30 min，移液槍吸取0.3 mL混合液至96孔板中，各3個復(fù)孔。測定反應(yīng)液A517，吸光度記為A1；取樣品提取液與0.2 mmol/L DPPH按體積比1∶1混合，避光反應(yīng)30 min，移液槍吸取0.3 mL混合液至96孔板中，各3個復(fù)孔。測定反應(yīng)液A517，吸光度記為A2；取無水乙醇與DPPH按體積比1∶1混合，避光反應(yīng)30 min，移液槍吸取0.3 mL混合液至96孔板中，各3個復(fù)孔。測定反應(yīng)液A517，吸光度記為AD[19-20]。根據(jù)下列公式計算DPPH自由基清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0軟件對結(jié)果進(jìn)行分析處理，試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對白樺茸菌絲生長速度的影響

不同碳源條件下菌絲平板生長直徑變化見圖1。

圖1 不同碳源條件下菌絲平板生長直徑變化Fig.1 Variation of mycelial growth diameter under different carbon sources

由圖1可知，白樺茸在不同碳源的培養(yǎng)基上均可以生長。乳糖為唯一碳源時，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲生長最慢；與紅薯淀粉及玉米淀粉相比，可溶性淀粉中菌絲隨培養(yǎng)時間的延長，生長緩慢；以麥芽糖、蔗糖、果糖、甘露醇、玉米面粉、葡萄糖為碳源時，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落直徑增加明顯。

碳源對白樺茸菌絲生長的影響見表1。

表1 碳源對白樺茸菌絲生長的影響Table 1 Effects of carbon sources on mycelial growth of Inonotus obliquus

由表1可知，與麥芽糖相比，乳糖、玉米面粉、可溶性淀粉在全階段培養(yǎng)時間內(nèi)，白樺茸菌絲生長差異顯著（P＜0.05）。與乳糖相比，甘露醇、紅薯淀粉在全階段培養(yǎng)時間內(nèi)，白樺茸菌絲生長差異顯著（P＜0.05）。與麥芽糖相比，果糖在全階段培養(yǎng)時間內(nèi)，白樺茸菌絲生長差異不顯著（P＞0.05）。不同碳源菌絲平均生長速度大小順序為麥芽糖＞果糖=蔗糖＞甘露醇＞玉米面粉＞葡萄糖＞玉米淀粉＞紅薯淀粉＞可溶性淀粉＞乳糖。麥芽糖菌絲生長速度為0.302 cm/d，生長最快。蔗糖及果糖的菌絲生長速度較麥芽糖次之，為0.297 cm/d；乳糖最慢，為0.097 cm/d，這與王麗瑩等[21]的研究結(jié)果相近。

2.2 不同碳源對白樺茸菌落生長狀態(tài)及菌絲顯微結(jié)構(gòu)的影響

不同碳源固體培養(yǎng)條件下菌絲正面和生長情況見圖2和圖3，不同碳源條件下菌絲顯微觀察情況見圖4。

圖2 不同碳源條件下平板菌絲生長狀況（正面）Fig.2 Growth status of flat mycelium under different carbon sources（front）

圖3 不同碳源條件下平板菌絲生長狀況（背面）Fig.3 Growth status of flat mycelia under different carbon sources（back）

圖4 不同碳源條件下菌絲顯微觀察Fig.4 Microscopic observation of mycelium under different carbon sources

A.甘露醇 ；B.果糖；C.紅薯淀粉；D.可溶性淀粉；E.麥芽糖；F.葡萄糖；G.乳糖；H.玉米淀粉；I.玉米面粉；J.蔗糖 。

由圖2～圖4可知，麥芽糖、果糖、蔗糖的菌絲生長最快，其中麥芽糖菌落生長最致密，表面呈現(xiàn)羊毛氈狀，接種中心有明顯的氣生菌絲，周圍環(huán)繞有黃褐色菌絲，且菌絲有分支，菌落背面有一定的褐化。乳糖菌落最小，且菌絲生長較稀疏，多為氣生菌絲，菌絲中有少量淡黃色色素沉積，菌絲纖細(xì)有分支，菌落背面褐化重?？傮w來說，菌落的差異主要體現(xiàn)在菌絲褐化程度、菌絲生長速度、菌絲顏色、菌絲密度等，而對于顯微狀態(tài)下的菌絲，其結(jié)構(gòu)差異不大。這與韓鵬等[22]的研究結(jié)果基本一致。

2.3 不同碳源對白樺茸菌絲生物量的影響

本試驗進(jìn)行了碳源的初篩小試發(fā)酵培養(yǎng)，通過統(tǒng)計其菌絲生物量的變化，并結(jié)合2.1菌絲生長速度的試驗數(shù)據(jù)，決定后期測定階段不對可溶性淀粉碳源培養(yǎng)得到的菌絲測定生物量、多糖含量以及DPPH自由基清除率進(jìn)行測定。

不同碳源條件下隨培養(yǎng)時間的延長，白樺茸菌絲液體發(fā)酵生物量測定結(jié)果見表2。

表2 碳源對白樺茸菌絲生物量的影響Table 2 Effects of carbon sources on mycelial biomass of Inonotus obliquus

由表2可知，與玉米面粉碳源相比，玉米淀粉、乳糖碳源在全階段培養(yǎng)時間內(nèi)，白樺茸菌絲生長差異顯著（P＜0.05）。與葡萄糖碳源相比，甘露醇、乳糖、玉米淀粉、紅薯淀粉碳源在全階段培養(yǎng)時間內(nèi)，白樺茸菌絲生長差異顯著（P＜0.05）。與紅薯淀粉碳源相比，玉米面粉、麥芽糖、果糖碳源在全階段培養(yǎng)時間內(nèi)，白樺茸菌絲生長差異顯著（P＜0.05）。麥芽糖與果糖碳源，乳糖與玉米淀粉碳源，在全階段培養(yǎng)時間內(nèi)菌絲生長差異不顯著（P＞0.05）。不同碳源菌絲全時段日均增長量大小順序為玉米面粉＞葡萄糖＞麥芽糖＞果糖＞蔗糖＞玉米淀粉＞乳糖＞甘露醇＞紅薯淀粉，其中玉米面粉菌絲生物量最大，分析認(rèn)為，可能是玉米面粉中氮源含量豐富，使菌絲生長迅速，其次是葡萄糖，由于葡萄糖是自然界分布最廣泛的單糖，其代謝非常容易，所以利于菌絲體的快速生長。而菌絲生物量較少的是乳糖和淀粉類碳源，分析認(rèn)為，乳糖屬于較難利用的糖，在菌體內(nèi)較難分解利用，所以造成菌絲生物量較低，對于淀粉類碳源，由于淀粉分子量較大，在分解應(yīng)用過程中也存在一定的困難，所以菌絲生物量不高。

2.4 不同碳源對白樺茸液體發(fā)酵菌絲多糖含量的影響

不同碳源條件下隨培養(yǎng)時間的延長，白樺茸菌絲多糖含量測定數(shù)據(jù)見表3。

表3 碳源對白樺茸多糖含量的影響Table 3 Effects of carbon sources on polysaccharide content of Inonotus obliquus

由表 3 可知，培養(yǎng)時間為 5、7、9、11、13 d 時，以葡萄糖為碳源的菌絲多糖含量與其它碳源菌絲多糖含量均差異顯著（P＜0.05）。進(jìn)一步對比發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖、乳糖、蔗糖為發(fā)酵碳源時，菌絲內(nèi)最終多糖積累量較高。葡萄糖為碳源，其菌絲多糖含量在11 d即達(dá)峰值，隨后出現(xiàn)下降，分析認(rèn)為，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲出現(xiàn)部分自溶現(xiàn)象，導(dǎo)致胞內(nèi)多糖含量下降，而以乳糖為碳源時，菌絲體內(nèi)多糖含量從第5天開始穩(wěn)步增加（后期仍增加），這可能是由于乳糖分解利用較慢，利于產(chǎn)物的積累。綜合分析得知，以葡萄糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)多糖效果最佳，培養(yǎng)11 d即可使多糖含量達(dá)到169.42 mg/g。這與毛慶蓮等[23]的研究結(jié)果一致。

2.5 不同碳源對白樺茸液體發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響

不同碳源條件下隨培養(yǎng)時間的延長，白樺茸菌絲多糖提取液抗氧化測定結(jié)果見表4。

表4 碳源對白樺茸多糖提取液DPPH自由基清除率的影響Table 4 Effects of carbon sources on DPPH free radical scavenging rates of Inonotus obliquus polysaccharide extract

由表 4 可知，當(dāng)培養(yǎng)時間為 5、7、9、11 d 時，各碳源均與葡萄糖的DPPH自由基清除率差異極顯著（P＜0.01）。當(dāng)培養(yǎng)時間為3 d時，除了玉米淀粉與葡萄糖的DPPH自由基清除率差異不顯著（P＞0.05），其余各碳源均與葡萄糖的DPPH自由基清除率差異極顯著（P＜0.01）。當(dāng)培養(yǎng)時間為13 d時，除了甘露醇和蔗糖與葡萄糖的DPPH自由基清除率差異不顯著（P＞0.05），其余各碳源均與葡萄糖的DPPH自由基清除率差異極顯著（P＜0.01）。此外，紅薯淀粉、玉米淀粉、麥芽糖為碳源時，菌絲水提液的DPPH自由基清除率也隨培養(yǎng)時間的延長而增加，在第13天均達(dá)到最大值，分別為74.21%、73.49%、76.21%。由此可見，較難分解利用的碳源有利于多糖產(chǎn)物活性的提高，這可能與胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有關(guān)，當(dāng)然也與菌絲分裂代謝較慢有一定聯(lián)系。

3 討論與結(jié)論

綜上，固體培養(yǎng)基以果糖、麥芽糖、蔗糖為唯一碳源時，菌絲生長促進(jìn)作用明顯，且蔗糖及果糖為唯一碳源添加時，有減緩菌絲褐變老化作用。玉米面粉、葡萄糖為碳源時菌絲生長粗壯，碳源為紅薯淀粉以及麥芽糖時，菌絲生長密度最高。液體培養(yǎng)條件下，碳源為玉米面粉時，其全時段菌絲日均增長量最高，其次是葡萄糖和麥芽糖及果糖等。當(dāng)葡萄糖充當(dāng)唯一的碳源添加時，菌球較大，菌球質(zhì)地較疏松，菌絲細(xì)長，利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝，是大規(guī)模液體發(fā)酵的首選碳源。雖然以玉米面粉為碳源，其全時段菌絲日均增長量最高，但是此時培養(yǎng)液較為濃稠，不利于大規(guī)模液體發(fā)酵培養(yǎng)，也不利于后續(xù)菌絲的收集和發(fā)酵液中活性物質(zhì)的提取純化。對于活性物質(zhì)收集，以葡萄糖為單一碳源進(jìn)行培養(yǎng)得到的菌絲體，其胞內(nèi)多糖在第11天含量最高，為最優(yōu)碳源，其可以保證多糖快速且大量產(chǎn)生。乳糖、麥芽糖為碳源時，培養(yǎng)得到的菌絲體提取液DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，若需要提升產(chǎn)物的抗氧化活性，可將葡萄糖碳源與乳糖碳源或麥芽糖碳源聯(lián)用，從而達(dá)到優(yōu)化產(chǎn)物的目的。本試驗對比了不同碳源時白樺茸菌絲生物學(xué)特性異同，并對菌絲體在不同碳源條件下活性物質(zhì)積累的差異和活性的不同做了相關(guān)的研究，這將為白樺茸液體發(fā)酵培養(yǎng)碳源的選擇提供一定的參照，同時也為白樺茸進(jìn)一步的深入研究提供參考。