徐蕾蕊，李 丹，汪 琦，馬 丹，魏詠新，魏海燕，趙曉娟，張西萌，曾 靜

（中國海關(guān)科學技術(shù)研究中心，北京 100026）

諾如病毒（norovirus，NoV）為正向單鏈RNA病毒，分為5 個基因型（GI～GV），大多數(shù)感染人類的NoV屬于GI型和GII型，引起腹瀉嘔吐等急性癥狀，嚴重可致死亡。NoV主要通過污染食品進行傳播，食品中含有微量NoV即可引起感染。因此需要建立科學、高效的食品中NoV檢測手段，控制NoV引起的疾病，保障人民健康。

數(shù)字聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)通過將反應(yīng)體系無限稀釋，可使PCR擴增的熒光信號由指數(shù)形式轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，檢測靈敏度提高到單分子水平。目前，微滴式數(shù)字PCR平臺中的逆轉(zhuǎn)錄微滴式聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction，RT-ddPCR）無需單獨進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，直接定量RNA，可作為食品中NoV定量檢測的有效技術(shù)手段。

食品中NoV定量需要病毒濃縮、核酸提取純化等前處理過程，但此過程中病毒回收率未知，故RT-ddPCR定量結(jié)果不等于食品中NoV實際載量。需要建立簡便操作性強的過程控制程序，指示NoV回收率，換算食品中NoV實際載量。MS2噬菌體是一種無包膜+ssRNA病毒，大小和結(jié)構(gòu)與NoV比較接近，可作為過程控制模式病毒添加到食品樣品中。

本研究擬以RT-ddPCR檢測體系為基礎(chǔ)，建立NoV定量檢測方法，探索MS2噬菌體的過程控制程序，構(gòu)建基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牡蠣、蘋果、羽葉生菜和草莓 市購。

GI、GII型NoV、星狀病毒（humanastrovirus，HastV）、甲肝病毒（hepatitis A virus，HAV）、輪狀病毒（rotavirus，RV）RNA，MS2噬菌體懸液（效價7.2×10PFU/mL），本實驗室保存；GI型NoV RNA標準物質(zhì)（特性值（5.4±1.2）×10拷貝/μL）和GII型NoV RNA標準物質(zhì)（特性值（5.9±1.2）×10拷貝/μL），本實驗室研制保存；GII型NoV陽性糞便樣品，由北京兒童醫(yī)院贈送。

焦碳酸二乙酯（diethyl paracanbonate，DEPC）處理水、蛋白酶K 天根生化科技（北京）有限公司；總RNA提取試劑Trizol、SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR system 美國英杰生命技術(shù)有限公司；無水乙醇、異丙醇、氯仿 國藥集團化學試劑北京有限公司；QIAamp Virial RNA Mini Kit 德國QIAGEN公司；Dynadbeads mRNA Purification Kit 美國Life Technology公司；One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes 美國伯樂公司。

熱循環(huán)儀、實時熒光PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；QX-200數(shù)字PCR系統(tǒng)、微滴生成儀 美國伯樂公司；微定量核酸蛋白分析儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 引物探針設(shè)計和篩選

根據(jù)NoV基因型分型保守區(qū)域：編碼RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）區(qū)域和開放閱讀框2（Open Reading Frame 2，ORF2）編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1區(qū)域，通過NCBI在線工具進行序列分析和比對，利用Prime Express軟件V4.0（ABI,Foster City,CA,USA）分別設(shè)計GI型和GII型NoV引物和探針；對于MS2噬菌體，選取Dreier等設(shè)計的引物和探針，通過NCBI在線工具BLAST進行序列分析和比對，確定目的片段同源性。分別取實驗室保存的GI、GII型NoV RNA和提取的MS2噬菌體RNA為模板，首先采用熒光PCR方法對設(shè)計的引物探針進行篩選和特異性驗證，再采用RT-ddPCR體系進一步驗證篩選的引物探針的特異性。反應(yīng)參數(shù)：熒光PCR：50 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，95 ℃熱啟動2 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火延伸1 min、40 個循環(huán)；RT-ddPCR：參照One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，60 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min，95 ℃熱啟動10 min，95 ℃變性30 s、60 ℃退火延伸1 min、40 個循環(huán)，98 ℃酶失活10 min，4 ℃保持，升降溫速率2～3 ℃/s。

1.2.2 RT-ddPCR體系擴增溫度優(yōu)化

分別以實驗室保存的GI、GII型NoV RNA和提取的MS2噬菌體RNA為模板，按One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes試劑盒說明書，分別在不同退火溫度下進行擴增反應(yīng)，以陽性微滴擴增強度為標準，對篩選出的引物探針退火溫度進行優(yōu)化。

1.2.3 GI、GII型NoV和MS2噬菌體RT-ddPCR定量檢測方法學評估

1.2.3.1 3 個RT-ddPCR定量檢測方法的定量限和準確性分析

MS2噬菌體核酸拷貝濃度測定：取MS2噬菌體懸液100 μL，提取RNA后溶于100 μL DEPC水，應(yīng)用微定量核酸蛋白分析儀測定其OD、OD/OD及核酸質(zhì)量濃度值，重復(fù)測定5 次，取平均值作為提取的RNA核酸質(zhì)量濃度值。計算提取的MS2噬菌體核酸拷貝濃度，公式如下：

將保存的GI、GII型NoV RNA標準物質(zhì)和提取的MS2噬菌體RNA分別按多倍梯度稀釋，每個梯度各取2 μL，分別進行RT-ddPCR檢測，每個梯度重復(fù)檢測4 次，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），分別確定3 個RT-ddPCR定量檢測方法的定量限，分析檢測值與理論值之間的關(guān)系，確定檢測體系的準確性。

1.2.3.2 3 個RT-ddPCR定量檢測方法的重復(fù)性分析

分別取GI、GII型NoV RNA標準物質(zhì)和提取的MS2噬菌體RNA為模板，按10 倍梯度稀釋，各取高、低兩個梯度進行相應(yīng)的RT-ddPCR檢測，每個梯度各取2 μL。每種模板分別各取3 個平行進行稀釋，每個平行每個梯度重復(fù)檢測6 次，同時設(shè)置1 個空白對照（DEPC水）。計算各樣品各梯度的檢測值與其理論值的偏差，分析檢測方法的重復(fù)性。

1.2.4 實際樣品中添加MS2噬菌體對NoV定量檢測結(jié)果的影響分析

由于CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同食品基質(zhì)的前處理方法不同，選擇貝類（牡蠣）、硬質(zhì)表面食品（蘋果）、生食蔬菜（羽葉生菜）以及軟質(zhì)水果（草莓）4 種食品基質(zhì)用于制備陽性樣品。根據(jù)CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同食品基質(zhì)的檢測用量，分別向牡蠣消化腺2 g、蘋果（帶皮）表面100 cm、羽葉生菜25 g和草莓25 g樣品中添加100 μL實驗室保存的NoV陽性糞便樣品（GII型NoV），靜置30 min，每種基質(zhì)制備兩份平行陽性樣品。制備的陽性樣品（包括牡蠣消化腺2 g、蘋果（帶皮）表面100 cm、羽葉生菜25 g和草莓25 g）全部用于RT-ddPCR定量檢測。各陽性樣品參照CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同不同食品基質(zhì)的前處理方法進行病毒洗脫和濃縮，其中一份陽性樣品在前處理過程中添加100 μL MS2噬菌體懸液，另一份平行的陽性樣品不添加MS2噬菌體懸液。病毒洗脫和濃縮后，提取RNA溶于100 μL DEPC處理水中。將提取的陽性樣本RNA分別進行GII型NoV和MS2噬菌體RT-ddPCR定量檢測，每份樣品重復(fù)檢測6 次，分析添加MS2噬菌體對陽性樣品中NoV定量檢測結(jié)果的影響。

1.2.5 基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測方法的實際應(yīng)用

從超市或市場購入貝類樣品23 份、硬表面食品8 份、生食蔬菜9 份、軟質(zhì)水果15 份，共計55 份樣品。硬表面食品和生食蔬菜購入后立即進行檢測或保存于4 ℃，貝類和軟質(zhì)水果可立即進行檢測，或者保存于-80 ℃。參考CEN ISO/TS 15216-2:2019中對不同食品基質(zhì)的檢測用量的規(guī)定，分別取貝類消化腺2 g、硬表面食品表面積100 cm、生食蔬菜25 g、軟質(zhì)水果25 g，采用基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測方法進行NoV篩查和定量檢測，且每份實際樣品在檢測前，均添加100 μL實驗室保存的MS2噬菌體懸液作為過程質(zhì)控，分析不同食品基質(zhì)中MS2噬菌體的回收率，并計算陽性樣品中NoV實際載量。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析各組之間的差別，統(tǒng)計方法采用檢驗和單因素方差分析，檢驗水平=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針篩選結(jié)果

根據(jù)NoV基因型分型保守區(qū)域分別設(shè)計出3 組GI型NoV引物、探針和4 組GII型NoV引物、探針，引物探針序列未給出。熒光PCR篩選結(jié)果表明，針對GI型和GII型NoV的各組引物探針均能有效擴增出靶基因，其中來源于GB 4789.42—2016《食品微生物學檢驗 諾如病毒檢驗》的引物探針COG1-F/R/RING1-P和COG2-F/R/RING2-P具有較高的擴增效率，可篩選分別用于構(gòu)建GI、GII型NoV RT-ddPCR體系。對其特異性進行驗證（圖1）。熒光PCR特異性驗證結(jié)果表明，篩選的GI型NoV特異性COG1-F/COG1-R/RING1-P、GII型NoV引物探針COG2-F/COG2-R/RING2-P和MS2噬菌體引物探針MS2-TM3-F/R/P特異性良好（圖2），各篩選的引物探針序列見表1。

圖1 熒光PCR篩選引物探針Fig.1 Screening of primers and probes by fluorescence PCR assay

圖2 熒光PCR驗證引物探針特異性Fig.2 Specificity of selected primers and probes verified by fluorescence PCR assay

表1 篩選的RT-ddPCR引物探針序列Table 1 Sequences of selected primers and probes for RT-ddPCR assay

RT-ddPCR特異性驗證結(jié)果表明，3 個RT-ddPCR體系只有各自對應(yīng)目的片段特異性擴增，其余病毒經(jīng)檢測均呈陰性，證明篩選的3 組引物探針在RT-ddPCR體系中特異性良好（圖3）。

圖3 RT-ddPCR檢測方法特異性實驗結(jié)果Fig.3 Specificity of RT-ddPCR assay

2.2 RT-ddPCR檢測體系優(yōu)化結(jié)果

由圖4A、B可見，50 ℃條件下GI、GII型NoV目的基因片段的擴增效率均偏低，陽性微滴和陰性微滴分界不明顯；55 ℃和60 ℃條件下目的基因片段擴增效率較高，可出現(xiàn)比較明顯的陽性微滴簇，且55 ℃條件下擴增的熒光信號略高于60 ℃，因此，將55 ℃作為GI和GII型NoV RT-ddPCR檢測體系的最佳最火溫度；由圖4C可見，55 ℃條件下MS2噬菌體目的片段的擴增效率偏低，陽性微滴和陰性微滴分界不明顯；57.5、60 ℃和62.5 ℃條件下目的基因片段擴增效率較高，陽性微滴和陰性微滴可明顯分解，且62.5 ℃條件下擴增的熒光信號略高于57.5 ℃和60 ℃，因此，將62.5 ℃作為最佳退火溫度。

圖4 RT-ddPCR檢測體系在不同退火溫度下擴增結(jié)果Fig.4 Amplification efficiencies of RT-ddPCR assay at different annealing temperatures

2.3 RT-dd PCR檢測體系的定量限和準確度

對于MS2噬菌體RNA，5 次重復(fù)測量得到的核酸濃度平均值為1.269 μg/mL（測量結(jié)果未給出）。MS2噬菌體為單鏈RNA病毒，基因組由3 569 個核苷酸組成，故計算得到的MS2噬菌體RNA拷貝濃度為6.29×10拷貝/μL。

將GI、GII型NoV RNA標準物質(zhì)和MS2噬菌體RNA分別按多倍梯度稀釋，直至稀釋濃度分別為5.4、5.9 拷貝/μL和6.29 拷貝/μL，每個梯度4 個重復(fù)實驗，分別進行RT-ddPCR檢測。結(jié)果表明，GI和GII型NoV的RT-ddPCR檢測最后兩個稀釋倍數(shù)的RSD均較大，但是均在25%以內(nèi)，表明這兩個檢測體系的絕對定量檢測靈敏度均可達到5 拷貝/μL；而MS2噬菌體RT-ddPCR檢測RSD為4.5%～42.0%，對單個拷貝濃度樣品的4 次重復(fù)的RSD達到42%，故MS2噬菌體RT-ddPCR檢測的絕對定量檢測靈敏度可達到10 拷貝/μL梯度（表2）。

表2 RT-ddPCR檢測體系的定量限和準確度（n＝4）Table 2 Limits of quantitation and accuracy of RT-ddPCR assays (n=4)

3 個體系所檢測的濃度值與相應(yīng)的理論濃度值均具有很好的線性關(guān)系，并且與理論拷貝數(shù)相符，3 個RT-ddPCR檢測體系分別能夠?qū)I、GII型NoV和MS2噬菌體進行準確定量（圖5）。

圖5 RT-ddPCR檢測體系的線性關(guān)系Fig.5 Linear relationship of RT-ddPCR assays

2.4 RT-dd PCR檢測體系的重復(fù)性

對于高濃度樣品和低濃度樣品，3 個RT-ddPCR檢測體系的RSD 均小于25%，與理論值的偏差為0.34%～15.63%，單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，各RT-ddPCR檢測體系的3 個重復(fù)檢測值之間無顯著差異（＞0.05），可見RT-ddPCR檢測體系的重復(fù)性均較好（表3）。進一步分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，高濃度樣品3 個平行樣品的測定RSD總體上低于低濃度樣品，可見模板的濃度對RT-ddPCR檢測體系的重復(fù)性影響較大，樣品濃度范圍在10～10數(shù)量級范圍內(nèi)時，RT-ddPCR檢測體系能夠較好地對目的模板進行定量檢測。

表3 RT-ddPCR檢測體系的重復(fù)性（n＝6）Table 3 Repeatability of RT-ddPCR assays (n=6)

2.5 MS2噬菌體對食品中NoV RT-ddPCR定量檢測結(jié)果的影響

貝類消化腺（牡蠣消化腺）、硬表面食品（蘋果）、生食蔬菜（羽葉生菜）和軟質(zhì)水果（草莓）4 種食品基質(zhì)中，添加與未添加MS2噬菌體過程控制的平行樣品，GII型NoV定量檢測結(jié)果相近，檢驗結(jié)果值均大于0.05，差異無統(tǒng)計學意義（表4）。4 種食品基質(zhì)過程控制回收率分別均大于1%，均符ISO/TS要求。添加了MS2噬菌體的樣品可通過將GII型NoV定量檢測結(jié)果除以回收率，得到NoV載量，均達到了10拷貝數(shù)量級，RSD為2.4%。

表4 不同食品基質(zhì)中NoV樣品定量檢測結(jié)果（n＝6）Table 4 Results of quantitative detection of norovirus in different food matrixes (n=6)

2.6 食品中NoV RT-ddPCR定量檢測方法的應(yīng)用

實際樣品檢測結(jié)果表明（具體數(shù)據(jù)未給出），在23 份貝類樣品中有2 份檢出GII型NoV RNA，檢出率為8.70%。硬表面食品、生食蔬菜和軟質(zhì)水果樣品中均未檢出食源性病毒。不同的食品基質(zhì)中MS2噬菌體作為過程控制的回收率不同，貝類消化腺中的過程控制回收率在18.2%～78.6%之間，硬表面食品中的過程控制回收率在9.4%～58.2%之間，生食蔬菜中的過程控制回收率在8.5%～32.2%之間，軟質(zhì)水果中的過程控制回收率在1.7%～19.9%之間。

3 討論

NoV是引起急性暴發(fā)非細菌性胃腸炎的首要致病原體，美國疾病控制與預(yù)防中心監(jiān)測研究估計30%～50%的食物源性胃腸炎暴發(fā)與NoV有關(guān)。NoV通過污染肥料或水體進入食物鏈，被污染的水體中生長的濾食性貝類，可濃縮水體中的NoV，當人類生食來自被NoV污染水體中的貝類或者食用未熟透的貝類時，可感染NoV；此外攜帶了NoV的食品加工者也可能將病毒顆粒轉(zhuǎn)移到食品上。由此可見，被NoV污染的食物是其傳播的關(guān)鍵，建立科學、高效的食品中NoV檢測手段，對控制NoV引起的疾病，保障人民健康具有重要意義。

數(shù)字PCR技術(shù)將PCR體系分割為許多獨立的反應(yīng)單元，模板在獨立的反應(yīng)單元中進行PCR擴增，檢測每個反應(yīng)單元是否有熒光信號判斷是否含有擴增模板，通過泊松統(tǒng)計學處理，不依賴標準曲線和循環(huán)閾值可直接定量核酸拷貝數(shù)。定量檢測RNA時，需要將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Kiselinova等在兩步法反轉(zhuǎn)錄數(shù)字PCR對定量檢測HIV RNA時，仍然需要依賴標準曲線計算RNA的拷貝濃度。RT-ddPCR可避免反轉(zhuǎn)錄給定量結(jié)果帶來的偏倚，目前已有研究成功利用RT-ddPCR實現(xiàn)水體中的RV RNA直接定量檢測，靈敏度與real-time PCR相當。

本研究以實驗室保存的GI、GII型NoV RNA標準樣品為模板，分析構(gòu)建的NoV RT-ddPCR檢測體系的檢出限包括10～10拷貝/μL 5 個數(shù)量級。RT-ddPCR對高濃度模板樣本檢測能力受限，主要原因是ddPCR平臺僅可生成小于20 000 個微滴，當模板濃度達到10拷貝/μL數(shù)量級，不能通過泊松分布計算模板含量。但是對于低濃度模板樣本，RT-ddPCR具有較小的變異系數(shù)和更高的靈敏度，Tang Hui等結(jié)果表明，ddPCR具有更好的可重復(fù)性，對低拷貝的質(zhì)粒標準品的定量檢測優(yōu)于實時熒光PCR。Yan Yong等發(fā)現(xiàn)，dd PCR能夠從real-time PCR檢測陰性的咽拭子標本中檢測出流感病毒載量，其檢測靈敏度更高。

基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測方法，需要構(gòu)建過程控制程序，采用的模式病毒應(yīng)具備以下條件：1）可建立RT-ddPCR檢測體系，具有與NoV相當?shù)臏蚀_性、靈敏度和變異性；2）容易培養(yǎng)，無生物危害，能夠確定效價；3）與NoV基因有明顯區(qū)別，不影響檢測結(jié)果；4）在自然狀態(tài)中不出現(xiàn)，只能人為添加到被檢測食品中。MS2噬菌體是一種無包膜+ssRNA病毒，侵染宿主為F+（雄株）大腸埃希氏菌，大小和結(jié)構(gòu)與NoV比較接近，可通過計數(shù)噬菌斑確定其效價，對人體沒有致病性，基因組不含NoV的靶基因序列。本研究建立了MS2噬菌體RT-ddPCR檢測體系，準確性、定量限和重復(fù)性與NoV RT-ddPCR檢測體系相當，且不影響食品中NoV的RT-ddPCR定量結(jié)果，因此，可作為過程控制的模式病毒被添加到食品中指示回收率，計算食品中NoV的實際載量。

采用本研究建立的基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測方法，對市售的食品樣品進行檢測，結(jié)果僅在貝類樣品中檢出NoV，檢出率為8.7%，與Cheng等的研究中的檢出率相近，而在硬表面食品、生食蔬菜和軟質(zhì)水果樣品中均未檢出NoV。出現(xiàn)以上結(jié)果與不同食品基質(zhì)中NoV污染方式不同有關(guān)。貝類為濾食性動物，可將被NoV污染水體中的病毒顆粒富集到消化腺中。有研究表明，被NoV污染的水體中，貝類經(jīng)過4～5 h的生物富集作用，每個貝類消化腺中可達到＞1 000 NoV載量，貝類消化腺中的NoV濃度可高于周圍水體數(shù)十倍至數(shù)千倍，而且在凈化后的貝類中也常常檢出NoV。硬質(zhì)表面食品、生食蔬菜和軟質(zhì)水果沒有生物蓄積過程，即使被NoV污染，其污染水平可能遠達不到貝類消化腺中的NoV濃度。

本研究建立了基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中NoV定量檢測方法，可定量檢測單個拷貝數(shù)量級的NoV核酸。NoV通常富集或吸附于不同食品基質(zhì)內(nèi)部或者表面，需要經(jīng)過病毒洗脫濃縮、核酸提取純化等前處理，才能對食品中的NoV進行定量檢測，但是前處理過程往往可導(dǎo)致NoV顆粒大量損失，造成RT-ddPCR定量結(jié)果與食品中NoV實際載量不匹配的現(xiàn)象。由此可見，后續(xù)需要針對優(yōu)化NoV洗脫濃縮，改善核酸提取效率，提高NoV整體回收率等方面進一步研究，以提升RT-ddPCR檢測體系對食品中NoV定量檢測的準確性。