張二豪，何 萍，劉盼盼，簡(jiǎn) 閱，陳 蕊，徐雨婷，祿亞洲，羅 章

（西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

沙棘（Linn.），又稱(chēng)沙棗、黑刺等，主要分布在溫帶和寒溫帶地區(qū)。沙棘富含大量的活性物質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在醫(yī)療、保健方面發(fā)揮著重要作用，素有“中國(guó)最有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的水果之一”和“天然維生素之王”之稱(chēng)。目前，有關(guān)沙棘的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)成分、醫(yī)用價(jià)值和生理生化等方面，而有關(guān)西藏野生沙棘酵母的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

沙棘果酒是以新鮮沙棘果為原材料經(jīng)發(fā)酵而成的飲品，其酒精濃度低，含有一定量的有機(jī)酸、維生素和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，與其他酒類(lèi)相比具有顯著的特點(diǎn)。在傳統(tǒng)果酒釀造過(guò)程中，酵母菌扮演著重要角色，是影響果酒品質(zhì)和風(fēng)味的重要因素。目前，與釀酒相關(guān)的酵母菌有24 屬120余種，Pando Bedri?ana等研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酒釀造過(guò)程中，本土酵母具有增加芳香類(lèi)化合物和風(fēng)味物質(zhì)合成的作用。由于沙棘漿果特殊的理化性質(zhì)，普通酵母菌無(wú)法適應(yīng)且影響沙棘果酒的風(fēng)味。因此，分離沙棘酵母成為人們研究的熱點(diǎn)。沙棘酵母菌是一類(lèi)附著在沙棘果表皮的酵母菌，其種類(lèi)受產(chǎn)地、氣候、海拔、土壤等環(huán)境因素的影響。沙棘由于其生態(tài)范圍廣的特點(diǎn)，導(dǎo)致其表皮酵母菌發(fā)酵特性多樣。通過(guò)對(duì)西藏沙棘酵母的分離及應(yīng)用研究，為以西藏沙棘果為原料生產(chǎn)高品質(zhì)沙棘果酒提供優(yōu)良菌株。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用菌落形態(tài)觀察、Biolog微生物鑒定系統(tǒng)、API20CAUX生化試劑盒鑒定及26S rDNA序列的分子生物學(xué)鑒定等方法，成功鑒定到不同樣品中的不同酵母菌。本研究以西藏隆子縣野生沙棘果為原料，對(duì)其酵母菌進(jìn)行分離純化，通過(guò)菌落形態(tài)觀察并結(jié)合26S rDNA序列的分子生物學(xué)鑒定，對(duì)分離純化的酵母菌進(jìn)行鑒定，對(duì)篩選到的酵母菌進(jìn)行生長(zhǎng)特性、耐受性和發(fā)酵特性分析，并對(duì)酵母菌發(fā)酵沙棘果酒進(jìn)行感官評(píng)定和揮發(fā)性物質(zhì)分析，以期為生產(chǎn)西藏高品質(zhì)沙棘果酒提供優(yōu)質(zhì)菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生沙棘果于2020年9月采自西藏隆子縣。

商用第二代釀酒酵母菌（ATCC 9763） 上海魯微科技有限公司；溴甲酚紫、三丁酸甘油脂、氯化三苯基四氮唑、亞硫酸鉍葡萄糖甘氨酸酵母（bismuth bisulfite glucose glycine yeast，BIGGY）瓊脂、對(duì)硝基苯基---吡喃葡萄糖苷（-nitrophenyl---glucopyranoside，-NPG） 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Mastermix，DP307酵母基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

按照文獻(xiàn)[10-13]的方法制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）固體培養(yǎng)基、YEPD液體培養(yǎng)基、2,3,5-氯化三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）上層培養(yǎng)基、TTC下層培養(yǎng)基、BIGGY瓊脂培養(yǎng)基、產(chǎn)酯固體培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

TA2003N電子天平 上海菁海儀器有限公司；NanoDrop2000微量分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾公司；5418R 高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographmass spectrometer，GC-MS）儀、DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)安捷倫科技公司；DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm） 美國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

將采摘的新鮮沙棘果在無(wú)菌條件下?lián)v碎，置于無(wú)菌三角瓶中，加入適量的無(wú)菌水，密封。25 ℃自然發(fā)酵2 d后，將發(fā)酵液分別稀釋至10、10、10、10、10，并分別吸取100 μL稀釋液均勻涂布到PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，同一濃度設(shè)6 個(gè)重復(fù)。通過(guò)平板觀察法，隨機(jī)挑選具有典型酵母菌形態(tài)特征的單菌落在PDA固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d。該過(guò)程重復(fù)3 次。將純化后得到的菌株接入YEPD液體培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，保存在-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 26S rDNA的擴(kuò)增、序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析

按照DP307 酵母基因組提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取酵母菌DNA，使用PCR 以引物DF（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和DR引物（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）擴(kuò)增26S rDNA的D1/D2區(qū)。PCR擴(kuò)增體系：10 μL 2×PCR MasterMix，10 mmol/L DF和DR引物各1 μL，1 μL 500 ng/μL基因組DNA模板，補(bǔ)dd HO至20 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化后送至成都柏暉生物科技有限公司進(jìn)行菌種鑒定。

1.3.3 酵母菌性能分析

1.3.3.1 菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

將-80 ℃保存的菌株接種于YEPD固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下擴(kuò)大培養(yǎng)48 h。取1 mL濃度為1×10個(gè)/mL的菌懸液接種于100 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣3 mL，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌懸液OD值，以無(wú)菌YEPD液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每組3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3.2 菌株耐受性測(cè)定

取1 mL濃度為1×10個(gè)/mL的菌懸液分別接種于含不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（3%、6%、9%、12%、15%、18%）、pH值（2、2.5、3、3.5、4、4.5）、葡萄糖質(zhì)量濃度（100、200、300、400、500、600 g/L）和亞硫酸質(zhì)量濃度（150、200、250、300、350、400 mg/L）的YEPD液體培養(yǎng)基中。裝入倒置的杜氏管中（杜氏管內(nèi)不含空氣），28 ℃、150 r/min培養(yǎng)1～3 d，觀察其產(chǎn)氣情況以判斷其對(duì)乙醇、pH值、葡萄糖和SO的耐受性。

1.3.3.3 菌株的發(fā)酵特性測(cè)定

糖發(fā)酵能力測(cè)定：取1 mL濃度為1×10個(gè)/mL的菌懸液分別接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的酵母浸粉溶液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%葡萄糖、2%蔗糖、2%麥芽糖、2%乳糖和2%半乳糖）中，裝入含倒置杜氏小管的試管中，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察杜氏小管頂部是否有氣泡。

產(chǎn)乙醇能力測(cè)定：將活化后的菌株接種于TTC下層培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h后，倒入TTC上層培養(yǎng)基，28 ℃暗培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)皿中菌落的顏色變化，顏色越紅，表明其產(chǎn)乙醇能力越強(qiáng)。

產(chǎn)HS能力測(cè)定：將活化后的菌株接種于BIGGY固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落顏色變化，菌落顏色越深（深棕色），表明菌株產(chǎn)HS能力越強(qiáng)。

產(chǎn)酯能力測(cè)定：將活化后的菌株接種于產(chǎn)酯培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落顏色變化，菌落黃色越深，表明產(chǎn)酯能力越強(qiáng)。

產(chǎn)-葡萄糖苷酶能力測(cè)定：采用-NPG法測(cè)定各菌株產(chǎn)-葡萄糖苷酶能力，取1 mL濃度為1×10個(gè)/mL的菌懸液接種于YEPD液體培養(yǎng)中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液（粗酶液）。取200 μL 35 mmol/L-NPG溶液加入100 μL上清液中混勻，40 ℃保溫30 min后，加入2 mL 1 mol/L NaCO終止液，在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.3.4 HS-SPME-GC-MS測(cè)定酵母菌發(fā)酵沙棘果酒的揮發(fā)性物質(zhì)

將在YEPD液體培養(yǎng)基中活化的菌株以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的接種量接入已制備好的新鮮沙棘果汁中，常溫發(fā)酵7 d，發(fā)酵液過(guò)濾澄清后于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用頂空固相微萃?GC-MS（headspace solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS）儀檢測(cè)沙棘果酒中的揮發(fā)性物質(zhì)。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

HS-SPME條件：取5 mL至20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，60 ℃恒溫條件下，以450 r/min（5 s開(kāi)，2 s關(guān)）共振蕩15 min。采用DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm）頂空萃取60 min，250 ℃解吸5 min，進(jìn)行GC-MS分析。萃取前萃取頭老化2 h。

色譜條件：DB-WAX 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（純度≥99.999%），以1.0 mL/min的恒流流速；進(jìn)樣口溫度260 ℃；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲1.5 min；升溫程序：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；全掃描模式；質(zhì)量掃描范圍：/20～650。

1.3.5 酵母菌發(fā)酵沙棘果酒的感官評(píng)定

采用定量描述分析法，感官評(píng)定小組由10 位經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的食品專(zhuān)業(yè)人員（5 男5 女，20～35 歲）組成，參考胡佳星等的方法對(duì)所釀沙棘果酒的色澤、香氣、口味、澄清度和風(fēng)格進(jìn)行喜好度評(píng)價(jià)，樣品隨機(jī)呈現(xiàn)。強(qiáng)度分為10 檔（0～9），數(shù)值越大代表喜好度越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用NIST數(shù)據(jù)庫(kù)（https://webbook.nist.gov/chemistry/）對(duì)HS-SPME-GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析；利用正交偏最小二乘方-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）中的變量重要性投影（variable important in projection，VIP）（VIP＞1）和值（＜0.05）相結(jié)合的方法篩選差異代謝物；利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析（＜0.05，差異顯著）；使用SIMCA 14.1軟件對(duì)沙棘果酒揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）；使用Graphpad Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離純化與鑒定

西藏野生沙棘酵母在YEPD培養(yǎng)基上經(jīng)多次分離純化后共篩選出4 株具有優(yōu)質(zhì)發(fā)酵特性和產(chǎn)香能力的酵母菌株，分別命名為Nysj-1、Nysj-4、Nysj-7和Nysj-9。核糖體DNA中26S rDNA D1/D2區(qū)由于其較高的突變特性，已被廣泛用于酵母菌的分類(lèi)研究。對(duì)所篩選4 株酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建4 株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖1所示，4 株酵母菌均為釀酒酵母菌（），其中Nysj-1、Nysj-4和Nysj-7聚為一支，而Nysj-9單獨(dú)成一支。

圖1 酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic tree constructed for yeast strains based on the 26S rDNA D1/D2 domain sequence

2.2 酵母菌生長(zhǎng)特性分析

如圖2所示，Nysj-4、Nysj-7和Nysj-9酵母菌的生長(zhǎng)活力顯著高于對(duì)照菌株（ATCC 9763），4～14 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期；而Nysj-1和ATCC 9763菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)與其他3 株酵母明顯不同，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間較晚，表現(xiàn)為0～6 h處于延遲期，6～14 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；但Nysj-1菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，其生長(zhǎng)速度明顯高于ATCC 9763；進(jìn)入穩(wěn)定期后，4 株沙棘酵母菌的生物量顯著高于ATCC 9763。

圖2 5 株酵母菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.2 Growth curves of five yeast strains

2.3 酵母菌耐受性分析

2.3.1 酵母菌對(duì)乙醇和pH值耐受性的分析

高濃度的乙醇含量影響酵母菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的穩(wěn)定性，抑制酵母菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力和生長(zhǎng)，隨著乙醇含量的升高，對(duì)酵母菌細(xì)胞的毒害作用越來(lái)越大，最終導(dǎo)致其發(fā)酵緩慢或終止，因此，良好的乙醇耐受性有助于酵母菌對(duì)底物的徹底發(fā)酵。如表1所示，在乙醇體積分?jǐn)?shù)3%～18%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，5 株酵母菌的產(chǎn)氣能力和生長(zhǎng)速度逐漸減弱；在15%乙醇體積分?jǐn)?shù)下，菌株Nysj-4和Nysj-9停止生長(zhǎng)；在乙醇體積分?jǐn)?shù)18%條件下，菌株Nysj-1和Nysj-7仍能產(chǎn)氣和生長(zhǎng)，但商用菌株ATCC 9763停止生長(zhǎng)和產(chǎn)氣。以上結(jié)果表明，菌株Nysj-1和Nysj-7具有良好的乙醇耐受性，符合釀酒生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。

表1 5 株酵母菌對(duì)乙醇和pH值的耐受性Table 1 Tolerance of five yeast strains to alcohol and pH

注：+.產(chǎn)氣或生長(zhǎng)旺盛，其個(gè)數(shù)表示產(chǎn)氣或生長(zhǎng)旺盛程度；-.不產(chǎn)氣或不生長(zhǎng)；表2同。

pH值能影響微生物的生物活性和代謝能力。一般情況下，酵母菌最適生長(zhǎng)pH值范圍為4～5；當(dāng)pH＜4時(shí)，會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)和代謝能力，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)pH值降低，進(jìn)而影響酵母菌的代謝能力和生長(zhǎng)速度。因此，良好的酸度耐受性是酵母菌發(fā)酵的前提。如表1所示，5 株酵母菌在pH 2.5～4.5間均能生長(zhǎng)，但pH 2時(shí)，菌株不能生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，篩選的酵母菌在釀酒發(fā)酵體系中均可生長(zhǎng)。

2.3.2 酵母菌對(duì)葡萄糖和SO耐受性分析

葡萄糖是酵母菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的基礎(chǔ)原料，葡萄糖含量決定了酵母菌的生長(zhǎng)繁殖和代謝能力，但高濃度糖溶液所形成的高滲透壓環(huán)境會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞水分流失、細(xì)胞破裂進(jìn)而抑制酵母菌的生長(zhǎng)繁殖。由表2可知，隨著初始葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，菌株的生長(zhǎng)能力逐漸降低；在600 g/L葡萄糖溶液下，所有菌株無(wú)法生長(zhǎng)；在500 g/L葡萄糖溶液下，菌株ATCC 9763、Nysj-4、Nysj-7和Nysj-9能夠生長(zhǎng)，但菌株Nysj-1無(wú)法生長(zhǎng)，說(shuō)明菌株Nysj-4、Nysj-7和Nysj-9對(duì)葡萄糖具有良好的耐受性。在釀酒過(guò)程中，加入適量的SO不僅能有效抑制雜菌的生長(zhǎng)，還能起到抗氧化和護(hù)色的作用，因此，良好的SO耐受性有助于提高酒的品質(zhì)。由表2可知，隨著SO質(zhì)量濃度的升高，酵母菌的生長(zhǎng)能力逐漸降低；在300 mg/L SO質(zhì)量濃度下，Nysj-1和Nysj-9無(wú)法生長(zhǎng)，ATCC 9763、Nysj-4和Nysj-7能夠生長(zhǎng)，但ATCC 9763和Nysj-4無(wú)法在350 mg/L SO質(zhì)量濃度下生長(zhǎng)；菌株Nysj-7在400 mg/L SO質(zhì)量濃度下仍能生長(zhǎng)，說(shuō)明Nysj-7菌株具有較強(qiáng)的SO耐受性。

表2 5 株酵母菌對(duì)葡萄糖和SO2耐受性Table 2 Tolerance of five yeast strains to glucose and SO2

2.4 酵母菌的發(fā)酵特性分析

2.4.1 酵母菌糖發(fā)酵能力分析

如表3所示，除菌株ATCC 9763不能利用蔗糖發(fā)酵，其他所有酵母菌株均可利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖進(jìn)行發(fā)酵；分離純化的4 株酵母菌均不能利用麥芽糖和乳糖發(fā)酵。

表3 5 株酵母菌的糖發(fā)酵能力Table 3 Sugar fermentation capacity of five yeast strains

2.4.2 酵母菌產(chǎn)乙醇能力分析

TTC作為一種顯色劑，能與酵母代謝物發(fā)生顏色反應(yīng)，以此判斷酵母菌的產(chǎn)乙醇能力，顏色越紅，說(shuō)明其產(chǎn)乙醇能力越強(qiáng)，反之則越弱。如圖3所示，菌株Nysj-1、Nysj-4和Nysj-7在TTC培養(yǎng)基上的顏色與商用菌株ATCC 9763顏色相當(dāng)，說(shuō)明其產(chǎn)乙醇能力與ATCC 9763菌株相當(dāng)；而Nysj-9在TTC培養(yǎng)基上的顏色最淺，說(shuō)明其產(chǎn)乙醇能力最弱。

圖3 5 株酵母菌在TTC培養(yǎng)基上的顯色Fig.3 Ethanol production capacity of five yeast strains cultured on TTC medium

2.4.3 低產(chǎn)HS酵母菌的篩選

BIGGY瓊脂培養(yǎng)基是一種選擇性培養(yǎng)基，可與HS發(fā)生顏色反應(yīng)，顏色越深，說(shuō)明菌株產(chǎn)HS越多。如圖4所示，菌株ATCC 9763、Nysj-1、Nysj-4和Nysj-9在BIGGY培養(yǎng)基上呈褐色，為高產(chǎn)HS酵母；而菌株Nysj-7呈淺褐色，為低產(chǎn)HS酵母。HS產(chǎn)生的不良?xì)馕稌?huì)影響酒的風(fēng)味和品質(zhì)，且對(duì)人體有害。因此，選擇低產(chǎn)HS的菌株Nysj-7用于后續(xù)釀酒研究。

圖4 5 株酵母菌在BIGGY培養(yǎng)基上的顯色Fig.4 H2S production capacity of five yeast strains on BIGGY medium

2.4.4 高產(chǎn)酯酵母菌的篩選

酯類(lèi)物質(zhì)是白酒中重要的呈香物質(zhì)，其含量決定了酒的品質(zhì)。產(chǎn)酯培養(yǎng)基作為一種篩選培養(yǎng)基，其菌落顏色可作為判斷產(chǎn)酯能力的指標(biāo)，已被廣泛用于產(chǎn)酯酵母菌的篩選。如圖5所示，菌株Nysj-7在產(chǎn)酯培養(yǎng)基上呈深黃色，其次是菌株ATCC 9763、Nysj-4、Nysj-1和Nysj-9，說(shuō)明菌株Nysj-7的產(chǎn)酯能力最強(qiáng)。

圖5 5 株酵母菌在產(chǎn)酯培養(yǎng)基上的顯色Fig.5 Colonies of five yeast strains cultured on ester-producing medium

2.4.5 酵母菌產(chǎn)-葡萄糖苷酶能力分析

-葡萄糖苷酶是一類(lèi)以-葡萄糖苷為底物的水解酶，能夠釋放具有香氣特性的游離糖苷鍵，增強(qiáng)香氣物質(zhì)的產(chǎn)生，被廣泛用于酒類(lèi)產(chǎn)品的增香。采用-NPG顯色法對(duì)5 株酵母菌產(chǎn)-葡萄糖苷酶能力進(jìn)行分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為＝21.76+0.015，相關(guān)系數(shù)為0.999。如圖6所示，所篩選的4 株酵母菌產(chǎn)-葡萄糖苷酶活性較強(qiáng)，均顯著高于ATCC 9763菌株（＜0.05）；其中菌株Nysj-4最強(qiáng)，其次為菌株Nysj-1、Nysj-7和Nysj-9。

圖6 5 株酵母菌的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力Fig.6 β-glucosidase production capacity of five yeast strains

2.5 酵母菌發(fā)酵沙棘果酒的感官評(píng)定分析

綜合考慮酵母菌的發(fā)酵特性和耐受性，選取菌株Nysj-7和ATCC 9763進(jìn)行釀酒發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵的沙棘果酒進(jìn)行感官評(píng)定。如圖7所示，菌株Nysj-7發(fā)酵的沙棘果酒在色澤、香氣、澄清度、口味和風(fēng)格方面均優(yōu)于ATCC 9763，說(shuō)明菌株Nysj-7具有商用價(jià)值。

圖7 菌株Nysj-7和ATCC 9763發(fā)酵沙棘果酒的感官評(píng)定Fig.7 Sensory evaluation of seabuckthorm fruit wine fermented by ATCC9763 and Nysj-7

2.6 酵母菌發(fā)酵沙棘果酒的揮發(fā)性物質(zhì)分析

HS-SPME-GC-MS技術(shù)以其簡(jiǎn)便快速、高準(zhǔn)確性和靈敏度及對(duì)復(fù)雜混合揮發(fā)性物質(zhì)的良好檢測(cè)效果，已被廣泛用于食品、環(huán)境、藥學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域。因此，使用HS-SPME-GC-MS技術(shù)檢測(cè)菌株ATCC 9763和Nysj-7發(fā)酵的沙棘果酒中的揮發(fā)性物質(zhì)。結(jié)果表明：在沙棘果酒中共檢測(cè)出524 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中烷類(lèi)97 種、酮類(lèi)40 種、酯類(lèi)130 種、醛類(lèi)20 種、胺類(lèi)16 種、醚類(lèi)3 種、醇類(lèi)77 種、烯類(lèi)23 種、芳香類(lèi)43 種、酸類(lèi)35 種和其他類(lèi)40 種。

如圖8所示，菌株Nysj-7所發(fā)酵沙棘果酒中醇類(lèi)物質(zhì)和酯類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量（40.14%和14.47%）顯著高于菌株ATCC 9763（35.82%和10.57%）；但其酸類(lèi)物質(zhì)和胺類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量（4.01%和0.08%）顯著低于菌株ATCC 9763（5.77%和0.24%）。有研究表明，酸類(lèi)物質(zhì)是影響米酒香氣的重要因素之一，但酸類(lèi)物質(zhì)含量過(guò)高可能會(huì)產(chǎn)生不良影響，如正己酸、辛酸和正癸酸等含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致米酒風(fēng)味變差。醇類(lèi)、酯類(lèi)和酸類(lèi)是酒中主要的香氣物質(zhì)，本研究結(jié)果表明菌株ATCC 9763和Nysj-7所發(fā)酵的沙棘果酒中主要香氣物質(zhì)有辛酸、正癸酸、苯乙醛、辛醇、苯乙醇、杜松醇、雪松醇、香葉醇、香茅醇、癸醇、壬醇、正辛醇、芳樟醇、異丁醇、癸酸乙酯、苯乙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯和2,4-二叔丁基苯酚等。其中，苯乙醇、杜松醇、雪松醇、香葉醇、香茅醇、苯乙酸乙酯和2,4-二叔丁基苯酚具有花香味，乙酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯和苯乙醛等具有果香味，這些物質(zhì)會(huì)提高果酒香氣。

圖8 酵母菌株ATCC 9763和Nysj-7所產(chǎn)各類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量（A）及相對(duì)含量（B）Fig.8 Number (A) and relative contents (B) of volatile compounds produced by ATCC9763 and Nysj-7

對(duì)酵母菌株ATCC 9763和Nysj-7發(fā)酵后沙棘果酒中差異代謝物進(jìn)行分析，如表4所示，共篩選出95 種差異代謝物；菌株Nysj-7與ATCC 9763相比，上調(diào)表達(dá)69 種，下調(diào)表達(dá)26 種。丁酸香茅酯、癸酸乙酯、癸醇、辛酸乙酯、丁酸苯乙酯、苯乙醛、苯乙酸乙酯、癸酸等香氣物質(zhì)在菌株Nysj-7所發(fā)酵的沙棘果酒中顯著上調(diào)（＜0.05），而山梨酸乙酯、丁二酸二乙酯和丁二酸丁基乙酯顯著下調(diào)（＜0.05）；總體而言，上調(diào)香氣物質(zhì)的相對(duì)含量顯著高于下調(diào)香氣物質(zhì)的相對(duì)含量，這與感官評(píng)定結(jié)果一致。

表4 酵母菌株ATCC 9763和Nysj-7發(fā)酵后沙棘果酒中差異揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量Table 4 Relative contents of differential volatile compounds between seabuckthorn fruit wines fermented by ATCC9763 and Nysj-7

續(xù)表4

2.7 不同酵母菌發(fā)酵沙棘果酒揮發(fā)性物質(zhì)PCA

PCA作為一種非監(jiān)督統(tǒng)計(jì)分析方法，可總體反映樣本組間的差異度。對(duì)菌株Nysj-7和ATCC 9763所釀沙棘果酒的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行PCA，如圖9所示，PC1的貢獻(xiàn)率為48.8%，PC2的貢獻(xiàn)率為20.4%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)69.2%，這表明PCA模型能夠較好反映不同樣品中揮發(fā)性成分的全部信息。由圖9可知，菌株Nysj-7與ATCC 9763間距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明兩者在產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)上差異顯著。

圖9 酵母菌株ATCC 9763和Nysj-7發(fā)酵后沙棘果酒中揮發(fā)性物質(zhì)PCA得分圖Fig.9 PCA score plot of volatile compounds in seabuckthorm fruit wine fermented by ATCC 9763 and Nysj-7

3 結(jié)論

以西藏隆子縣野生沙棘果為原料，對(duì)其酵母菌進(jìn)行分離純化，通過(guò)菌落形態(tài)觀察并結(jié)合26S rDNA序列的分子生物學(xué)鑒定，共篩選到4 株具有良好發(fā)酵特性的酵母菌，且均為釀酒酵母菌。酵母菌性能分析表明：4 株釀酒酵母生長(zhǎng)速度均顯著高于ATCC 9763菌株；菌株Nysj-1和Nysj-7在乙醇體積分?jǐn)?shù)3%～18%條件下耐受性較好，Nysj-4和Nysj-9僅在乙醇體積分?jǐn)?shù)＜15%條件下耐受性較好；各菌株在pH 2.5～4.5均能生長(zhǎng)；菌株Nysj-4、Nysj-7和Nysj-9在葡萄糖質(zhì)量濃度100～500 g/L條件下耐受性較好，Nysj-1在葡萄糖質(zhì)量濃度＜500 g/L條件下耐受性較好；菌株Nysj-7耐SO能力最強(qiáng)，而菌株Nysj-1和Nysj-9最弱；4 株酵母菌均可利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖進(jìn)行發(fā)酵；Nysj-7產(chǎn)酯能力最強(qiáng)，其次是Nysj-4和Nysj-1，它們的產(chǎn)乙醇能力均與商用菌株ATCC 9763相當(dāng)；菌株Nysj-7產(chǎn)HS能力最弱；Nysj-4產(chǎn)-糖苷酶能力最強(qiáng)，其次是菌株Nysj-1、Nysj-7和Nysj-9。感官評(píng)定結(jié)果分析表明，菌株Nysj-7所釀沙棘果酒優(yōu)于ATCC 9763。HS-SPME-GCMS分析結(jié)果表明，菌株Nysj-7所發(fā)酵沙棘果酒中富含豐富的香氣物質(zhì)，且醇類(lèi)物質(zhì)和酯類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量顯著高于菌株ATCC 9763。差異代謝分析結(jié)果表明，菌株Nysj-7與ATCC 9763相比，共有95 種差異代謝物，具有香味的化合物丁酸香茅酯、癸酸乙酯、癸醇、辛酸乙酯、丁酸苯乙酯、苯乙醛、苯乙酸乙酯、癸酸等在菌株Nysj-7所發(fā)酵的沙棘果酒中顯著上調(diào)（＜0.05）且上調(diào)表達(dá)的香氣物質(zhì)相對(duì)含量顯著高于下調(diào)表達(dá)的香氣物質(zhì)相對(duì)含量；PCA結(jié)果表明，菌株Nysj-7與ATCC 9763在產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)上差異顯著。綜合考慮乙醇、SO與葡萄糖耐受性、發(fā)酵特性及產(chǎn)香能力等因素，菌株Nysj-7具有良好的應(yīng)用潛力，為本土釀酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了一定參考。