任傳英，盧淑雯，洪 濱，張英蕾，管立軍,3，李 波,3，黃文功，盧衛(wèi)紅

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；3.黑龍江省食品加工重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150086；4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

水稻是世界上消費量最大的谷物之一，在100多個國家種植，大米是世界一半以上人口的主食，也是中國65%以上人口的口糧。糙米由皮層（6%～7%）、胚（2%～3%）和胚乳（約90%）組成，被稱為全谷物。糙米不僅富含基本營養(yǎng)成分，還含有更多的微量元素和生物活性成分，如VB、VE、膳食纖維、酚類化合物、-氨基丁酸、谷維素、低聚糖和植酸。大米是糙米經(jīng)多道碾磨、拋光、色選，去除全部皮層和胚，僅保留胚乳的產(chǎn)品，因此，糙米在營養(yǎng)上優(yōu)于大米。

目前，對糙米和大米的研究主要集中在一些已知的營養(yǎng)素和生物活性成分分析，而對于許多未知的營養(yǎng)素和活性成分鮮有報道。代謝組學(xué)主要是不同代謝路徑產(chǎn)生的底物和產(chǎn)物的小分子代謝物分析（分子質(zhì)量＜1 000 Da），不僅可以全面分析代謝產(chǎn)物含量的變化，還可以闡明不同代謝產(chǎn)物與各處理條件間的變化規(guī)律，從而評價不同物質(zhì)的生物反應(yīng)及效果。已經(jīng)在植物代謝組學(xué)、微生物代謝組學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用，用于鑒定綠茶的品質(zhì)和種子萌發(fā)過程中代謝物的變化。Pongsuwan等采用高效液相色譜法與質(zhì)譜法相結(jié)合進(jìn)行不同綠茶的代謝組分析，綠茶中除了檢測到表沒食子兒茶素外，還檢測到未知的表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯，也具有顯著差異。本研究利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜非靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究糙米與大米中的所有代謝產(chǎn)物，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析和通路分析等多元統(tǒng)計分析方法，解析糙米和大米間的代謝物種類和數(shù)量的變化規(guī)律，并探明代謝產(chǎn)物變化參與的關(guān)鍵代謝途徑，旨在為糙米的貯藏技術(shù)和功能性評價提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米：綏粳18水稻種植于黑龍江省五常市衛(wèi)國鄉(xiāng)，2021年9月末收獲脫粒成稻谷，貯存至10月初經(jīng)礱谷制得糙米，出糙率為81.7%，稱取約5 g整粒糙米于10 mL離心管中密封，平行取樣3 次，液氮冷凍后貯存于-80 ℃冰箱中，待測。

大米：稱取500 g上述糙米采用實驗型碾米機(jī)碾磨成大米（與糙米制備同一天），整精米率為69.4%。稱取5 g整粒大米于10 mL離心管中密封，平行取樣3 次，液氮冷凍后貯存于-80 ℃冰箱中，待測。

乙腈、甲酸和甲醇均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

Yamamoto Vp-32實驗型碾米機(jī) 日本佐竹公司；2777C UPLC system液相色譜儀、Xevo G2-XS QTOF質(zhì)譜儀 美國沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 代謝物提取

將-80 ℃保存的測試樣品取出，立即從每管中各選取1 粒米（單粒質(zhì)量21～23 mg），具體提取過程按照每粒米的實際質(zhì)量（精確到0.000 1 g）折算成下述25 mg體系等比例添加試劑進(jìn)行代謝物的提取，具體操作如下：25 mg測試樣品倒入1.5 mL EP管中，加入800 μL預(yù)冷沉淀劑（甲醇-乙腈-純水，2∶2∶1，/），放入小鋼珠2 顆，轉(zhuǎn)入研磨機(jī)中研磨（60 Hz，4 min），小鋼珠取出后再將樣本冰浴超聲（80 Hz，10 min），放入-20 ℃冰箱，靜置120 min后離心（4 ℃，25 000×，15 min），取出上清液600 μL，將上清液轉(zhuǎn)入凍干機(jī)中凍干，加入10%甲醇溶液600 μL復(fù)溶，80 Hz冰浴超聲10 min，然后25 000×、4 ℃離心15 min，取出上清液，6 個樣本各取出50 μL，然后混合成一個樣本（質(zhì)控樣本，quality control，QC）。

1.3.2 液相色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫50 ℃，流速0.4 mL/min，流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為0.1%甲酸-甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～2 min，100% A，0% B；2～11 min，100%～0% A，0%～100% B；11～13 min，0% A，100% B；13～15 min，0%～100% A，100%～0% B。每個測試樣本的上樣體積均為5 μL。

1.3.3 串聯(lián)質(zhì)譜條件

利用Xevo G2-XS QTOF高分辨串聯(lián)質(zhì)譜對從液相色譜柱洗脫下來的小分子，分別進(jìn)行正、負(fù)離子2 種模式采集。正離子采集模式下，錐孔電壓和毛細(xì)管電壓分別為40.0 V和3.0 kV。負(fù)離子采集模式下，錐孔電壓和毛細(xì)管電壓分別為40.0 V和2.0 kV。采用全信息串聯(lián)質(zhì)譜模式進(jìn)行質(zhì)心數(shù)據(jù)采集，一級掃描是在50～1 200 Da范圍內(nèi)掃描0.2 s，然后使用20～40 eV的能量對所有母離子進(jìn)行碎裂，再進(jìn)行二級掃描0.2 s采集所有的碎片信息。在采集數(shù)據(jù)的過程中，需要對LE信號每間隔3 s進(jìn)行實時質(zhì)量校正一次，并且，在測試樣本前采集一次QC樣本，用于評價樣本在整個采集過程中儀器的穩(wěn)定性狀態(tài)。

1.3.4 峰提取及鑒定

主要通過軟件Progenesis QI（version 2.2）實現(xiàn)，包括峰對齊、峰提取、歸一化、譜圖解析和化合物鑒定等步驟。峰提取和鑒定的主要參數(shù)設(shè)置如表1所示。

表1 Progenesis QI主要參數(shù)Table 1 Major parameters of Progenesis QI

1.3.5 差異代謝物的鑒定

采用自主研發(fā)的代謝組學(xué)metaX軟件包和Progenesis QI（version 2.2）軟件對質(zhì)譜分離數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，其中代謝物的鑒定來源于KEGG、HMDB和LipidMaps數(shù)據(jù)庫。差異表達(dá)代謝物的篩選采用多變量偏最小二乘判別分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）模型前2 個PC的變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值，再結(jié)合值和單變量分析差異倍數(shù)篩選。篩選條件為：1）VIP≥1；2）＜0.053）；3）差異倍數(shù)≤0.833 3或差異倍數(shù)≥1.2，3 個條件取交集，最后得到共有的代謝物即差異代謝物。最后結(jié)果以火山圖形式呈現(xiàn)VIP值、值和差異倍數(shù)三項指標(biāo)。

1.3.6 代謝物的分類和功能注釋

HMDB（www.hmdb.ca）是一個可聯(lián)網(wǎng)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫，包含有關(guān)人類代謝物、生理濃度、疾病關(guān)聯(lián)、化學(xué)反應(yīng)、代謝途徑、參考光譜及其生物學(xué)作用的綜合信息，具有代謝途徑和圖譜搜索功能。KEGG是從分子水平信息了解生物系統(tǒng)（如細(xì)胞，生物和生態(tài)系統(tǒng)）的高層次功能的數(shù)據(jù)庫，尤其是通過基因組測序和其他高通量實驗技術(shù)而產(chǎn)生的大規(guī)模的數(shù)據(jù)庫資源。其中KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫是對生命活動中的分子相互作用和化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)的認(rèn)識，構(gòu)建了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過強(qiáng)大的通路圖形式展示關(guān)聯(lián)的代謝途徑及各途徑之間的相關(guān)性，并進(jìn)行功能注釋，明確特定代謝物參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.4 數(shù)據(jù)處理

首先對質(zhì)譜分離鑒定的原始數(shù)據(jù)提取峰列表信息，進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理和校正，然后按照1.3.5節(jié)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，找出樣品間差異表達(dá)的代謝物，最后，參考KEGG、HMDB和LipidMaps數(shù)據(jù)庫對代謝物及差異代謝物進(jìn)行鑒定，并通過KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Pathway分析，確定差異代謝物參與的主要代謝途徑。

統(tǒng)計分析：包括單變量分析和多變量分析。其中單變量分析包括非參數(shù)檢驗或參數(shù)檢驗、倍數(shù)分析。多變量分析包括PCA、聚類分析和PLS-DA。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控分析

代謝組學(xué)研究中，QC分析是評價質(zhì)譜技術(shù)可靠性和高質(zhì)量的重要方法。在樣本檢測前首先進(jìn)行QC樣本分析測試，用以平衡、穩(wěn)定“色譜-質(zhì)譜”系統(tǒng)，連續(xù)掃描得到的圖譜為總離子流圖（圖1）。QC樣本為同一個樣本，重疊程度越高、峰分離度越高，可以判定本研究的質(zhì)譜分析儀器狀態(tài)良好且穩(wěn)定。

圖1 QC樣本總離子流重疊圖Fig.1 Overlapping total ion current (TIC) chromatograms of quality control (QC) samples

2.2 差異代謝物數(shù)量和類別鑒定結(jié)果

差異代謝物的定性和相對定量基于數(shù)據(jù)庫KEGG、HMDB、LipidMaps分析得出。從數(shù)量上看，糙米與大米相比，正離子模式下，分析出差異代謝物460 個，其中上調(diào)300 個、下調(diào)160 個。負(fù)離子模式下分析出差異代謝物579 個，其中上調(diào)383 個、下調(diào)196 個（表2）。2 種模式下，上調(diào)差異代謝物均多于下調(diào)差異代謝物。從類別上看，糙米與大米相比，正離子模式下，差異代謝物中上調(diào)的主要是黃酮類、脂肪酸類、羧酸類、有機(jī)氧化物、苯類；差異代謝物中下調(diào)的主要是黃酮類、脂肪酸類、羧酸類、甘油磷酸和異二戊烯類，黃酮類、脂肪酸類和羧酸類為上調(diào)和下調(diào)共有類別。負(fù)離子模式下，差異代謝物中上調(diào)的主要是黃酮類、有機(jī)氧化物、脂肪酸類、羧酸類和肉桂酸類，差異代謝物中下調(diào)的主要是黃酮類、有機(jī)氧化物、脂肪酸類、羧酸類和甘油磷脂（圖2）。2 種離子模式下分析的差異代謝物數(shù)量極多，其中多數(shù)僅有變化趨勢，但是差異不顯著，見圖3?？傮w上看，糙米與大米相比，差異代謝物中黃酮類最多。黃酮類物質(zhì)具有抗病毒、抗自由基、抗氧化、降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、抗炎、抗衰老、防癌和預(yù)防心血管疾病等作用。Kris-Etherton等研究發(fā)現(xiàn)酚類化合物包括亞類黃酮類化合物，廣泛存在于在谷物、豆類和堅果中。Yang Zhigang等已經(jīng)證明，黃酮類物質(zhì)如麥黃酮、7--蕓香苷和7----吡喃葡萄糖苷主要存在于子葉和麩皮中，但不存在于碾磨的谷物中。多酚類物質(zhì)也是糙米中重要的植物類營養(yǎng)素，糙米中游離酚和結(jié)合酚含量均顯著高于白米，游離酚平均含量為101.64 mg/100 g，粳型糙米平均含量略高于秈型糙米。糙米在胃部和小腸消化階段還會顯著促進(jìn)酚類物質(zhì)釋放，消化液中的單體酚酸主要為阿魏酸和原兒茶酸。本研究發(fā)現(xiàn)，鑒定到的黃酮類物質(zhì)中部分由脂肪酸降解得到，如表兒茶素-吡喃葡萄糖苷-苯甲酸酯、芥子油基酯、8-丙炔二吡喃酮、兒茶素-4-醇和甘丙烯醇。這是由于糙米中脂質(zhì)含量雖然只有1%左右，但易分解，在糙米儲藏過程中，脂質(zhì)在酯酶的作用下分解產(chǎn)生游離脂肪酸，脂肪酸不穩(wěn)定，可進(jìn)一步降解產(chǎn)生酚類、酮類物質(zhì)。

表2 糙米與大米差異代謝物鑒定Table 2 Differential metabolites between brown rice and while rice

圖2 主要差異代謝物的類別Fig.2 Classification of major differential metabolites

圖3 差異代謝物火山圖Fig.3 Volcano map of differential metabolites

2.3 差異代謝物的PCA

PCA可反映樣本中代謝物豐度情況，樣本之間位置越近則越相似，越遠(yuǎn)則反之。對糙米與大米差異代謝物進(jìn)行PCA，見圖4。2 組樣品的置信區(qū)間均在95%以內(nèi)，糙米與大米樣品的PC明顯不同，分別位于置信區(qū)間的左右兩側(cè)。從分布模式看，負(fù)離子模式下糙米樣本之間的距離更近，說明3 個平行樣品中的差異代謝物鑒定情況十分接近。正離子模式下，每組3 個平行樣品中的差異代謝物均有一定的離散性，說明組內(nèi)樣品間也存在一定的個體差異。這可能是由于測試樣品組內(nèi)的3 個米粒成熟度和粒位不同，導(dǎo)致鑒定到的差異代謝物有所差異。研究表明，成熟度和粒位對大麥品質(zhì)、營養(yǎng)性和耐儲性均有影響。貴州主栽水稻品種不同成熟期大米品質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)在乳熟、蠟熟、成熟、完熟4 個時期中，各質(zhì)量指標(biāo)在中后期較高，而在后期有所下降。

圖4 PCA散點圖Fig.4 PCA score scatter plots

2.4 差異代謝物的分類和功能注釋

糙米與大米全部差異代謝物（正離子模式460 種和負(fù)離子模式579 種）聚類分析熱圖見圖5。不同顏色表示不同含量，紅色表示含量上調(diào)，綠色表示含量下調(diào)，從綠色到紅色表示該物質(zhì)表達(dá)量由低到高。通過對鑒定的代謝物進(jìn)行聚類分析后，已鑒定的代謝物主要分為3 類，包括生物活性物質(zhì)、脂質(zhì)和植物化學(xué)物，其中具有生物活性的化合物居多，正離子模式下生物活性的化合物主要是氨基酸/肽、苯類和有機(jī)酸類，如-精氨酸、瓜氨酸、3-甲基組氨酸、-乙酰高絲氨酸、5-羥基--色氨酸、三甲基--組氨酸、5-羥基--色氨酸、谷氨酰--半胱氨酸、4-氟苯甲酸、苯丙酮酸、吲哚、賽洛辛、4-羥基苯甲醛和-乙酰神經(jīng)氨酸9-磷酸等。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，糙米與大米中的蛋白質(zhì)含量雖然差異不顯著，但是氨基酸總量和必需氨基酸總量差異顯著，其中以組氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸為主。脂質(zhì)類主要是脂肪酸、脂肪酰、脂肪醇、脂肪酯、脂肪酰胺和脂肪醛。植物化學(xué)物主要是黃酮類、生物堿，如鼠李糖苷、染料木黃酮、甘黃酮A、2-脫羧基甜菜堿、天竺葵素、4,8-二羥基-2-呋喃、頭孢拉定A和苯并呋喃-1,3-二醇。類黃酮是植物酚類化合物的重要組成，Dong Xuekui等采用廣靶代謝組學(xué)方法對90多種黃酮類化合物同時鑒定和定量，比較水稻不同發(fā)育階段不同組織中的類黃酮含量，研究表明，黃酮單-C-糖苷、丙二酸化黃酮--己糖苷和一些黃酮--糖苷為主要差異代謝物。Wang Changyuan等采用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行不同貯藏期糙米代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)糙米貯藏后代謝產(chǎn)物的數(shù)量和類型發(fā)生了顯著變化，由于采用的分析方法和鑒定數(shù)據(jù)庫不同，僅篩選了34 種差異代謝物，儲藏后糙米的碳水化合物、氨基酸和脂肪酸含量降低，而糖醇、胺和醛類含量增加。

圖5 差異代謝物聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of differential metabolites

如圖6所示，正離子模式下，主要代謝是氨基酸代謝、其他次生代謝物的生物合成、輔因子和維生素代謝；負(fù)離子模式下，主要代謝是輔因子和維生素代謝、其他次生代謝物的生物合成、碳水化合物代謝、核苷酸代謝和氨基酸代謝（沒有分類信息的鑒定結(jié)果不參與統(tǒng)計）。對于差異代謝物顯著富集的Pathway繪制氣泡圖（圖7），參與相應(yīng)代謝途徑的代謝物鑒定結(jié)果見表3、4。正離子模式下，代謝物參與的代謝途徑差異顯著的主要是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成和組氨酸代謝，其中參與前者的代謝物是苯基丙酮酸和吲哚，參與后者的代謝物是3-甲基組氨酸和三甲基--組氨酸；負(fù)離子模式下，代謝物參與的代謝途徑差異顯著的主要是甜菜堿生物合成、嘌呤代謝、碳代謝、玉米素生物合成和C-支鏈二元酸代謝，其中參與甜菜堿生物合成的代謝物是2-脫羧基甜菜堿、天竺葵II和七葉樹素II，導(dǎo)致糙米具有一定的澀味，參與嘌呤代謝的代謝物是P1,P4-雙(5′-黃糖基)四磷酸，參與碳代謝的代謝物是--葡萄糖-6-磷酸、中康酸和5,10-甲基四氫葉酸，參與玉米素生物合成的代謝物是順式玉米素-7--糖苷和腺嘌呤，參與C-支鏈二元酸代謝的代謝物是中康酸和反式烏頭酸。Zhao Mingchao等采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法代謝組學(xué)分析到黑米中257 種次級差異代謝物，大多數(shù)差異代謝物參與的代謝途徑主要是酪氨酸代謝、核黃素代謝、類黃酮生物合成、花青素生物合成和苯丙烷類化合物生物合成。

圖6 KEGG功能注釋條形圖Fig.6 Bar graphs of KEGG function annotation

圖7 代謝途徑富集分析氣泡圖Fig.7 Bubble diagrams of metabolic pathway enrichment analysis

表3 差異代謝物鑒定結(jié)果（正離子）Table 3 Results of identification of differential metabolites in the positive ion mode

表4 差異代謝物鑒定結(jié)果（負(fù)離子）Table 4 Results of identification of differential metabolites in the negative ion mode

3 討論

近年來，糙米因其具有較高的營養(yǎng)品質(zhì)而越來越受到人們的關(guān)注，全世界都推薦食用糙米。糙米和精米之間的營養(yǎng)素差異已經(jīng)被許多研究所確定。Vichapong等發(fā)現(xiàn)，黑米、紅米、紫米和糙米中酚類化合物、總黃酮和抗氧化活性均高于大米，鑒定的12 種酚類化合物均為游離酚類化合物，其中阿魏酸含量最高。本研究基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜非靶向代謝組學(xué)分析糙米與大米中的差異代謝物，PCA表明，在正離子和負(fù)離子模型下，大米和糙米是分離的。PCA正確反映了相應(yīng)樣品中代謝物的積累模式和特異性，該結(jié)果表明大米和糙米之間存在代謝組學(xué)差異。在這些差異代謝物中，類黃酮最多。負(fù)、正離子模式分別為89 個和31 個，除了糖苷類，還鑒定到脂肪酸分解物（如兒茶素-吡喃葡萄糖苷-苯甲酸酯、芥子油基酯、8-丙炔二吡喃酮、兒茶素-4-醇和甘丙烯醇）、與糙米顏色和口感相關(guān)的代謝物（胡椒堿、甘草苷、米香苷和姜黃素）。黃酮類化合物是眾所周知的藥用植物活性成分和生物活性食品成分，可以改善內(nèi)皮功能并可能降低血壓，體外研究表明，多種黃酮類化合物可引起大鼠離體動脈的血管舒張，內(nèi)皮功能的改善可有助于降低血壓。

植物使用脂肪酸合成?；|(zhì)，用于許多不同的細(xì)胞、生理和防御作用，包括合成必需的膜、儲存或表面脂質(zhì)，以及用于信號或防御的各種脂肪酸衍生代謝物的產(chǎn)生，脂肪酸通過與輔酶A或?；d體蛋白的硫酯鍵被激活以進(jìn)行代謝處理。特定的不飽和脂肪對正常壽命、生理功能和神經(jīng)發(fā)育有重要作用，相應(yīng)的下游代謝物是重要的脂質(zhì)信號分子。脂肪酸在人體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能、物質(zhì)儲存和細(xì)胞信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，食用不飽和脂肪酸對人體健康有保護(hù)作用，一些必需脂肪酸（亞油酸和-亞麻酸）只能從飲食中攝取。因此，類黃酮和脂肪酸的代謝變化可能有助于糙米的營養(yǎng)價值評價。此外，使用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異離子進(jìn)行注釋，正離子模式下代謝途徑為2 條（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、組氨酸代謝），參與代謝物為4 種；負(fù)離子模式下代謝途徑為5 條（甜菜堿生物合成、C-支鏈二元酸代謝、嘌呤代謝、玉米素生物合成和碳代謝），參與代謝物為10 種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全谷物糙米與碾磨后的大米相比，差異代謝物上調(diào)為主，而且通過影響氨基酸代謝、碳代謝、嘌呤代謝、玉米素代謝和甜菜堿生物合成等代謝途徑，調(diào)節(jié)米糠和胚中多種氨基酸、多酚、脂肪酸類物質(zhì)含量，提升稻米的營養(yǎng)品質(zhì)。