李恩靜，王 丹，薛晨玉，楊紅蓮，耿健強(qiáng)，穆同娜，吳燕濤，呂 瑩

（1.北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100094；2.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206）

嬰幼兒配方乳粉是以乳類及乳蛋白制品為主要蛋白來(lái)源，加入適量的維生素、礦物質(zhì)和（或）其他輔料，僅用物理方法生產(chǎn)加工制成的產(chǎn)品，其能量和營(yíng)養(yǎng)成分能夠部分滿足初生至3 周歲嬰幼兒的成長(zhǎng)需要，根據(jù)不同月齡嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)的需求，主要分為嬰兒配方乳粉和較大嬰兒及幼兒配方乳粉。隨著益生菌與嬰幼兒健康關(guān)系研究的不斷深入，嬰幼兒配方乳粉中添加活性益生菌成為一種趨勢(shì)。段文鋒等調(diào)研發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)常見的添加益生菌的嬰幼兒配方乳粉中，50%以上的產(chǎn)品使用了雙歧桿菌，添加最多的是動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12，其次還有動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種HN019、Bi-07和嗜酸乳桿菌NCFM。雙歧桿菌作為一種重要的益生菌，是一種專性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，至今已有大量研究表明雙歧桿菌能夠調(diào)節(jié)嬰幼兒腸道的菌群平衡，改善嬰幼兒的免疫系統(tǒng)，有效促進(jìn)嬰幼兒正常生長(zhǎng)發(fā)育。由于嬰幼兒是特殊的敏感群體，為了規(guī)范菌株使用，2011年原衛(wèi)生部發(fā)布了《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》，明確列出嬰幼兒食品中可使用的菌種名稱及菌株號(hào)，截至目前，經(jīng)國(guó)家衛(wèi)健委批準(zhǔn)可應(yīng)用于嬰幼兒食品的益生菌共13 株11 個(gè)菌種，主要以雙歧桿菌和乳桿菌為主。

嬰幼兒配方乳粉中添加益生菌種類的規(guī)定保證了其安全性，而益生菌產(chǎn)品的活菌數(shù)是保證其功能特性的關(guān)鍵因素，嬰幼兒配方乳粉系列食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)均對(duì)保質(zhì)期內(nèi)產(chǎn)品中益生菌的活菌數(shù)目進(jìn)行了規(guī)定，規(guī)定產(chǎn)品中活菌數(shù)應(yīng)不小于10CFU/g（mL）。針對(duì)雙歧桿菌定量檢測(cè)的現(xiàn)行有效國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用的是平板計(jì)數(shù)法，該方法在實(shí)際應(yīng)用中存在耗時(shí)長(zhǎng)（一般為72 h）、工作量大和操作較繁瑣等缺陷。近年來(lái)，以實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）為代表的分子生物學(xué)技術(shù)也逐漸被廣泛應(yīng)用到益生菌的定量檢測(cè)工作中。相比較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，real-time PCR快速、靈敏、特異，但該方法屬于相對(duì)定量，結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性在很大程度上依賴于所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量及擴(kuò)增效率，并且需要具備已知濃度的核酸標(biāo)準(zhǔn)品。新興的微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）被認(rèn)為是第3代核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)把稀釋到一定濃度的DNA分子分布到10 000～20 000 個(gè)微滴中，使大部分微滴中DNA分子的數(shù)量為1或0，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增和陽(yáng)性信號(hào)的累積讀取陽(yáng)性反應(yīng)單元數(shù)，采集陽(yáng)性信號(hào)與陰性信號(hào)的比例，再根據(jù)泊松分布計(jì)算出樣本中的DNA分子數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA分子的絕對(duì)定量。目前該技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用日益增多，主要應(yīng)用于食源性致病菌檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)、動(dòng)物源性成分檢測(cè)等方面。國(guó)內(nèi)鮮見ddPCR技術(shù)應(yīng)用于嬰幼兒配方食品中雙歧桿菌檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道，針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法的不足，本研究擬采用ddPCR檢測(cè)技術(shù)建立針對(duì)嬰幼兒配方食品中常見益生菌的快速準(zhǔn)確定量方法，旨在為嬰幼兒配方食品中益生菌的定量檢測(cè)提供新的思路，為監(jiān)管部門對(duì)益生菌嬰幼兒配方乳粉實(shí)現(xiàn)有效監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩歧雙歧桿菌（）CICC6071、嬰兒雙歧桿菌（）CICC6069、青春雙歧桿菌（）CICC6070、發(fā)酵乳桿菌（）CICC21800、德氏乳桿菌保加利亞種（subsp.）CICC6047、副干酪乳桿菌（）CICC20262、唾液乳桿菌（）CICC23174、約氏乳桿菌（）CICC6084、嗜酸乳桿菌（）CICC6081、德氏乳桿菌乳亞種（subsp.）CICC20708、瑞士乳桿菌（）CICC6032、嗜熱鏈球菌（）CICC21728中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；長(zhǎng)雙歧桿菌（）CGMCC1.2186、短雙歧桿菌（）CGMCC1.2213 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（subsp）Bb-12、動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（subsp）HN019、鼠李糖乳酪桿菌（）GG為所在實(shí)驗(yàn)室分離菌株。所有冷凍干燥菌株按照各自的指示培養(yǎng)基進(jìn)行活化，在適宜的溫度條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接傳代3 次后備用。

MRS培養(yǎng)基 美國(guó)BD公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS） 美國(guó)賽默飛公司；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）美國(guó)Sigma公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、蛋白酶K（20 mg/mL）、溶菌酶（50 mg/mL） 北京Tiangen公司；ddPCR反應(yīng)體系有關(guān)試劑 美國(guó)伯樂(lè)公司；引物、探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

Q×200 ddPCR儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；PCR儀 美國(guó)ABI公司；高速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速≥12 000 r/min）、加熱混勻儀 德國(guó)Eppendorf公司；BILON-08無(wú)菌勻質(zhì)器上海比朗儀器有限公司；Incucell型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國(guó)MMM公司；1300 Series A2型生物安全柜 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸提取

采用改良后的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，將活化后第3代的菌株培養(yǎng)物原液1 mL放置離心機(jī)內(nèi)12 000 r/min離心5 min；倒掉上清液，加入溶菌酶200 μL，37 ℃消化1.5 h；加入蛋白酶K 50 μL，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒中提供的緩沖液GA 150 μL，56 ℃消化1.5 h。后續(xù)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取。

1.3.1.2 嬰幼兒配方乳粉樣品核酸提取

參考文獻(xiàn)[21-22]，對(duì)嬰幼兒配方乳粉中雙歧桿菌基因組DNA的提取方法進(jìn)行優(yōu)化：將嬰幼兒配方乳粉以質(zhì)量比1∶10溶于0.85%生理鹽水中，取1 mL乳液樣品12 000 r/min離心10 min；去掉上清液及脂肪，加入1 mL PBS溶液12 000 r/min離心5 min；-20 ℃冰箱放置1.5 min，100 ℃加熱混勻儀放置1.5 min，反復(fù)處置樣品6 次；加入200 μL PBS溶液，100 μL蛋白酶K以及1 μL Triton X-100，56 ℃消化1.5 h；12 000 r/min離心5 min去掉上清液，加入200 μL溶菌酶37 ℃消化1.5 h；加入蛋白酶K 50 μL，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒中提供的緩沖液GA 150 μL，56 ℃消化1.5 h。后續(xù)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取。

1.3.2 ddPCR體系及檢測(cè)

配制ddPCR體系，體系為2×探針?lè)╠dPCR預(yù)混液10 μL，將引物稀釋到10 μmol/L，取2.25 μL上下游引物和1.0 μL探針加入體系，加入2 μL的模板，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)足20 μL。

將充分混勻的ddPCR體系轉(zhuǎn)移到微滴發(fā)生卡中，并向微滴發(fā)生卡中加入70 μL微滴發(fā)生專用油，將微滴發(fā)生卡放到微滴發(fā)生器中進(jìn)行反應(yīng)。隨后將生成的40 μL微滴液轉(zhuǎn)移到ddPCR的96 孔板中，用封膜儀對(duì)96 孔板封膜，準(zhǔn)備進(jìn)行ddPCR。

ddPCR程序：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行43 個(gè)循環(huán)；98 ℃固化微滴10 min。

ddPCR結(jié)束后將96 孔板放入QX200 Droplet Reader儀器中，依次錄入樣品信息，根據(jù)Quantasoft軟件計(jì)算出最終結(jié)果（copies/20 μL）。

1.3.3 引物探針設(shè)計(jì)及特異性實(shí)驗(yàn)

查閱文獻(xiàn)[23]篩選出的雙歧桿菌單拷貝特異基因，在基因上設(shè)計(jì)引物探針序列，利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)引物探針，并通過(guò)Oligo 7.37進(jìn)行驗(yàn)證，再進(jìn)行BLAST在線比對(duì)后，設(shè)計(jì)出一對(duì)引物探針，如表1所示，探針5′端標(biāo)記FAM，3′端標(biāo)記BHQ。對(duì)7 株雙歧桿菌及10 株近源乳酸菌按照1.3.1.1節(jié)方法進(jìn)行DNA提取，并對(duì)引物探針應(yīng)用ddPCR檢測(cè)方法對(duì)雙歧桿菌同源及近源菌種進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證引物探針的特異性。

表1 ddPCR引物和探針序列Table 1 Primers and probe sequences used in ddPCR

1.3.4 ddPCR條件優(yōu)化

1.3.4.1 引物及探針濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

設(shè)置3 組待優(yōu)化的上下游引物及探針濃度，如表2所示，以動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種HN019的DNA為模板，使用上述篩選得出的一對(duì)引物探針對(duì)3 組濃度分別參照1.3.2節(jié)進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，根據(jù)微滴檢測(cè)儀生成的結(jié)果，篩選出最優(yōu)的引物探針ddPCR濃度。

表2 3 組引物探針濃度Table 2 Three groups of primer and probe concentration nmol/L

1.3.4.2 ddPCR退火溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在設(shè)計(jì)ddPCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序時(shí)，以動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種HN019的DNA為模板，使用上述篩選得出的一對(duì)引物探針和相應(yīng)濃度，以1.3.2節(jié)的ddPCR體系為基礎(chǔ)，對(duì)ddPCR退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置退火溫度為53、53.5、54、55、56、58 ℃梯度ddPCR，根據(jù)微滴檢測(cè)儀生成的結(jié)果篩選出最佳退火反應(yīng)溫度。

1.3.5 雙歧桿菌純培養(yǎng)液的平板計(jì)數(shù)及ddPCR檢測(cè)

1.3.5.1 平板計(jì)數(shù)

對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種HN019培養(yǎng)物原液選取合適稀釋度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，依據(jù)GB 4789.34—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌檢驗(yàn)》方法，每個(gè)稀釋度做2 個(gè)平皿，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。選取菌落數(shù)在30～300 CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)，每個(gè)稀釋度菌落數(shù)應(yīng)取2 個(gè)平板計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值。

1.3.5.2 雙歧桿菌培養(yǎng)液ddPCR檢測(cè)

將37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h的動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種HN019培養(yǎng)物原液至10稀釋菌液，應(yīng)用1.3.2.1節(jié)方法提取DNA，應(yīng)用已建立的ddPCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度梯度檢測(cè)重復(fù)3 次，借助SPSS 14.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。靈敏度根據(jù)拷貝數(shù)定量出的菌液濃度，同時(shí)與平板計(jì)數(shù)方法測(cè)定結(jié)果比較，確定定量范圍，并得到檢測(cè)限。

ddPCR 可直接測(cè)得每反應(yīng)的目標(biāo)基因拷貝數(shù)（copies/20 μL），ddPCR的拷貝數(shù)與對(duì)應(yīng)菌懸液濃度的換算關(guān)系公式如下：

式中：為根據(jù)ddPCR 拷貝數(shù)換算得到菌懸液的濃度/（CFU/mL）；為ddPCR中20 μL體系的拷貝數(shù)/（copies/20 μL）；為DNA提取最終的定容體積/μL；為DNA提取的菌懸液體積/mL；為ddPCR反應(yīng)體系中DNA模板體積/μL。

1.3.6 模擬雙歧桿菌嬰幼兒配方乳粉樣品的平板計(jì)數(shù)及ddPCR檢測(cè)

稱取未添加雙歧桿菌的嬰幼兒配方乳粉5 g，置于裝有44 mL生理鹽水的均質(zhì)袋內(nèi)，將37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h的雙歧桿菌HN019菌懸液10～10稀釋度菌液各1 mL，至于均質(zhì)袋中，用拍擊式勻漿器拍擊2 min，制成質(zhì)量比為1∶10的樣品勻液，各添加水平分別設(shè)3 個(gè)樣品重復(fù)，另取1 份無(wú)菌稱樣5 g嬰兒乳粉樣品加入45 mL生理鹽水，代替添加菌液作為陰性對(duì)照品，將以上5 個(gè)濃度添加水平的嬰兒配方乳粉樣品溶液，分別梯度稀釋進(jìn)行平板計(jì)數(shù)方法檢測(cè)。同時(shí)取各樣品溶液各1 mL用1.3.1.2節(jié)方法提取DNA，最終將核酸溶解在100 μL TE緩沖液中，并進(jìn)行ddPCR檢測(cè)。ddPCR對(duì)樣品的檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的菌液濃度可由1.3.5.2節(jié)公式換算得到，將其定量結(jié)果與平板計(jì)數(shù)定量結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3.7 實(shí)際嬰幼兒配方乳粉樣品的平板計(jì)數(shù)及ddPCR檢測(cè)

對(duì)市售10 份不同廠家的添加雙歧桿菌的嬰幼兒配方乳粉樣品，應(yīng)用1.3.1.2節(jié)方法提取基因組DNA并進(jìn)行ddPCR定量檢測(cè)，每個(gè)樣品取2 個(gè)平行樣品，每個(gè)平行樣品做3 次重復(fù)，同時(shí)對(duì)樣品應(yīng)用平板計(jì)數(shù)方法定量檢測(cè)，比較2 種方法的定量結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物探針特異性驗(yàn)證

以7 株雙歧桿菌及10 株近源乳酸菌培養(yǎng)物原液提取的DNA為模板，應(yīng)用表1中的雙歧桿菌引物探針進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，7 株雙歧桿菌均出現(xiàn)藍(lán)色的陽(yáng)性油滴信號(hào)，其他10 株乳酸菌均未擴(kuò)增呈陰性，為灰色油滴信號(hào)，表明選取的雙歧桿菌引物探針特異性較好，能夠滿足雙歧桿菌的檢測(cè)。

圖1 引物探針特異性驗(yàn)證Fig.1 Specificity evaluation of primers and probes

2.2 引物探針濃度優(yōu)化結(jié)果

以動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種HN019的DNA為模板，對(duì)3 組引物探針濃度進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，3 組濃度的ddPCR擴(kuò)增熒光信號(hào)強(qiáng)度無(wú)明顯差異，陰陽(yáng)性微滴之間的熒光振幅差異不明顯，故選擇最適合實(shí)際應(yīng)用的引物探針濃度為第3組：500、500、250 nmol/L。

圖2 引物探針濃度優(yōu)化Fig.2 Optimization of primer and probe concentration

2.3 退火溫度優(yōu)化結(jié)果

選擇ddPCR擴(kuò)增體系的退火溫度53、53.5、54、55、56、58 ℃進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示，退火溫度在53～58 ℃范圍內(nèi)均有熒光信號(hào)被檢出，陰陽(yáng)性微滴有明顯分界，且陰陽(yáng)性油滴之間的擴(kuò)增振幅逐漸增大，在58 ℃達(dá)到最大擴(kuò)增振幅，且在此溫度條件下陰陽(yáng)性油滴間的彌散油滴數(shù)量適中，表明ddPCR非特異擴(kuò)增較少，故選擇58 ℃作為反應(yīng)最佳退火溫度。

圖3 退火溫度優(yōu)化Fig.3 Optimization of annealing temperature

2.4 雙歧桿菌純培養(yǎng)液的ddPCR檢測(cè)及平板計(jì)數(shù)

對(duì)雙歧桿菌純培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋并應(yīng)用平板計(jì)數(shù)方法，得到原始菌液濃度為1.1×10CFU/mL，其對(duì)數(shù)值為8.05。ddPCR對(duì)原始菌液梯度稀釋至10檢測(cè)，ddPCR在10稀釋度模板濃度過(guò)高，達(dá)到檢測(cè)上限，無(wú)陰性油滴，儀器無(wú)法推算模板濃度，需要適當(dāng)稀釋才能確定，在10稀釋度由于模板濃度過(guò)低，達(dá)到檢測(cè)下限，無(wú)陽(yáng)性油滴，儀器無(wú)法推算模板濃度。如圖4所示，10～10稀釋度菌液ddPCR均能檢測(cè)到陽(yáng)性及陰性油滴。如表3所示，ddPCR檢測(cè)得到原菌懸液定量對(duì)數(shù)值在8.13～8.47（lg（CFU/mL））之間，CV值在4.31%～12.76%之間，均小于20%，重復(fù)性較好，且與平板計(jì)數(shù)測(cè)定值相差在0.5（lg（CFU/mL））值之間，偏差小于10%（表3），與平板計(jì)數(shù)定量結(jié)果一致性較好。在10稀釋度菌液達(dá)到ddPCR方法的檢出限，菌液定量結(jié)果為296 CFU/mL。

圖4 梯度稀釋純菌液ddPCR擴(kuò)增Fig.4 ddPCR amplification results of gradient dilutions of pure bacterial culture

表3 純菌液ddPCR定量Table 3 Quantitative results of pure bacterial culture by ddPCR

2.5 模擬雙歧桿菌嬰幼兒配方乳粉樣品的平板計(jì)數(shù)及ddPCR檢測(cè)

10～10稀釋度菌懸液添加水平的嬰幼兒配方乳粉樣品的平板計(jì)數(shù)結(jié)果分別為3.5×10、3.6×10、4.3×10、3.3×10、3.8×10CFU/g。同時(shí)ddPCR方法對(duì)于加入嬰幼兒配方乳粉食品基質(zhì)的雙歧桿菌定量結(jié)果由表4所示，分別為2.76×10、3.38×10、6.57×10、4.56×10、7.30×10CFU/g，在10～10CFU/g樣品濃度范圍中測(cè)定結(jié)果CV值在3.92%～15.80%之間，重復(fù)性較好，與平板計(jì)數(shù)定量對(duì)數(shù)值偏差范圍在1.37%～7.80%之間，偏差小于10%，與平板計(jì)數(shù)定量結(jié)果一致性較好，模擬樣品的檢出限為7.30×10CFU/g。

表4 模擬雙歧桿菌樣品ddPCR及平板計(jì)數(shù)定量Table 4 Quantitative results of simulated samples by ddPCR and plate counting method

2.6 實(shí)際嬰幼兒配方乳粉樣品的平板計(jì)數(shù)及ddPCR檢測(cè)

對(duì)市售不同廠家僅含有雙歧桿菌的嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行雙歧桿菌平板計(jì)數(shù)定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，活菌數(shù)均不小于10CFU/g，符合產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求，與標(biāo)簽標(biāo)識(shí)相符。同時(shí)應(yīng)用已建立的ddPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示，樣品定量檢測(cè)結(jié)果均大于10CFU/g，且ddPCR定量值與平板計(jì)數(shù)定量值相差在0.5（lg（CFU/g））值之間，偏差小于10%，結(jié)果一致性較好。由此可知本研究所建立的對(duì)嬰幼兒配方乳粉中雙歧桿菌的ddPCR定量檢測(cè)方法可應(yīng)用于實(shí)際樣品的雙歧桿菌的定量檢測(cè)。

表5 市售樣品ddPCR及平板計(jì)數(shù)檢測(cè)Table 5 Quantitative results of commercial samples by ddPCR and plate counting method

3 討論

近年來(lái)，ddPCR檢測(cè)技術(shù)因其靈敏度高、快速等優(yōu)點(diǎn)在食品檢測(cè)中應(yīng)用日益增多。魏永新等利用ddPCR技術(shù)對(duì)食品中O157∶H7進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)菌純培養(yǎng)液中最低定量為10CFU/mL，人工污染三文魚樣品中檢出限為110 CFU/g；劉洋等基于ddPCR技術(shù)建立飲料中嗜酸乳桿菌的定量檢測(cè)方法，方法靈敏度達(dá)到0.25 pg/μL，重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.34%～6.10%之間；Hansen等報(bào)道了PMA結(jié)合基因芯片dPCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)混菌樣品中NCFM和subsp.Bl-04的活菌數(shù)量，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5%和4%，顯著優(yōu)于平板計(jì)數(shù)法（15%），可見該方法精確度高，穩(wěn)定性強(qiáng)。

本研究利用雙歧桿菌特異性引物建立ddPCR定量檢測(cè)方法，并對(duì)模擬和市售添加雙歧桿菌的嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行測(cè)定。首先查閱文獻(xiàn)確定雙歧桿菌特異性單拷貝基因，并設(shè)計(jì)特異性引物探針，避免了多拷貝基因由于定量拷貝數(shù)的變化而使得ddPCR檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度降低的問(wèn)題。其次獲得高質(zhì)量及準(zhǔn)確濃度的模板DNA是ddPCR準(zhǔn)確定量的決定因素，由于雙歧桿菌是革蘭氏陽(yáng)性菌、細(xì)胞壁不易破碎，且嬰幼兒配方乳粉含有大量蛋白質(zhì)分子且成分復(fù)雜，對(duì)提取高質(zhì)量的模板DNA增加難度，因此分別對(duì)雙歧桿菌DNA和嬰幼兒配方乳粉中的雙歧桿菌提取方法進(jìn)行優(yōu)化；最后由于ddPCR檢測(cè)原理是將陽(yáng)性微滴數(shù)和陰性微滴數(shù)用泊松分布公式計(jì)算出DNA分子的拷貝數(shù)，因此陰陽(yáng)性油滴之間的熒光振幅能夠在一定程度上反映出ddPCR方法的準(zhǔn)確性和擴(kuò)增效率，而ddPCR條件的退火溫度及ddPCR中引物探針的濃度，都會(huì)對(duì)熒光振幅產(chǎn)生影響，由此對(duì)這2 個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立嬰幼兒配方乳粉中ddPCR定量檢測(cè)雙歧桿菌的快速檢測(cè)方法。

本研究將ddPCR檢測(cè)方法應(yīng)用于嬰幼兒配方乳粉中的雙歧桿菌檢測(cè)，所建立的ddPCR檢測(cè)方法對(duì)雙歧桿菌菌純培養(yǎng)液的檢出限為296 CFU/mL，模擬樣品檢出限為7300 CFU/g，CV值均小于20%，重復(fù)性較好。對(duì)市售添加雙歧桿菌的嬰幼兒配方乳粉樣品進(jìn)行檢測(cè)，表明ddPCR檢測(cè)方法和平板計(jì)數(shù)檢測(cè)方法檢測(cè)定量偏差小于10%，結(jié)果一致性較好?，F(xiàn)行有效的食品中雙歧桿菌定量檢測(cè)方法為平板計(jì)數(shù)法，一般檢驗(yàn)周期為3 d左右，本研究所建立的方法可將檢驗(yàn)周期減少至1 d左右，且具有特異性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于嬰幼兒配方乳粉中雙歧桿菌的定量檢測(cè)工作。由于嬰幼兒配方食品基質(zhì)復(fù)雜，且不同生產(chǎn)廠家的嬰幼兒配方食品中添加的原輔材料多有差異，可能影響雙歧桿菌DNA模板提取效果，進(jìn)而對(duì)ddPCR檢測(cè)準(zhǔn)確度有一定影響，未來(lái)還需要對(duì)不同嬰幼兒配方食品基質(zhì)中的雙歧桿菌提取方法進(jìn)行研究，研究出更簡(jiǎn)便、高效的提取方法，以適應(yīng)于嬰幼兒配方食品的益生菌定量檢測(cè)的快速檢測(cè)要求。