劉鵬飛 范 蓓 劉湘丹 楊 洋 盧 聰 佟立濤 孫 晶，* 王鳳忠,*

(1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運管控重點實驗室，北京 100193)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimaura et Migo)是我國的名貴中藥材之一，主要分布在安徽、浙江、云南、湖南、福建、廣西、四川等地[1]，具有滋陰養(yǎng)津、增強體質(zhì)、補益脾胃、延年益壽等功效[2-3]，是“中華九大仙草”之魁首。鐵皮石斛中含有多種營養(yǎng)成分，如多糖[4]、酚類[5]、核苷類、苯丙素類、甾類、氨基酸、礦質(zhì)元素和生物堿[6]、聯(lián)芐類[7]等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛在抗氧化[8]、抗腫瘤[9-10]、降血糖[11]、降血壓[12]、抗胃黏膜損傷[13]等方面均具有較好的活性，其中在降血糖方面的作用尤其突出，產(chǎn)生了“治消止渴湯”、“石斛湯”等經(jīng)典名方治療消渴癥。

鐵皮石斛鮮條由于易腐等特性，常加工成楓斗出售?！皸鞫贰奔磋F皮石斛鮮條除去雜質(zhì)，剪去部分須根，邊加熱邊扭成螺旋形或彈簧狀，烘干后的加工品。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食物營養(yǎng)與功能性食品創(chuàng)新團隊研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛加工成楓斗后，不但口感、耐儲性得到極大優(yōu)化，而且對α-葡萄糖苷酶的抑制率增強19.55%(樣品濃度為5 mg·mL-1時，鐵皮石斛楓斗和鮮條的抑制率分別為68.55%和49.00%)(未發(fā)表)。因此，鐵皮石斛楓斗加工前后抑制α-葡萄糖苷酶活性的相關(guān)成分亟需進一步研究。

楓斗制作過程中，經(jīng)過了干燥、加箍、烘烤、晾曬等多道工序[14-16]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，隨著干燥溫度的升高和時間的延長，鐵皮石斛的成分會發(fā)生變化，多糖、游離氨基酸和總氨基酸的保留率總體呈現(xiàn)下降趨勢，甘露糖和鼠李糖含量減少，核糖和半乳糖含量增加[17]。除了多糖、單糖等糖類成分之外，鐵皮石斛中聯(lián)芐、黃酮等小分子次級代謝產(chǎn)物的作用也不容忽視，而這些成分在楓斗加工過程中的變化規(guī)律仍鮮見研究。

本研究采用超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS)技術(shù)，測定鐵皮石斛鮮條和楓斗中的主要小分子代謝產(chǎn)物，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，挖掘二者的差異性成分并進行規(guī)律性分析，以期明確鐵皮石斛楓斗的加工意義，為闡明鐵皮石斛降血糖物質(zhì)基礎(chǔ)提供數(shù)據(jù)支撐，為促進我國鐵皮石斛精深加工和產(chǎn)業(yè)發(fā)展作出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對照品柚皮素、石斛酚、芫花素、山藥素Ⅲ，質(zhì)量分數(shù)≥ 98%，上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲酸(色譜純)，德國Merck公司；甲醇(色譜純)，江蘇漢邦科技有限公司。

鐵皮石斛鮮條采自云南省龍陵縣，經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院屠鵬飛教授鑒定為鐵皮石斛(D.officinaleKimura et Migo)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 QTOF MS超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(二元高壓泵、自動進樣器、柱溫箱)，美國Waters公司；Mili-Q 超純水儀，美國Millipore公司；BO-500S2高速多功能中藥粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；5430R小型離心機，德國Eppendorf公司；YQ-ZJ-107電子天平，廣州廣電計量檢測股份有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 鐵皮石斛鮮條和楓斗粉末的制備

1.3.1.1 鐵皮石斛鮮條粉末的制備 取適量新鮮的鐵皮石斛，隨機分成6份，切成厚度3～5 mm的斜片，-18℃ 預(yù)凍10 h后，置于真空冷凍干燥機中干燥，用高速粉碎機打碎，過65目篩，即得鐵皮石斛鮮條粉末。

1.3.1.2 鐵皮石斛楓斗粉末的制備 取適量鐵皮石斛鮮品，隨機分成6份，切成8～10 cm長條，文火加熱，待石斛軟化后，邊加熱邊用手搓去薄膜狀葉鞘使其成螺旋形或彈簧狀，再進行高溫烘干，即得鐵皮石斛楓斗。將其用高速粉碎機打碎，過65目篩，即得鐵皮石斛楓斗粉末。

1.3.2 溶液的制備

1.3.2.1 對照品溶液的制備 分別取柚皮素、石斛酚、芫花素、山藥素Ⅲ對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成各成分質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的對照品溶液。

1.3.2.2 供試品溶液的制備 稱取鐵皮石斛鮮條粉末或楓斗粉末約1.0 g，置于50 mL離心管中，加入30 mL無水甲醇，密塞后搖勻，稱定重量。超聲(功率500 W，頻率40 kHz)提取30 min，放冷，稱定重量。用甲醇補足失重，搖勻，4 000 r·min-1離心20 min，取上清液，濃縮至干，用甲醇復(fù)溶至2 mg·mL-1，用 0.22 μm微孔濾膜濾過，即得鐵皮石斛鮮條供試品溶液和鐵皮石斛楓斗供試品溶液。分別從鐵皮石斛鮮條供試品溶液和鐵皮石斛楓斗供試品溶液中取等量溶液，混勻作為質(zhì)量控制(quality control，QC)樣品，平行6次。

1.3.3 檢測條件

1.3.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 柱子(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm)；柱溫35℃；流動相為0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～15 min，95%～10% A；15～18 min，10%～0% A；18～23 min，0% A；23～23.01 min，0%～95% A；23.01～28 min，95% A)；流速0.3 mL·min-1；進樣量5 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)，電源電壓和噴霧電壓為2.23 kV，鞘氣體(氮氣)流速28 arb，輔助氣體流速8 arb，正離子一級全掃描模式，分子量范圍為m/z50～1 200。另將混合對照品溶液和混合供試品溶液做二級質(zhì)譜分析，有利于色譜峰的鑒定。

1.4 石斛屬植物化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)收集與處理

基于數(shù)據(jù)庫收集文獻中石斛化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式與理化信息等。在中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中以“鐵皮石斛”、“流蘇石斛”、“鼓槌石斛”、“金釵石斛”、“紫皮石斛”、“疊鞘石斛”、“霍山石斛”為檢索詞；在PubMed數(shù)據(jù)庫中以“Dendrobium officinale”、“Dendrobium fimbriatum”、“Dendrobium chrysotoxum”、“Dendrobium nobile”、“Dendrobium devonianum”、 “Dendrobium denneanum ”、“Dendrobium huoshanense”為檢索詞，檢索石斛有關(guān)文獻，經(jīng)過篩選得到石斛的化學(xué)成分。將整理得到的化學(xué)成分數(shù)據(jù)以Mysql5.7作為數(shù)據(jù)庫，使用Druid作為數(shù)據(jù)庫連接池，部署在阿里云ECS服務(wù)器，可在線搜索和分析石斛中的化合物。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究通過UPLC-QTOF-MS采用正離子模式進行分析，按1.3.3項條件檢測供試品溶液和混合對照品溶液。將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI 2.3軟件進行峰對齊、歸一化等處理，搜索前期建立的石斛屬植物化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫(http://39.106.37.83/shihudb/#/homePage)、天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(https://bioinfapplied.charite.de/supernatural_new/)、HMDB數(shù)據(jù)庫(https://hmdb.ca/)，根據(jù)一級和二級質(zhì)譜碎片，探究裂解規(guī)律，結(jié)合對照品比對，鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。將得到的峰值數(shù)據(jù)集輸出并導(dǎo)入SIMCA軟件，進行無監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis， PCA)和有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA)。選取變量權(quán)重值(variable influence on projection， VIP)>1，P<0.05的物質(zhì)作為差異化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物數(shù)據(jù)庫的建立

查閱7種常見石斛如鐵皮石斛、流蘇石斛、鼓槌石斛、金釵石斛、霍山石斛、紫皮石斛、疊鞘石斛的相關(guān)文獻，整理并建立化合物信息數(shù)據(jù)庫。包括化合物中文名稱、英文名稱、來源植物、分子式、精確相對分子質(zhì)量、化合物結(jié)構(gòu)等信息，共收集了443個化合物[18]。

2.2 鐵皮石斛鮮條和楓斗的化學(xué)計量學(xué)分析

鐵皮石斛鮮條和楓斗的總離子流圖如圖1所示。結(jié)果表明，出峰時間大多集中在7～20 min，鐵皮石斛楓斗大部分的峰面積值比鐵皮石斛鮮條高，表明鐵皮石斛楓斗的化學(xué)成分含量高于鐵皮石斛鮮條的化學(xué)成分含量。主成分分析得分圖(圖2-A)顯示，鐵皮石斛鮮條和楓斗分布離散，R2=0.804，Q2=0.671，PCA模型可靠，說明二者化學(xué)成分存在一定差異。

注：1：水蘇堿；2：L-苯丙氨酸；3：草質(zhì)素；4：尼泊金異丁酯；5：柚皮素；6：4,4′-二羥基-3,5-二甲基聯(lián)芐；7：諾比林A；8：石斛酚；9：對羥基肉桂酸乙酯；10：Fimbriadimerbibenzyl D isomer；11：4,9-二甲氧基菲-2, 5-二醇；12：鼓槌聯(lián)芐；13：芫花素；14：山藥素-Ⅲ；15：Dendronophenol B；16：α-亞麻酸。Note: 1: Stachydrine. 2: L-phenylalanine. 3: Herbacetin. 4: Butylparaben. 5: Naringenin. 6: 4,4′-dihydroxy-3,5-dimethyldibenzyl.7: Norbilin A. 8: Gigantol. 9: P-hydroxyl ethyl cinnamate. 10: Fimbriadimerbibenzyl D isomer. 11: 4,9-dimethoxyphenanthrene-2,5-diol. 12: Chrysotobibenzyl. 13: Genkwanin. 14: Batatasin Ⅲ. 15: Dendronophenol B. 16: α-linolenic acid.圖1 鐵皮石斛楓斗和鮮條樣品的總離子流圖Fig.1 Totalion flow diagram of fresh strips and fengdou of D.officinale

為充分提取2組樣本間的差異信息，本試驗采用OPLS-DA方法對數(shù)據(jù)進行分析，其結(jié)果如圖2-B所示。經(jīng)分析，R2=0.985，Q2=0.976，說明建立的OPLS-DA模型穩(wěn)健可靠。200次循環(huán)置換檢驗(Permutation)結(jié)果如圖2-C所示，R2(0.0，0.44)和Q2(0.0，-0.559)，Q2的回歸直線與y軸的交點在負半軸，說明建立的OPLS-DA模型擬合了較多的變量信息，且該模型具有良好的預(yù)測能力。

圖2 主成分分析得分圖(A)、OPLS-DA分析得分圖(B)、200次循環(huán)置換檢驗結(jié)果(C)Fig.2 Principal component analysis score (A), OPLS-DA analysis score chart (B), 200-cycle replacement test result (C)

2.3 差異成分鑒定

本研究篩選VIP>1，P<0.05的物質(zhì)作為差異化合物，最終篩選到16種差異化合物，包括8種聯(lián)芐類成分和3種黃酮類成分(表1)。其中，12個成分在楓斗中含量較高，4個成分在鮮條中含量較高。

圖3 聯(lián)芐類化合物的質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 Mass spectrometric cleavage pathway of dibenzyl compounds

2.3.1 聯(lián)芐類成分鑒定 聯(lián)芐類成分是石斛屬植物中普遍存在的一類成分，2個苯環(huán)通過乙基連接，具有抗腫瘤[19]、抗炎[20]、抑制血管新生[21]等活性。此類化合物常在兩個苯環(huán)間的乙基處發(fā)生斷裂，生成小分子苯酚類化合物。以化合物8為例，正離子模式下可見準(zhǔn)分子離子峰m/z275.128 [M+H]+，推測其分子式為 C16H18O4， 8個不飽和度。該化合物的二級質(zhì)譜圖中m/z151.1的信號中性丟失CH2·，得到m/z137.0；碎片離子峰m/z139.0再中性丟失CH3·得到m/z122.0的碎片。由此推斷，該化合物具有聯(lián)芐的母核，可能A、B環(huán)各含有一個羥基和一個甲氧基，結(jié)合文獻[22]報道信息，推斷該化合物為石斛酚，與對照品比對，確定為石斛酚，其可能的質(zhì)譜裂解途徑見圖3。同理，鑒定色譜峰 6、7、12、14、15均為聯(lián)芐類化合物，分別為4,4′-二羥基-3,5-二甲基聯(lián)芐、諾比林A、鼓槌聯(lián)芐、山藥素-Ⅲ 和dendronophenol B。色譜10準(zhǔn)分子離子峰為m/z533.217 [M+H]+，推測其分子式為C31H32O8，16個不飽和度。二級質(zhì)譜圖可見m/z393.2、285.1、239.1的信號，該化合物可能為聯(lián)芐二聚體，分別丟失C7H7O3、C7H8O、CH2O2基團，進一步與數(shù)據(jù)庫比對，鑒定其為Fimbriadimerbibenzyl D 的同分異構(gòu)體。

2.3.2 黃酮類成分鑒定 黃酮類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律已有多篇文獻報道[23-24]，通常會中性丟失CO，發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)(retro Diels-Alder reaction, RDA )裂解產(chǎn)生[1,3A]+和[1,3A]-。以色譜峰13為例，正離子模式下可見準(zhǔn)分子離子峰m/z285.1 [M+H]+，該化合物的二級質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了m/z270.0 [M+H-CH3·]+、257.1 [M+H-CO]+和m/z167.1 [1,3B]+的碎片，結(jié)合對照品比對和文獻報道[25]，推斷其為芫花素。同理，鑒定色譜峰 3、5 也為黃酮類化合物，分別為草質(zhì)素和柚皮素[26-27]。

2.3.3 其他類成分鑒定 除上述聯(lián)芐和黃酮兩大類成分外，其余差異成分主要為生物堿(水蘇堿，1)菲類(4,9-二甲氧基菲-2,5-二醇，11)、酯類(尼泊金異丁酯，4；對羥基肉桂酸乙酯，9)、氨基酸(苯丙氨酸，2)、脂肪酸(α-亞麻酸，16)，具體質(zhì)譜信息見表1。16 個差異化合物的豐度比較見圖 4。

圖4 鐵皮石斛楓斗和鮮條差異性成分相對含量比較Fig.4 Comparison of the content of different components between fengdou of D. officinale and its fresh

表1 鐵皮石斛楓斗與鮮條差異成分鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of differential components between fengdou of D. officinale and fresh strips

3 討論

酚類物質(zhì)在石斛中含量較低，因此本研究利用UPLC-QTOF-MS技術(shù)測定樣品，采取提取液濃縮至干再復(fù)溶的方式，可增加色譜峰的響應(yīng)值。通過比較正、負離子模式下的總離子流圖發(fā)現(xiàn)，正離子模式下的色譜峰響應(yīng)程度高于負離子模式，因此采用正離子模式分析。

本研究采用化學(xué)計量學(xué)方法進行數(shù)據(jù)分析，通過分析，鐵皮石斛加工和非加工樣品在 PCA 得分圖上可以得到明顯的區(qū)分。同時，比較了鐵皮石斛楓斗和鮮條的成分差異，以VIP>1、P<0.05 為條件，篩選和鑒定了16種具有顯著差異性的化合物，包括聯(lián)芐、黃酮、酯類等成分。黃酮是石斛中主要的生物活性成分之一，不僅有很強的抗氧化性[28]，還可以降血糖[29]。本研究比較發(fā)現(xiàn)芫花素、柚皮素、草質(zhì)素等黃酮類成分在楓斗中明顯上調(diào)積累，可能是由以柚皮素、草質(zhì)素為苷元而形成的糖苷在加工過程中遇熱斷裂糖苷鍵，變成游離黃酮所致。聯(lián)芐類成分是石斛的特征性成分，已被證實具有降血糖[30]、抗腫瘤等[31]藥理作用。不同的溫度可能會導(dǎo)致聯(lián)芐類成分羥基化程度不同，從而影響聯(lián)芐類成分的含量，鐵皮石斛楓斗中石斛酚、4,4’-二羥基-3,5-二甲基聯(lián)芐、鼓槌聯(lián)芐等相對含量明顯高于鮮條，活性成分含量累積更多，藥用效果更佳。有研究表明高濃度石斛酚抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞凋亡的能力更強[32]。同時，本研究發(fā)現(xiàn)α-亞麻酸、L-苯丙氨酸、尼泊金異丁酯等脂肪酸、氨基酸成分在鮮條中相對含量較高，而在楓斗加工過程中含量降低，其原因可能是氨基酸類和脂肪酸類成分在加工過程中受熱不穩(wěn)定，遇熱易分解和揮發(fā)。

此外，多項研究表明植物中黃酮類[33]、酚類[34]成分與抑制α-葡萄糖苷酶的活性密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)的鐵皮石斛鮮條和鐵皮石斛楓斗之間的差異成分，很可能與鐵皮石斛降血糖功效具有一定相關(guān)性，需要在后續(xù)研究中證實。

4 結(jié)論

本研究以鐵皮石斛為材料，利用UPLC-QTOF-MS技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法鑒定出鐵皮石斛楓斗和鮮條的16種差異成分，并針對16種差異成分進行分類和相對含量分析。結(jié)果表明，鐵皮石斛鮮條加工成楓斗后，黃酮、聯(lián)芐類化合物相對含量升高，脂肪酸、氨基酸類化合物相對含量降低。本研究揭示了鐵皮石斛楓斗和鮮條的差異性，有助于闡明其加工的意義，為鐵皮石斛的功能性產(chǎn)品開發(fā)提供了理論支撐。