肖懿哲, 陳小靈, 孫玉龍, 張子平, 王藝?yán)? 朱友芳

中華蛸章魚胺受體基因克隆及表達(dá)分析

肖懿哲1, 陳小靈2, 孫玉龍3, 張子平3, 王藝?yán)?, 朱友芳1

(1. 莆田市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 福建 莆田 351100; 2. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 福建 廈門 361021; 3. 福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350002)

為了解中華蛸()受精卵的孵化及幼體發(fā)育機(jī)制, 本研究對(duì)其章魚胺受體基因()進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析, 同時(shí)研究了在不同組織/器官、剛孵出的幼體不同饑餓時(shí)間及不同的胚胎發(fā)育時(shí)期表達(dá)水平的變化。結(jié)果為:開放閱讀框全長(zhǎng)為1 158 bp, 編碼385個(gè)氨基酸, 有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域, 具有G蛋白偶聯(lián)受體的共性, 其中TM3、TM5、TM6、TM7 4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)相對(duì)保守。經(jīng)氨基酸同源對(duì)比及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析, 其與加州雙斑蛸()的OAR的一致性最高。熒光定量PCR結(jié)果顯示, 在成體10個(gè)組織/器官中,在后唾液腺中表達(dá)水平最高, 其次是腦和小腸; 在幼體饑餓實(shí)驗(yàn)中, 隨著饑餓時(shí)間的推移,的表達(dá)水平在饑餓2 d后顯著降低, 在饑餓3 d時(shí)表達(dá)水平顯著升高, 且表達(dá)水平達(dá)到最高, 之后表達(dá)水平開始回落;在中華蛸整個(gè)胚胎發(fā)育周期均可檢測(cè)到, 且在多細(xì)胞期表達(dá)水平最高, 后顯著下降, 黑珠期顯著高于紅珠期及初孵幼體。這些結(jié)果為研究中華蛸受精卵的孵化及幼體發(fā)育機(jī)制、提高人工育苗效率提供了基礎(chǔ)資料。

中華蛸(); 章魚胺受體; 饑餓; 胚胎發(fā)育

中華蛸(), 原名真蛸(), 近年來根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的差異將中華蛸和真蛸分開[1-2], 主要分布在北太平洋西部的淺溫帶水域, 特別是在中國(guó)、韓國(guó)和日本沿海, 具有生命周期短、產(chǎn)卵量大、食物轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn), 被認(rèn)為具人工養(yǎng)殖潛力的優(yōu)良海水種類[3-6]。但在人工養(yǎng)殖條件下, 存在著幼體生長(zhǎng)緩慢, 死亡率高等問題, 限制了養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展[7-9]。章魚胺受體(octopamine receptor, OAR)是典型的G蛋白偶聯(lián)受體, 參與生物體包括生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育、免疫等多種至關(guān)重要的生理學(xué)過程[10]?，F(xiàn)已證明章魚胺不僅在昆蟲的生理活動(dòng)中扮演重要角色[11], 在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中也發(fā)揮很大的作用, COON等[12, 13]發(fā)現(xiàn)章魚胺能夠誘導(dǎo)太平洋牡蠣()的附著變態(tài); OARs已經(jīng)從軟體動(dòng)物腹足類的椎實(shí)螺屬和海兔螺屬中被鑒定出來, 且發(fā)現(xiàn)其在生命活動(dòng)中能夠行使控制行為發(fā)生、參與新陳代謝以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理功能[14]; PRYCE等[15]在美洲牡蠣()的鰓、外套膜、心臟、血淋巴以及神經(jīng)系統(tǒng)中檢測(cè)到了章魚胺和OARs的存在, 并證實(shí)了其在美洲牡蠣的心臟活動(dòng)中行使重要功能。這些研究結(jié)果表明OAR在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中發(fā)揮的作用與昆蟲有許多類似性, 但尚未看到中華蛸基因()的研究報(bào)道。本研究克隆了, 并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析, 研究了在不同組織中的表達(dá)、剛孵岀的幼體在不同的饑餓時(shí)間及不同的胚胎發(fā)育時(shí)期表達(dá)水平的變化。這些結(jié)果可為研究中華蛸受精卵的孵化及幼體發(fā)育機(jī)制、提高人工育苗生產(chǎn)效率提供一些基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)用的中華蛸組織樣品2021年7月采自福建省莆田市南日海區(qū)。采集肌肉、腦、鰓、鰓心、消化腺、小腸、唾液腺、腎臟、眼、心臟等10個(gè)組織/器官, 用于在各組織中的分布研究。

饑餓時(shí)間對(duì)表達(dá)水平的影響采樣時(shí)間為2019年5月, 試驗(yàn)水溫為22.5±0.5℃, 試驗(yàn)水體100 L, 設(shè)置3個(gè)平行組, 每組放養(yǎng)剛孵出的中華蛸幼體1 000只。幼體孵出時(shí)為0 h, 不投喂餌料, 饑餓天數(shù)分別為0、1、2、3、4和5 d, 每個(gè)時(shí)相取6份樣品儲(chǔ)存于液氮中。

不同的胚胎發(fā)育時(shí)期的樣品2021年3～4月采自在莆田南日海區(qū)的網(wǎng)箱, 母蛸在產(chǎn)卵巢中產(chǎn)卵并護(hù)卵, 自然水溫孵化, 孵化水溫14.7～20.8℃, 采集多細(xì)胞期(multi-cell stage)、紅珠期(red-bead stage)、黑珠期(black-bead stage)和初孵幼體(newly-hatched larvae)共4個(gè)時(shí)期的胚胎, 每個(gè)時(shí)相取6份樣品儲(chǔ)存于液氮中。

1.2 中華蛸OsOARβ2R基因克隆

利用課題組中華蛸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲得的cDNA序列, 采用從頭到趾引物(表1)擴(kuò)增、測(cè)序驗(yàn)證開放閱讀框(ORF)序列的準(zhǔn)確性。本研究中所用引物均由捷瑞(上海)生物工程有限公司合成。

表1 本研究所用引物序列

ORF區(qū)擴(kuò)增的模板為腦cDNA, 反應(yīng)體系為: 2 μL的2.5 mmol/LdNTP Mix, 2.5 μL的10×EX Taq buffer, 0.1 μL的5 U/μLEX Taq DNA聚合酶, 1 μL的cDNA模板, 1 μL的10 μmol/L-F, 1 μL的10 μmol/L-R引物, 反應(yīng)總體積為25 μL, 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后PCR產(chǎn)物由捷瑞(上海)生物工程有限公司測(cè)序。

1.3 OsOARβ2R基因及其氨基酸序列分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析獲得的ORF,分析采用NCBI的BLAST軟件,翻譯采用EXPASY網(wǎng)站的Translate軟件。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析采用NCBI的CDD軟件, 通過SWISS-MODEL網(wǎng)站進(jìn)行三維模型構(gòu)建。OAR序列多重比對(duì)采用DNAman軟件, 系統(tǒng)進(jìn)化樹采用MEGA-X軟件的鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建。

1.4 OsOARβ2R基因的定量

以作為內(nèi)參基因, 引物序列見表1。qRT-PCR采用biosharp? SYBR Green Master Mix試劑盒(蘭杰柯科技, 廣州), 反應(yīng)體系: 模板4.5 μL, 引物(-F、-R, 10 μmol/L)各0.25 μL, SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5 μL。反應(yīng)過程: 95℃變性1 min, 40個(gè)循環(huán); 95℃變性5 s; 60℃退火10 s; 72℃延伸15 s; 結(jié)束后根據(jù)熔解曲線, 分析產(chǎn)物的特異性。以2–ΔΔCt方法計(jì)算中華蛸不同組織、幼體不同饑餓時(shí)間和不同發(fā)育階段基因相對(duì)表達(dá)水平, 使用SPSS 23軟件進(jìn)行顯著性差異分析。<0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean ± SE,=6)表示。

2 結(jié)果

2.1 OsOARβ2R序列分析

的ORF長(zhǎng)度1 158 bp, 編碼385個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為44.536 kDa, 等電點(diǎn)為8.58。利用NCBI的CDD軟件預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)(OARβ2R)具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM1-7) (圖1)。預(yù)測(cè)的OARβ2R蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示, 其含有9個(gè)α-螺旋, 2個(gè)β-折疊(圖2)。

2.2 OsOARβ2R序列多重比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

選取加州雙斑蛸(登錄號(hào): XP_014771877.1)、歐洲大扇貝(登錄號(hào): XP_033757386.1)、福壽螺(, 登錄號(hào): XP_025094782.1)、加州海兔(, 登錄號(hào): NP_001191606.1)、海天牛(登錄號(hào): GFN90552.1)、美洲牡蠣(登錄號(hào): XP_022286284.1)等12種無(wú)脊椎動(dòng)物OAR與OARβ2R進(jìn)行氨基酸序列一致性的比較(圖3), 結(jié)果顯示,OARβ2R與加州雙斑蛸OAR的一致性最高, 達(dá)81.50%, 與福壽螺、海天牛、加州海兔的OAR分別達(dá)到48.24%、47.36%和46.48%, 其中, TM3最保守。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示(圖4),OARβ2R與軟體動(dòng)物門的加州雙斑蛸聚為一支, 再與軟體動(dòng)物門的其他物種聚為一大支, 另一大支為節(jié)肢動(dòng)物門(表2)。

小寫字母為核苷酸序列, 大寫字母為對(duì)應(yīng)編碼的氨基酸序列; 起始密碼子atg和終止密碼taa用加粗表示; 下劃線部分表示7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域

Lowercase letters represent the nucleotide sequence, and capital letters below the nucleotide sequence are the corresponding encoded amino acid sequence; The initiation codon (atg) and the stop codon (taa) are shown in bold; The underlined parts represent the seven transmembrane domains (TMs)

2.3 OsOARβ2R在不同組織/器官、不同饑餓時(shí)間及不同胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平

QRT-PCR結(jié)果顯示: 在成體10個(gè)組織/器官中,均有表達(dá), 在后唾液腺中的表達(dá)水平最高, 其次是腦和小腸(圖5)。饑餓對(duì)中華蛸幼體的存活、體態(tài)和游動(dòng)行為有顯著的影響。隨著饑餓時(shí)間的增加, 饑餓第3天時(shí), 中華蛸體色變淺, 趨光性變?nèi)? 部分沉入桶底。至饑餓第5天, 出現(xiàn)體色發(fā)白, 絕大多數(shù)死亡的現(xiàn)象; 在幼體饑餓實(shí)驗(yàn)中, 隨著饑餓時(shí)間的推移,的表達(dá)水平在饑餓2 d后顯著降低, 緊接著在饑餓3 d時(shí)表達(dá)水平顯著升高, 且表達(dá)水平達(dá)到最高, 之后表達(dá)水平開始回落(圖6)。在中華蛸整個(gè)胚胎發(fā)育周期中均可檢測(cè)到, 且在多細(xì)胞期表達(dá)水平最高, 后顯著下降, 黑珠期顯著高于紅珠期及初孵幼體(圖7)。

表2 OAR多重比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析所用到的物種

不同的字母表示差異顯著, 下同

Different letters indicate a significant difference at<0.05, the same below

3 討論

本研究克隆了, 該序列編碼385個(gè)氨基酸, 包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。已知G蛋白偶聯(lián)受體7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)分別扮演不同的功能, TM1參與受體的構(gòu)象活化過程及與配基的結(jié)合; TM2影響G蛋白的偶聯(lián)和信號(hào)的產(chǎn)生; TM3在受體的活化、磷酸化、結(jié)構(gòu)的完整性、表達(dá)等方面發(fā)揮重要的作用; TM4參與配基結(jié)合和信號(hào)傳遞; TM5對(duì)受體組裝、表達(dá)和信號(hào)產(chǎn)生有一定影響; TM6參與受體的表達(dá)及其與配基的結(jié)合; TM7對(duì)配基的傳遞和信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生一定的影響[10]。中華蛸OARβ2R跨膜結(jié)構(gòu)TM3、TM5、TM6、TM7相對(duì)保守, 推測(cè)具有識(shí)別配體, 激活G蛋白的功能?？缒そY(jié)構(gòu)域TM4最不保守, 其可能與識(shí)別不同的G蛋白如Gi與Gq蛋白有關(guān)。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示,OARβ2R與加州雙斑蛸的OAR的一致性達(dá)81.50%; 系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示,OARβ2R與軟體動(dòng)物門的加州雙斑蛸聚為一支, 再與軟體動(dòng)物門的其他物種聚為一大支, 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與傳統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系一致, 這些結(jié)果充分表明本研究所得到的基因序列為。

蔡英亞等[16]認(rèn)為八腕目的唾液腺有分泌蛋白酶和淀粉酶等各種消化酶及蛋白毒素的功能; 長(zhǎng)蛸()的唾液腺能夠分泌具有黏合食物、潤(rùn)滑消化道的黏多糖, 同時(shí)能夠分泌消化酶及毒素[17]。中華蛸雌蛸的護(hù)卵行為是卵孵化率較高的前提保證, 其護(hù)卵行為使受精卵免受病、敵害的侵害, 在無(wú)雌蛸的看護(hù)下, 密集的卵群易遭受病、敵害如水霉菌、原生動(dòng)物和橈足類等的侵襲[18]。章魚胺與OAR控制著昆蟲的許多生理行為, 過高的章魚胺濃度影響著昆蟲的正常生理行為, 達(dá)到驅(qū)殺的目的[11]; 章魚胺與OAR也參與厚殼貽貝()的免疫反應(yīng)[14]。熒光定量PCR結(jié)果顯示,在10個(gè)組織/器官中均有表達(dá), 在后唾液腺中的表達(dá)水平顯著高于其他組織, 據(jù)此推測(cè)中華蛸唾液蛋白毒素中章魚胺含量較高, 護(hù)卵雌蛸分泌唾液保護(hù)受精卵免遭病、敵害的侵襲。

本實(shí)驗(yàn)中, 饑餓對(duì)中華蛸幼體的存活有顯著的影響。饑餓第3天, 中華蛸體色變淺, 趨光性變?nèi)? 部分沉入桶底, 至饑餓第5天, 出現(xiàn)體色發(fā)白, 絕大多數(shù)死亡的現(xiàn)象, 因此, 幼體不可逆點(diǎn)為饑餓后第3天,的表達(dá)水平可作為幼體代謝是否正常的一個(gè)指標(biāo)。

在中華蛸幼體饑餓實(shí)驗(yàn)中, 隨著饑餓時(shí)間的推移,的表達(dá)水平在饑餓2 d后顯著降低, 緊接著在饑餓3 d時(shí)表達(dá)水平顯著升高, 且表達(dá)水平達(dá)到最高, 之后表達(dá)水平開始回落。這一趨勢(shì)與課題組先前關(guān)于饑餓后中華蛸幼體中的糖酵解基因、和脂肪代謝基因、、[19]及[20]的相關(guān)表達(dá)結(jié)果一致。OAR作為典型的G蛋白偶聯(lián)受體, 參與機(jī)體的眾多生命代謝活動(dòng), 推測(cè)OAR參與了饑餓條件下幼體的糖酵解及脂質(zhì)代謝過程, 在維持機(jī)體生命活動(dòng)的過程中起重要作用。

本次試驗(yàn)是在有母蛸護(hù)卵的情況下進(jìn)行的。不同的胚胎發(fā)育時(shí)期表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果表明:在中華蛸整個(gè)發(fā)育周期均可檢測(cè)到, 且在多細(xì)胞期表達(dá)水平最高, 后顯著下降, 黑珠期顯著高于紅珠期及初孵幼體。詹萍萍等[21]研究長(zhǎng)蛸胚胎發(fā)育可溶性蛋白中發(fā)現(xiàn), 可溶性蛋白含量隨著長(zhǎng)蛸胚胎的發(fā)育逐漸減少。在多細(xì)胞期時(shí), 需要大量的活性蛋白以滿足機(jī)體細(xì)胞分裂與分化,在加工與修飾蛋白維持機(jī)體發(fā)揮很大的作用, 因此, 表達(dá)水平最高; 伴隨機(jī)體發(fā)育, 從紅珠期開始, 胚胎已發(fā)育出的各種組織與器官[22-24], 能滿足基本的物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng), 表達(dá)水平顯著下降。在黑珠期胚胎發(fā)生一次反轉(zhuǎn)[22], 需要消耗較多的能量, 黑珠期表達(dá)水平顯著高于紅珠期及初孵幼體。

生產(chǎn)中作者發(fā)現(xiàn), 在中華蛸受精卵孵化過程中, 在紅珠期前, 沒有雌蛸護(hù)卵的受精卵會(huì)腐爛死亡, 有護(hù)卵的則能正常發(fā)育, 而從紅珠期后母蛸有沒有護(hù)卵, 受精卵均能正常孵出。推測(cè)在紅珠期前, 需由母蛸唾液中的章魚胺來維持幼體表達(dá)在正常的水平范圍內(nèi), 母蛸唾液中的章魚胺使受精卵不但可以抵御病原生物的侵襲, 同時(shí)也維持胚胎的正常代謝及發(fā)育, 從紅珠期開始, 胚胎發(fā)育已形成幼體雛形, 胚胎自身可產(chǎn)生的足夠量的章魚胺以抵御病原生物的侵襲, 有無(wú)雌蛸護(hù)卵均可正常發(fā)育。不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)水平的變化, 將為今后無(wú)雌蛸護(hù)卵的受精卵孵化技術(shù)的研究提供一個(gè)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Cloning and expression analysis ofgene from

XIAO Yi-zhe1, CHEN Xiao-ling2, SUN Yu-long3, ZHANG Zi-ping3, WANG Yi-lei2, ZHU You-fang1

(1. Putian Municipal Institute of Fishery Science, Putian 351100, China; 2. Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China; 3. College of Animal Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

To understand the mechanism of hatching and larval development in, we cloned itsgene and performed a bioinformatics analysis. Meanwhile, the expression ofin different tissues/organs after different periods of starvation in newly hatched larvae and at different stages of embryonic development was analyzed. The results revealed that the open reading frame ofis 1158 bp long, encodes 385 amino acids, and contains 7 transmembrane domains (TMs), which have commonality with G protein-coupled receptors. Among the TMs, TM3, TM5, TM6, and TM7 are relatively conserved. According to the amino acid homology comparison and phylogenetic tree analysis,OARβ2R shares the highest identity with the OAR of. The results of quantitative polymerase chain reaction revealed that the expression ofwas widespread in the 10 examined tissues/organs, with the highest expression level in the posterior salivary gland, followed by the brain and intestine. In the larval starvation experiment, the expression ofdecreased significantly after 2 days of starvation; increased significantly, reaching a peak at 3 days of starvation; and then declined to normal levels.could be detected throughout the embryonic development cycle, and its expression level was the highest at the multicellular stage, decreasing significantly thereafter.expression was also significantly higher in the black-bead stage than in the red-bead stage and in newly hatched larvae. These results provide basic data for studying the hatching and larval development mechanisms of fertilizedeggs and for improving the efficiency of artificial seeding with.

;, starvation; embryonic development

Dec. 27, 2021

Q785; S968.3

A

1000-3096(2022)09-0109-08

10.11759/hykx20211227003

2021-12-27;

2022-05-08

中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)(020L3011); 福建省科技廳項(xiàng)目(2021S21010093); 莆田市科技局項(xiàng)目(2020NJJ005)

[Special Funds Provided by the Ministry of Science and Te-ch-nology of the People’s Republic of China to Guide the Development of Science and Technology in Fujian Province, No. 2020L3011; The Project of Department of Science and Technology of Fujian Province, No. 2021S21010093; The Project of Putian Science and Technology Bureau of Fujian Province, No. 2020NJJ005]

肖懿哲(1964—), 男, 福建莆田人, 本科, 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)工作, 電話: 0594-6298821, E-mail: yzxiaoxyz@163.com; 朱友芳(1964—),通信作者, 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖及病害防治研究, E-mail: e365cn@163.com

(本文編輯: 譚雪靜)