林瓊妮，陳艾霖，劉嘉怡，林玉鋒，周春霞，2*

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室（湛江），廣東 湛江 524088）

β-胡蘿卜素是親脂性色素，是一種可預(yù)防癌癥和心血管疾病的高效抗氧化劑[1]。然而β-胡蘿卜素含有不飽和共軛雙鍵，穩(wěn)定性差，易受到紫外線、高溫和有氧環(huán)境的影響而降解[2]，其溶解性低和細胞滲透性差等也會導(dǎo)致人體吸收利用低，嚴重限制了其在食品加工中的應(yīng)用。如何提高β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性及生物利用率是其應(yīng)用過程中亟待解決的問題。水包油乳液體系能夠隔絕氧氣，保護色素免受降解，同時可以提高親脂性物質(zhì)的生物利用率。蛋白質(zhì)和變性淀粉等大分子乳化劑穩(wěn)定的乳液均表現(xiàn)出良好的抗氧化特性[3-4]。吐溫20、辛烯基琥珀酸酯、乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）等乳化劑通過高壓均質(zhì)制備的β-胡蘿卜素納米乳液穩(wěn)定性好，且WPI納米乳液中β-胡蘿卜素的降解最慢[5]，WPI也可以體外調(diào)節(jié)β-胡蘿卜素的生物利用率[6]。羅非魚分離蛋白（tilapia protein isolate，TPI）是一種氨基酸種類齊全，易于消化吸收的優(yōu)質(zhì)蛋白，但因其溶解性和穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致了其乳化活性和乳化穩(wěn)定性都較差，因此TPI在食品乳液中的應(yīng)用極少[7]。

研究表明，混合蛋白可避免單一蛋白的營養(yǎng)不足，提高體系的溶解性、穩(wěn)定性和營養(yǎng)價值[8]。與單一蛋白乳液相比，復(fù)合蛋白乳液作為一種遞送體系在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抵抗環(huán)境壓力方面更具優(yōu)勢，對所包埋的生物活性物質(zhì)具有一定的控釋能力、對敏感的親脂性活性成分具有更好的保護作用[3]。以酪蛋白酸鈉與乳鐵蛋白包埋ω-3脂肪酸制備的復(fù)合乳液具有良好的物理穩(wěn)定性，比單純用酪蛋白酸鈉為乳化劑制備的乳液氧化穩(wěn)定性有明顯改善[9]。復(fù)合蛋白乳液相對于單一蛋白乳液更適用于生物活性物質(zhì)在人體消化道內(nèi)的釋放和吸收[10]。此外，乳液的穩(wěn)定性還與蛋白質(zhì)的酸堿處理及熱處理等有關(guān)。熱處理后混合蛋白的二硫鍵含量增多、疏水性增強[11]，用大豆蛋白和多糖制備的O/W乳液在熱處理后貯藏穩(wěn)定性顯著提高[12]。在體外消化試驗中，通過熱處理制備的乳清蛋白微凝膠穩(wěn)定的高內(nèi)相乳液可以增加β-胡蘿卜素的生物利用度[13]。在強堿條件下（pH12.0）處理的雙蛋白復(fù)合物會經(jīng)歷顯著的構(gòu)象變化，使其具有平衡的氨基酸組成和優(yōu)良的溶解性[14]，Wang等[15]將大米蛋白和大豆蛋白于堿性條件下（pH12.0）溶解1 h后調(diào)至中性，其溶解性大大提高。因此，堿處理和（或）熱處理可以提高乳液的穩(wěn)定性。為此，本研究充分利用雙蛋白的營養(yǎng)和功能特性優(yōu)勢，以單一蛋白（TPI、WPI）和混合蛋白作為乳化劑，高壓均質(zhì)制備負載β-胡蘿卜素的復(fù)合蛋白乳液并對其進行熱處理，研究乳液穩(wěn)定性、抗氧化性及生物利用率，為β-胡蘿卜素的穩(wěn)態(tài)化研究及其功能乳液的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活羅非魚：市售；食品級乳清分離蛋白（蛋白質(zhì)含量88.26%）：天津米爾凱威進出口有限公司；β-胡蘿卜素標品（HPLC≥90%）、胃蛋白酶（15 000 U/mg）、脂肪酶（30 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二銨鹽 [2，2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：上海阿拉丁生物科技有限公司；。

1.2 儀器與設(shè)備

PH S-3C精密pH計：上海雷磁儀器廠；TU-20HT恒溫水浴鍋：英國Bibby Scientific公司；UV-2550型紫外分光光度計：日本島津公司；Avanti J-26sxp高速冷凍離心機：美國Beckman公司；NS810分光測色儀：深圳市三恩時科技有限公司；T18高速剪切分散均質(zhì)機：德國IKA公司；FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡：日本Olympus公司；NanoBrook Omni激光粒度儀：美國布魯克海文儀器公司；AH-NANO超高壓均質(zhì)機：鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚分離蛋白的提取

取羅非魚背部白肉攪碎，按料液比1∶9（g/mL）與冰蒸餾水混合均質(zhì)2 min，pH值調(diào)至11.0，渦旋30 min后離心（10 000 r/min，20 min，4℃），將上清液 pH 值調(diào)至 5.5，再離心（10 000 r/min，20 min，4℃），取沉淀加冰水分散，調(diào)節(jié)pH7.0，透析后冷凍干燥備用。TPI的粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為（90.05±0.39）%。

1.3.2 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的制備

參照Cornacchia等[4]的方法并稍作修改。稱取不同質(zhì)量比（2∶1、1∶1、1∶2）的 TPI與 WPI分別配制成1 g/100 mL蛋白水溶液，攪拌2 h后，在堿性條件（pH11.0）下攪拌 1 h后調(diào)回中性條件（pH7.0），添加0.2 g/100 mL β-胡蘿卜素于玉米油中，將水相與油相按9∶1混合，于12000r/min下均質(zhì)分散2min，再用高壓均質(zhì)機于60MPa的條件下均質(zhì)循環(huán)5次。將制備的乳液于65℃加熱處理30min，取出冷卻至室溫并貯藏于4℃。乳液避光及低溫（4℃）貯藏，以防β-胡蘿卜素降解。

1.3.3 乳液粒徑與電位的測定

乳液粒徑與電位的測定參照Guan等[1]的方法并稍作修改。為了避免多重散射效應(yīng)，先用蒸餾水將乳液稀釋300倍并搖勻，以確保樣品均勻分散，利用激光粒度儀及zeta電位儀測定其粒徑和電位。每個樣品至少測定3次，并取平均值。

1.3.4 乳液中β-胡蘿卜素保留率的測定

參照馮鑫等[16]測定β-胡蘿卜素標準曲線的方法，用正己烷配制 2 μg/mL～50 μg/mL 的 β-胡蘿卜素標準溶液，以正己烷為空白，于450 nm測定其吸光值，并繪制標準曲線。

β-胡蘿卜素保留率的測定：每個樣品取0.5 mL，依次加入2.0 mL無水乙醇和3.0 mL正己烷，渦旋后靜置10 min，將上層的正己烷吸出、收集于比色管中。再添加3.0 mL正己烷重復(fù)上述操作，將提取物合并，使體積達10 mL。于450 nm處測定吸光值。用β-胡蘿卜素標準曲線算出β-胡蘿卜素的含量，由公式（1）計算β-胡蘿卜素的保留率。

式中：Ct為貯藏時間t時乳液的β-胡蘿卜素的含量，μg/mL；C0為乳液中β-胡蘿卜素的初始含量，μg/mL。

1.3.5 乳液抗氧化活性的測定

參照Guan等[1]的方法進行DPPH自由基清除能力的測定。以0.125 mmol/L的乙醇溶液配制DPPH溶液。取1 mL樣品溶液和1 mL的DPPH溶液混合后離心，將混合物在黑暗中孵育30 min，于517 nm處測量吸光值并記為AE；取1 mL乙醇和1 mL的DPPH溶液混合，按上述操作并記為AD。DPPH自由基清除率按公式（2）計算。

參照陳雨桐[17]的方法進行ABTS+自由基清除能力的測定。將新制的ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀混合，黑暗中放置16 h后稀釋10倍備用。將0.1 mL樣品與3 mL稀釋的ABTS溶液混合后在黑暗中孵育10 min后，在734 nm處測量吸光度并記為AS。用蒸餾水代替樣品測定空白并記為AW。ABTS+自由基清除率按公式（3）計算。

1.3.6 乳液中游離脂肪酸釋放率的測定

乳液中游離脂肪酸釋放率的測定參照Gomes等[2]的體外消化方案并稍作修改。胃消化階段：取15 mL乳液加入15mL胃蛋白酶液（含2mg/mLNaCl、7mL/LHCl、0.32 mg/mL胃蛋白酶），用1.0 mol/L HCl或1.0 mol/L NaOH調(diào)pH2.0然后在37℃水浴反應(yīng)2 h。腸消化階段：將胃反應(yīng)液用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH7.0后加入3.5 mL 54 mg/mL的豬膽鹽提取物后加入1.5 mL鹽溶液（含 10 mmol/L CaCl2和 150 mmol/L NaCl），用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH7.0后加入2.5 mL胰脂肪酶液（用0.1 mol/L磷酸緩沖溶液配制成75 mg/mL），在37℃水浴加熱，記錄在 30、60、90、120 min 時維持 pH7.0 所消耗的氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L）體積，從而測定其游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）釋放率，按公式（4）進行計算。

式中：V為中和產(chǎn)生的游離脂肪酸所需氫氧化鈉溶液的體積，mL；m為氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L；W為初始脂質(zhì)的總質(zhì)量，g；M為玉米油的摩爾質(zhì)量濃度，g/mol。

1.3.7 β-胡蘿卜素生物利用率的測定

乳液按照1.3.6進行胃、腸模擬消化后，得到消化液，將消化液離心后得到膠束液。用注射器將膠束層取出并通過0.22 μm的濾膜過濾，測定膠束層的β-胡蘿卜素含量，使用1.3.4中測定β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度的方法測定膠束中β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度，并通過公式（5）計算β-胡蘿卜素納米乳液經(jīng)消化后的生物利用率。

式中：C1為乳液中β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度，μg/mL；C2為膠束中β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.3.8 熒光顯微鏡觀察

“雙主體”。現(xiàn)代學(xué)徒制構(gòu)建的是以“學(xué)校本位”和“企業(yè)本位”相結(jié)合的“雙主體”人才培養(yǎng)模式，學(xué)校與企業(yè)共同承擔(dān)育人責(zé)任，共同承擔(dān)風(fēng)險、共同培養(yǎng)人才。

參照陳恩民[18]的方法并稍作修改，利用熒光顯微鏡對5種乳液的微觀形態(tài)進行觀察。采用尼羅藍染色液對乳液中的蛋白質(zhì)染色，尼羅紅染色液對乳液中的油滴染色，分別在激發(fā)波長633 nm、檢測波長618 nm～710nm以及激發(fā)波長488nm、檢測波長580nm～620nm的激光下觀察。取30 μL乳液與10 μL尼羅紅染液和10 μL尼羅藍染液混合均勻，在暗處反應(yīng)15 min后取10 μL混合液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，在100倍油鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗重復(fù)3次以上取平均值，利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯著性分析使用Duncan多重檢驗（P＜0.05代表有統(tǒng)計學(xué)意義的水平），圖形均采用Origin 9.0軟件繪制，所有結(jié)果均為3個樣本的平均值±標準差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的粒徑

粒徑是衡量乳液穩(wěn)定的重要性能指標，乳液粒徑越小，乳化效果越好，乳液穩(wěn)定性越好[16]。圖1所示為負載β-胡蘿卜素的乳液粒徑隨貯藏時間的變化。

圖1 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液粒徑隨貯藏時間的變化Fig.1 Changes in the particle size of TPI-WPI composite emulsion loaded with β-carotene with storage time

由圖1可知，乳液粒徑均隨貯藏時間的延長而增大，是因為隨著貯藏時間的延長，液滴間相互碰撞的概率變大，液滴發(fā)生聚集，粒徑增大[5]。對比5種乳液，負載β-胡蘿卜素的TPI乳液初始粒徑最大（P＜0.05），為（491.74±0.01）nm，4℃貯藏21 d其平均粒徑增加幅度也最明顯，表明TPI乳液不穩(wěn)定，乳液液滴在重力作用以及布朗運動作用下聚集速度快，在一定程度上加速了液滴的快速絮凝[19]。TPI-WPI混合蛋白構(gòu)建的負載β-胡蘿卜素復(fù)合乳液粒徑比TPI乳液粒徑小，表明WPI的添加有利于提高乳液體系的穩(wěn)定性，TPI-WPI復(fù)合抑制液滴聚集的空間位阻作用，降低了碰撞頻率，液滴不易聚集[20]；且隨著混合蛋白體系中WPI比例的增加，復(fù)合乳液的粒徑減小，表明WPI在油水界面的吸附能力更強，穩(wěn)定油滴的能力更強[21]，因為熱處理會使蛋白質(zhì)發(fā)生亞基的解離和分子的伸展，蛋白質(zhì)與油滴結(jié)合作用會增強[22]，使得液滴粒徑減小，穩(wěn)定性增強。因此，當(dāng)TPI與WPI質(zhì)量比為1∶2時，以混合蛋白為乳化劑構(gòu)建的β-胡蘿卜素復(fù)合蛋白乳液的粒徑小，液滴聚集速度慢，體系穩(wěn)定性較好。

2.2 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的電位

電位是乳液的重要物理性質(zhì)，乳液體系的靜電相互作用反映乳液體系的電位穩(wěn)定性。zeta電位與溶液中顆粒表面的電勢有關(guān)，表面電勢絕對值越大，靜電排斥作用越強，顆粒對聚集的抵抗力越大，乳液的穩(wěn)定性越好[1]。負載β-胡蘿卜素的復(fù)合乳液的zeta電位見圖2。

圖2 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的zeta電位Fig.2 The zeta potential of TPI-WPI composite emulsions loaded with β-carotene

如圖2所示，所有的乳液電位均呈負值，表明蛋白質(zhì)經(jīng)均質(zhì)和熱處理后分子表面帶凈負電荷。在本試驗條件下，乳液pH值為7.0，高于蛋白質(zhì)的等電點（4.0～5.5）[9，19]，蛋白質(zhì)分子帶負電荷。

5種乳液比較而言，TPI乳液表面電位的絕對值最小，為（21.94±0.46）mV（P＜0.05），乳液顆粒之間電荷的相互作用小，油滴之間的靜電排斥作用不足以克服范德華力和疏水吸引力，使界面蛋白吸附層對TPI的靜電共吸附減弱，從而導(dǎo)致油滴聚集，難以維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，粒徑較大，乳液不穩(wěn)定[20]，與粒徑檢測結(jié)果一致。以混合蛋白為乳化劑構(gòu)建的β-胡蘿卜素復(fù)合乳液電位絕對值明顯大于TPI乳液的電位絕對值（P＜0.05），zeta電位絕對值提高，油滴的表面電荷增大，混合蛋白經(jīng)過高壓均質(zhì)處理后蛋白質(zhì)的構(gòu)象會更加穩(wěn)定，蛋白顆粒減小而更容易折疊，并且能快速在油-水界面上達到穩(wěn)定，這有助于增加液滴間的排斥作用并防止液滴聚集，提高體系的穩(wěn)定性[20]。隨著混合蛋白WPI比例的增加，乳液體系的電位絕對值增大（P＜0.05），主要是因為WPI為乳液顆粒間提供了相對較強的電荷排斥作用，顆粒不易聚集，乳液較為穩(wěn)定[2]。TPI與WPI質(zhì)量比為1∶2時，負載β-胡蘿卜素的復(fù)合乳液表面電位絕對值達（28.23±0.56）mV，比其他質(zhì)量比的混合蛋白（TPI∶WPI=1∶1 或 2∶1）乳液空間位阻更大，有效降低乳液液滴的活動性，碰撞頻率更小，液滴聚集速度更慢，液滴更小，乳液更穩(wěn)定[4]。

2.3 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的直觀圖及β-胡蘿卜素保留率

圖3 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的直觀圖Fig.3 Pictorial image of TPI-WPI composite emulsion loaded with β-carotene

如圖3（a）和 3（b）所示，貯藏時間延長乳液顏色明顯變淺，說明β-胡蘿卜素在貯藏過程中有降解。TPI乳液穩(wěn)定性較差，貯藏21 d后底部明顯析出了水層，乳液分層快慢與乳液液滴大小有關(guān)，乳液粒徑的大小影響乳液的絮凝和聚集，粒徑越大，聚集和絮凝越快，乳液越容易分層；WPI乳液中β-胡蘿卜素明顯破乳，出現(xiàn)色素漂浮的現(xiàn)象，說明乳清分離蛋白的親脂性不高，對脂溶性生物活性物質(zhì)β-胡蘿卜素的負載能力不強；而混合蛋白（TPI∶WPI=2∶1、1∶1、1∶2）乳液在貯藏21 d后均無水層析出和色素漂浮等相分離現(xiàn)象，可能是由于混合蛋白中WPI的添加會提高乳液的穩(wěn)定性，且TPI親脂性高于WPI，負載β-胡蘿卜素的能力更強，因此不會出現(xiàn)水層析出以及色素漂浮的現(xiàn)象，表明 3 種質(zhì)量比（TPI∶WPI=2∶1、1∶1、1∶2）的混合蛋白乳液體系比較穩(wěn)定且能較好地保護色素。

β-胡蘿卜素對光和氧非常敏感，而乳液的特定結(jié)構(gòu)可以在一定程度上阻止分子氧與β-胡蘿卜素的接觸，提高β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性。將乳液在4℃貯藏21 d，檢測5種乳液在貯藏期間β-胡蘿卜素的保留率，結(jié)果見圖4。

圖4 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的實物圖及β-胡蘿卜素的保留率Fig.4 Retention rate of β-carotene and visual image of TPI-WPI composite emulsion loaded with β-carotene

由圖4可知，5種蛋白乳液中β-胡蘿卜素的保留率均隨貯藏時間的延長而下降，但貯藏21 d后乳液中β-胡蘿卜素的保留率均大于40%。乳液中的蛋白質(zhì)經(jīng)熱處理后結(jié)構(gòu)會展開，其構(gòu)象會發(fā)生重排，且混合蛋白經(jīng)堿處理后表面疏水性也會增強[11]，因此脂溶性β-胡蘿卜素的保留能力會得到提高。比較分析發(fā)現(xiàn)，貯藏5 d～21 d，WPI乳液體系中β-胡蘿卜素的保留率最低，可能是因為WPI表面親水基團的比例較高[6]，而β-胡蘿卜素為脂溶性色素，與親水基團較多的乳化劑結(jié)合能力更弱，因此β-胡蘿卜素降解更快。在貯藏3 d后，復(fù)合蛋白乳液中β-胡蘿卜素的保留率明顯高于WPI乳液中β-胡蘿卜素的保留率（P＜0.05），這是因為混合蛋白中的TPI是通過極端堿性條件提取的，表面疏水性增大[24]，親脂性增強，保留β-胡蘿卜素的能力更強。且隨著混合蛋白中TPI比例的增加，復(fù)合乳液中β-胡蘿卜素的保留率提高，魚蛋白在一定程度上可抑制β-胡蘿卜素降解，能夠起到保護油滴的作用，與β-胡蘿卜素形成復(fù)合物，保護β-胡蘿卜素免于降解[25]。因此，從色素穩(wěn)定性的角度分析，當(dāng)TPI與WPI按2∶1混合時，復(fù)合乳液對β-胡蘿卜素的保護效果更好。

2.4 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的抗氧化活性

β-胡蘿卜素的抗氧化活性在制備過程中會下降或消失，進而導(dǎo)致其生物利用率降低，因此，研究TPIWPI混合蛋白對β-胡蘿卜素活性的影響具有重要意義。不同抗氧化方法的測定原理不同，單一的測定方法無法準確地評定物質(zhì)的抗氧化活性。因此本試驗采用兩種方法來評價β-胡蘿卜素的抗氧化活性。DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率均是比較靈敏的方法之一，都是通過測定樣品清除自由基后吸光度的變化來評測樣品的抗氧化能力[14]。負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液抗氧化活性的變化見圖5。

圖5 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液抗氧化活性的變化Fig.5 Changes in the antioxidant activity of TPI-WPI composite emulsion loaded with β-carotene

由圖5可知，在貯藏21 d后，DPPH自由基清除能力及ABTS+自由基清除能力減弱，乳液負載的β-胡蘿卜素有所損失，抗氧化活性降低，表明β-胡蘿卜素隨著貯藏時間的延長而降解。其中，WPI乳液貯藏21 d后，其 DPPH 自由基清除率為（41.23±0.62）%，ABTS+自由基清除率僅有（27.56±1.07）%，反映了β-胡蘿卜素在WPI乳液中降解更快，其測定結(jié)果與β-胡蘿卜素的保留率一致，可能是因為WPI表面親水基團的比例較高，親脂性較弱，而β-胡蘿卜素為脂溶性色素，兩者的結(jié)合能力較弱，β-胡蘿卜素不能得到很好的保護，因此降解更快，抗氧化活性更弱。而負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率變化較為緩慢，貯藏21 d后其自由基清除率顯著高于WPI乳液（P＜0.05），說明混合蛋白對β-胡蘿卜素的保護作用比單一WPI更強，與乳液中β-胡蘿卜素保留率的變化趨勢一致，因為TPI親脂性能力更強，對β-胡蘿卜素的保留能力更強，β-胡蘿卜素降解程度更低[24]，因此其對DPPH自由基和ABTS+自由基清除率更高，乳液抗氧化活性更強。當(dāng)TPI與WPI的質(zhì)量比為2∶1時，負載β-胡蘿卜素的復(fù)合乳液貯藏21 d后DPPH 自由基清除率達到（48.52±0.08）%、ABTS+自由基清除率達到（40.11±0.57）%，比其他質(zhì)量比的混合蛋白（TPI∶WPI=1∶1、1∶2）乳液的 DPPH 自由基率、ABTS+自由基清除率更強，抗氧化活性更高，負載β-胡蘿卜素的能力更出色，β-胡蘿卜素能夠得到更好的保護。

2.5 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的游離脂肪酸釋放率

在乳液體系中，油-水界面上蛋白質(zhì)分子吸附形成吸附膜，而蛋白的組成會影響胰脂肪酶與油滴界面的接觸，從而影響油脂的消化[6]。在體外模擬胃腸道消化過程中，胰脂肪酶將乳液中的甘油三酯分解生成大量的甘油二酯、甘油一酯和游離脂肪酸[26]，加入氫氧化鈉中和游離脂肪酸，將體系維持在中性的環(huán)境，比較單一蛋白（TPI、WPI）和混合蛋白（TPI∶WPI=2∶1、1∶1、1∶2）對乳液脂肪消化、β-胡蘿卜素運載以及消化吸收的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的游離脂肪酸釋放率Fig.6 Release rate of free fatty acids of TPI-WPI composite emulsion loaded with β-carotene

由圖6可知，經(jīng)過胃和小腸階段的體外模擬消化后，5種乳液的消化速率和游離脂肪酸釋放率大小順序一致，為 TPI-WPI（1∶0）＞TPI-WPI（2∶1）＞TPI-WPI（1∶1）＞TPI-WPI（1∶2）＞TPI-WPI（0∶1）。WPI相對于TPI界面吸附膜在消化過程中形成的多肽甚至更小的肽段更多，液滴發(fā)生了聚集，減小了油脂的總表面積[27]，導(dǎo)致游離脂肪酸釋放率更低。WPI乳液中β-胡蘿卜素被包裹在高電荷穩(wěn)定的體系中，阻斷了與消化液的接觸，導(dǎo)致消化率降低[28]。與WPI乳液比較，混合蛋白（TPI∶WPI=2∶1、1∶1、1∶2）乳液游離脂肪酸釋放率更高，可能是因為TPI易消化的特點，也使其更容易被胃蛋白酶解離為肽，具有更高的水解性。且隨著混合蛋白體系中TPI比例的增加，游離脂肪酸釋放率增大，可能是因為隨著液滴大小的增加，在含有大油滴的乳液中，每單位液滴表面積吸附的脂肪酶分子可能比含有較小油滴的多，可用的脂肪酶數(shù)量增加，構(gòu)建的乳液體系能更加有效地提高油脂的消化速率[29]。

2.6 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的生物利用率

乳液體系所包埋的脂溶性生物活性物質(zhì)功能因子，在模擬腸消化的階段中，玉米油被水解，包埋在乳液中的生物活性物質(zhì)功能因子會連續(xù)不斷地從玉米油中釋放出來，并溶解在膽汁鹽膠束中，進而被小腸吸收[7]，有研究表明像β-胡蘿卜素這種脂溶性生物活性物質(zhì)以膠束的形式被人體小腸攝取、轉(zhuǎn)運、吸收是必不可少的步驟[10]。消化過程中TPI-WPI復(fù)合乳液在胃階段時界面蛋白開始水解，經(jīng)小腸消化后油脂開始水解，β-胡蘿卜素暴露出來，從而可被人體所吸收。負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液中β-胡蘿卜素的生物利用率見圖7。

圖7 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液中β-胡蘿卜素的生物利用率Fig.7 Bioavailability of β-carotene in TPI-WPI composite emulsion loaded with β-carotene

由圖7可知，TPI、TPI-WPI（2∶1）、TPI-WPI（1∶1）、TPI-WPI（1∶2）、WPI構(gòu)建的乳液中β-胡蘿卜素的生物利用率分別為（33.25±0.24）%、（27.93±0.22）%、（27.54±0.32）%、（24.76±1.14）%、（20.89±0.72）%。有研究表明，膽鹽等可與原有乳化劑發(fā)生競爭性取代后吸附在乳滴表面，從而影響脂溶性活性物質(zhì)膠束的形成[30]。TPI乳液包埋的β-胡蘿卜素具有較高的生物利用率，是因為在消化過程中魚蛋白可被消化液中各種消化酶酶解成多肽，減小了界面層的厚度，更易于發(fā)生競爭吸附，被油脂、膽鹽等替換[25]。隨著混合蛋白體系中TPI比例的增加，復(fù)合蛋白乳液中β-胡蘿卜素的生物利用率提高，游離脂肪酸的水解程度與生物活性物質(zhì)的生物利用率呈正相關(guān)，體系中膠束的形成與體系中脂肪水解的程度有關(guān)，脂肪水解程度越高，體系中膠束越容易形成，β-胡蘿卜素生物利用率越高。當(dāng)TPI與WPI的質(zhì)量比為2∶1時，負載β-胡蘿卜素的復(fù)合蛋白乳液作為一種傳遞體系在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抵抗環(huán)境壓力方面更具優(yōu)勢，生物活性物質(zhì)與外界環(huán)境接觸機會減少，被包埋的生物活性物質(zhì)穩(wěn)定性提高，且對所包埋的生物活性物質(zhì)具有一定的控釋能力、對敏感的親脂性活性成分具有更好的保護作用，其生物利用率也會隨著提高。

2.7 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的微觀結(jié)構(gòu)

為便于觀察，使用尼羅紅染液對樣品中的油脂進行染色、尼羅藍染液對樣品中的蛋白質(zhì)進行染色后，利用熒光顯微鏡檢測的方法觀察油脂以及蛋白質(zhì)制成乳液后的情況，其結(jié)果如圖8所示，其中，紅色部分為油滴，綠色部分為蛋白質(zhì)。

圖8 負載β-胡蘿卜素的TPI-WPI復(fù)合乳液的形貌圖Fig.8 Morphology of TPI-WPI composite emulsion loaded with β-carotene

由圖8可知，液滴基本上都是呈現(xiàn)球形，且油滴被乳液蛋白質(zhì)包封[18]。TPI乳液液滴聚集，液滴呈簇狀，顆粒較大且不規(guī)則，表明TPI乳液不穩(wěn)定。隨著混合蛋白體系中WPI比例的增加，乳液顆粒變小，更加分散，蛋白質(zhì)的空間位阻較大，有效降低乳液液滴的活動性，減少碰撞合并的幾率，乳液呈現(xiàn)穩(wěn)定的狀態(tài)，且分散相表面覆蓋了致密的蛋白質(zhì)分子層，阻止了蛋白在乳液界面的有效伸展，表面的蛋白質(zhì)分子含量逐漸減少，蛋白質(zhì)吸附膜變薄[19]，因此觀察到的微觀圖顆粒更小，更加分散，與粒徑檢測結(jié)果一致。由此說明混合蛋白乳液相對于TPI乳液更有利于液滴的分散，乳液更加穩(wěn)定。當(dāng)TPI與WPI的質(zhì)量比為1∶2時，以混合蛋白為乳化劑構(gòu)建的β-胡蘿卜素的復(fù)合乳液顆粒更小，更加分散，由此進一步表明乳液的穩(wěn)定性好。

3 結(jié)論

本試驗比較單一蛋白（TPI、WPI）和混合蛋白（TPI∶WPI=2∶1、1∶1、1∶2） 作為乳化劑構(gòu)建的 β-胡蘿卜素復(fù)合蛋白乳液的穩(wěn)定性、抗氧化活性及體外消化速率。當(dāng)TPI與WPI的質(zhì)量比為1∶2時，負載β-胡蘿卜素的復(fù)合蛋白乳液粒徑最小（P＜0.05）、電位的絕對值最大（P＜0.05），形態(tài)顆粒越分散，物理穩(wěn)定性更高。當(dāng)TPI與WPI的質(zhì)量比為2∶1時，在模擬胃消化過程中具有較高的消化速率，在腸消化過程中更有利于消化，游離脂肪酸釋放率越高，且其乳液包埋β-胡蘿卜素的生物利用率更高，對疏水活性物質(zhì)具有更好的保護作用；貯藏21 d后，復(fù)合蛋白乳液對β-胡蘿卜素的保留率最高（P＜0.05），DPPH自由基清除能力及ABTS+自由基清除能力最大（P＜0.05），體系的抗氧化活性最強。研究結(jié)果為混合蛋白構(gòu)建穩(wěn)定的乳液體系及其活性成分的遞送提供了基礎(chǔ)。