夏 魏 聶 晶 李 鑫 李春霖 邵圣枝 李祖光 袁玉偉,*

(1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021；2 浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310014；3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；4 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

茶葉是用茶樹(shù)(Camelliasinensis)新鮮葉片經(jīng)過(guò)特殊加工工藝制成，屬于世界三大飲料之一[1]。因其富含多種有益于人體健康的活性成分和抗氧化物質(zhì)而廣受人們喜愛(ài)，如茶多酚、氨基酸及微量礦質(zhì)元素等[2]。茶葉的生產(chǎn)季節(jié)、采摘標(biāo)準(zhǔn)是評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)的重要因素[3]，而這與茶葉的葉位和成熟度密切相關(guān)。茶葉中穩(wěn)定性同位素碳同位素(δ13C)、氮同位素(δ15N)、氫同位素(δ2H)和氧同位素(δ18O)具有產(chǎn)地溯源特征，而關(guān)于茶樹(shù)葉片穩(wěn)定同位素隨葉位變化和時(shí)間變化的規(guī)律和特征尚不明確。

近些年，穩(wěn)定同位素技術(shù)已廣泛應(yīng)用于諸多農(nóng)產(chǎn)品研究中[4-5]，如蔬菜[6]、肉類(lèi)[7]、牛奶[8]、水果[9]等。該技術(shù)在茶葉中也有相關(guān)應(yīng)用，如鑒別不同產(chǎn)地[10]、不同品種[11]以及不同生產(chǎn)期[12-13]的茶葉。利用同位素技術(shù)區(qū)分不同國(guó)家的茶葉，如中國(guó)、印度和斯里蘭卡，也可用于小范圍的溯源研究，如不同省份及市級(jí)(地域間距小于200公里)[14]。除此之外，有研究報(bào)道葉片成熟度也是影響茶葉溯源鑒別的重要因素之一[11,15-16]。Liu等[11]對(duì)龍井茶的嫩葉與老葉進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)嫩葉中δ15N高于老葉。Xia等[13]對(duì)不同時(shí)期的嫩葉與成熟葉進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)嫩葉與成熟葉的同位素富集特征存在顯著差異。葉片是植物進(jìn)行光合作用合成有機(jī)物的主要場(chǎng)所，有機(jī)物的累積過(guò)程是形成茶葉品質(zhì)的重要階段[17]。茶葉中茶多酚類(lèi)物質(zhì)占葉片干重的20%～35%，由30種以上的酚類(lèi)物質(zhì)組成，是一種天然的抗氧化劑[18-20]。茶葉中氨基酸約占1%～4%，主要以茶氨酸、谷氨酸、天門(mén)冬氨酸和精氨酸為主。研究報(bào)道，葉片中茶多酚和氨基酸的合成會(huì)隨葉片不斷生長(zhǎng)而產(chǎn)生新的變化[21]。茶葉穩(wěn)定同位素的特征變化與葉片成熟度也存在一定相關(guān)性，如氮元素主要來(lái)源于根系的吸收，不同外源氮的同位素會(huì)直接導(dǎo)致植物體氮同位素的變化[11]。此外，在植物的生長(zhǎng)過(guò)程中，氮在植物體中經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)和分配會(huì)造成氮同位素豐度差異，有研究表明氮穩(wěn)定同位素與植物葉片的葉齡有關(guān)[22-23]。因此，茶葉采摘葉位和時(shí)間(季節(jié)和年份)的不同可能會(huì)影響其穩(wěn)定同位素變化，但茶葉穩(wěn)定同位素δ13C、δ15N、δ2H和δ18O隨葉位及時(shí)間的變化規(guī)律尚不明確。

本研究以茶葉為研究對(duì)象，利用穩(wěn)定同位素技術(shù)探究茶葉穩(wěn)定同位素δ13C、δ15N、δ2H和δ18O在不同葉位的分布及其隨時(shí)間變化特征，旨在進(jìn)一步明確茶樹(shù)不同葉位中穩(wěn)定同位素的分餾規(guī)律，為研究相關(guān)的分餾機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)茶葉樣本來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉科學(xué)研究所嵊州茶葉種植基地。茶樹(shù)品種為龍井43#。采樣時(shí)間為2019年8月9日、8月17日、8月31日、9月11日和9月27日。每次選取長(zhǎng)勢(shì)相近的10個(gè)枝條，從頂端向下分離10片葉子并依次進(jìn)行編號(hào)，共計(jì)10個(gè)樣本，如圖1所示。5次共采集50個(gè)不同葉位的茶葉樣本。

圖1 茶樹(shù)枝條10個(gè)葉位葉片樣本的編號(hào)示意圖

穩(wěn)定同位素比率分析采用國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)(International Atomic Energy Agency, IAEA，奧地利)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：CH-6(蔗糖，δ13CV-PDB=-10.449‰±0.033‰)，IAEA-600(咖啡因，δ13CV-PDB=-27.771‰± 0.043‰，δ15Nair= 1.0‰±0.2‰)，IAEA-601(苯甲酸，δ18OV-SMOW= 23.14‰±0.19‰)，IAEA-602(苯甲酸，δ18OV-SMOW= 73.35‰±0.39‰)，IAEA-N-2(硫酸銨，δ15Nair=20.3‰±0.2‰)，IAEA-CH-7(聚乙烯，δ2HV-SMOW=-100.3‰±2.0‰)；英國(guó)Elemental Microanalysis公司的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：B2203(δ2HV-SMOW=-25.3‰±1.1‰)、B2155(δ15NAir= 5.94‰±0.08‰)、B2174(δ13CV-PDB=-37.421‰±0.017‰)，進(jìn)行兩點(diǎn)法校正。氫氧化鈉(NaOH)和五氧化二磷(P2O5)購(gòu)自德國(guó)默克Supelco公司；玻璃碳、炭黑、氧化銅(CuO)、三氧化二鋁(Al2O3)、線(xiàn)狀還原銅、錫杯和銀杯(尺寸規(guī)格: 4 mm × 4 mm × 11 mm)購(gòu)自德國(guó)Elementar公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Vario PYRO cube元素分析儀、Isoprime 100型同位素比率質(zhì)譜儀，德國(guó)Elementar公司；SCIENTZ-10 N/A型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 樣本預(yù)處理

將鮮葉樣本置于-20℃條件下冷凍24 h，然后放入-60℃的冷凍干燥設(shè)備中干燥48 h，最后將干燥的樣本加入液氮研磨成粉，裝樣待測(cè)。

1.4 穩(wěn)定同位素比率檢測(cè)

1.4.1 碳、氮穩(wěn)定同位素測(cè)定 參照袁玉偉等[24]的方法，采用元素分析儀一穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜(elementary analyzer-stable isotope ratio mass spectrometers, EA-IRMS)測(cè)定茶葉δ13C和δ15N值。稱(chēng)取2.0～4.0 mg(響應(yīng)度為2～10 nA)樣品至錫箔杯中，包樣后將樣品置于元素分析儀中。樣品中的碳元素和氮元素分別轉(zhuǎn)化為純凈的CO2和N2氣體，再經(jīng)稀釋后進(jìn)入同位素質(zhì)譜儀檢測(cè)。具體參數(shù)：氧化爐和還原爐溫度分別為920和600℃，He吹掃流量230 mL·min-1；同位素質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)間550 s，參考?xì)鉃楦呒兌鹊腃O2和N2。

1.4.2 氫、氧穩(wěn)定同位素的測(cè)定 參照袁玉偉等[24]的方法，采用EA-IRMS測(cè)定茶葉δ18O和δ2H值。稱(chēng)取0.3～0.6 mg樣品于銀杯包好后置于元素分析儀中，經(jīng)燃燒爐產(chǎn)生的H2和CO進(jìn)入同位素質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。具體參數(shù)：He流量125 mL·min-1，燃燒爐溫度1 450℃；同位素質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)間950 s，參考?xì)鉃楦呒兌鹊腍2和CO。

1.4.3 穩(wěn)定同位素比率計(jì)算 由于自然界中重同位素自然豐度極低，導(dǎo)致試驗(yàn)儀器獲取的穩(wěn)定同位素比率值(R)極小。國(guó)際上，通常將已知同位素比率的標(biāo)準(zhǔn)品作為參照，計(jì)算未知樣本中穩(wěn)定同位素比率的相對(duì)值。計(jì)算公式為：

δ=[(R樣品/R標(biāo)準(zhǔn))-1]×1 000‰

(1)

式中，R樣品為所測(cè)樣品中重同位素與輕同位素的豐度比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)樣品中重同位素與輕同位素的豐度比[17]。

δ13CV-PDB采用IAEA穩(wěn)定同位素比率初級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品CH-6、IAEA-600進(jìn)行兩點(diǎn)法校正，δ15Nair采用IAEA-N-2、IAEA-600標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)值校正，δ18OV-SMOW采用IAEA-601、IAEA-602標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)值校正，δ2HV-SMOW采用B2203、CH-7標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)值校正。該測(cè)定計(jì)算方法下，δ13C的精確度為±0.1‰，δ15N和δ18O的精確度均為±0.2‰，δ2H的精確度為±3‰。

相鄰葉位同位素分餾系數(shù)計(jì)算公式如下：

(2)

式中，E為待分析元素，i表示較重原子的質(zhì)量數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差(single-way analysis of variance, ANOVA)分析不同葉位穩(wěn)定同位素分布特征，采用最小顯著差值法(least significant difference method, LSD)評(píng)價(jià)穩(wěn)定同位素與葉位之間的差異程度，各組數(shù)據(jù)間的顯著差異定義為P<0.05。以上數(shù)據(jù)分析用SPSS 19.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葉位中δ13C和δ15N分布特征

探究不同葉位穩(wěn)定同位素分布特征在一定程度上能了解茶葉的生長(zhǎng)狀況及變化規(guī)律，10個(gè)葉位δ13C和δ15N分布特征與分餾系數(shù)如表1所示。

表1 茶樹(shù)不同葉位中δ13C和δ15N的分布特征與分餾系數(shù)

不同葉位葉片δ13C變化范圍為-27.7‰～-23.4‰。通過(guò)線(xiàn)性相關(guān)分析可知，葉位與δ13C具有較強(qiáng)負(fù)相關(guān)性(R2= 0.98,P<0.05)，呈現(xiàn)隨葉位增加而貧化的特征，相鄰葉位差異值約0.19‰～0.48‰。相鄰葉位間分餾系數(shù)為1.000，表明不同葉位δ13C具有特定向下貧化的分餾規(guī)律，可作為茶樹(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中葉片成熟度的重要指標(biāo)。

葉片δ15N的變化范圍為0.9‰～6.3‰，與葉位之間表現(xiàn)出較強(qiáng)負(fù)相關(guān)性(R2= 0.93,P<0.05)，呈現(xiàn)隨葉位增加而貧化的特征，相鄰葉位相差值為0.05‰～0.55‰。相鄰葉位間分餾系數(shù)范圍為0.999～1.000，表明隨著葉位增加，δ15N具有貧化的分餾規(guī)律特征。

2.2 不同葉位中δ2H和δ18O分布特征

茶樹(shù)不同葉位中δ2H和δ18O分布特征如表2所示。δ2H變化范圍為-138.9‰～-65.3‰，與碳和氮同位素的變化特征相似，表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性(R2= 0.97,P<0.05)，呈現(xiàn)隨葉位增加而貧化的特征，相鄰葉位相差為2.4‰～7.3‰。相鄰葉位間分餾系數(shù)范圍為0.992～0.997。

表2 茶樹(shù)不同葉位中δ2H和δ18O的分布特征與分餾系數(shù)

不同葉位中δ18O變化范圍為18.2‰～25.2‰，δ18O與葉位之間呈現(xiàn)一定的線(xiàn)性關(guān)系(R2= 0.71,P<0.05)，但其相關(guān)性低于δ13C和δ15N。相鄰葉位間分餾系數(shù)范圍為0.999～1.001。在第1～第3葉位中，呈現(xiàn)上升富集趨勢(shì)，第4～第6葉位恒定為21.0‰～25.0‰，第7～第10葉位葉片呈現(xiàn)貧化趨勢(shì)。第2～第6葉位葉片中氧穩(wěn)定同位素值較高，結(jié)合植物光合作用機(jī)制可知該部位是葉片生理代謝較強(qiáng)的場(chǎng)所，說(shuō)明δ18O可作為植物代謝強(qiáng)弱的有效指標(biāo)。

2.3 不同葉位δ13C、δ15N、δ2H和δ18O隨采集時(shí)間的變化特征

在茶葉的生產(chǎn)中，主要采摘頂端葉片，如一芽一葉、一芽二葉和一芽三葉。因此，選取前三葉位葉片進(jìn)行5個(gè)采樣時(shí)間分析。

不同葉位δ13C和δ15N隨時(shí)間的變化特征如圖2所示。茶樹(shù)前三葉位葉片δ13C從8月9日(約-25.5‰)到9月27日(約-24.0‰)呈現(xiàn)富集的特征。不同葉位葉片δ13C變化規(guī)律不同，除了第1葉位逐漸增加，第2和第3葉位在8月31日達(dá)到次大值，隨后下降后而緩慢上升。δ13C與環(huán)境因子(光照、溫度和降雨)密切相關(guān)[13,25]。本研究中葉片采集時(shí)間跨越夏季與秋季，氣候變化差異較大，導(dǎo)致δ13C總體呈富集的特征。茶樹(shù)前三葉位葉片δ15N整體變化與δ13C相似，從8月9日(約2.7‰)到9月27日(約5.0‰)也呈富集特征。第1和第2葉位逐漸增加，第3葉位在9月11日達(dá)到峰值，之后貧化分餾。此外，前4個(gè)時(shí)間段采集葉位葉片的同位素值相近，在最后一次的采摘中不同葉位的同位素值具有一定的差異。

圖2 不同葉位δ13C和δ15N隨時(shí)間的變化特征

不同葉位δ2H和δ18O隨時(shí)間的變化特征如圖3所示。前3葉位葉片δ2H和δ18O按照初始和末次采樣相比較總體也呈富集特征，但中間的變化較δ13C和δ15N復(fù)雜。3個(gè)葉位的δ2H在初次采樣期(8月9日)平均約為-80‰，但在第二次采樣(8月17日)達(dá)最貧化值(約-107.0‰)，然后經(jīng)后面的2個(gè)采樣日期(8月31日與9月11日)緩慢富集，在最后一次采樣日期(9月27日)平均為-78.0‰，不同葉位的同位素比值和變化趨勢(shì)基本相同。3個(gè)葉位的δ18O在初次采樣期(8月9日)約為23.0‰，在第二次采樣(8月17日)也達(dá)最貧化值(約21.0‰)，在第三次采樣期(8月31日)富集，約為22.0‰，在第四次采樣(9月11日)又表現(xiàn)出了貧化效應(yīng)，δ18O約21.7‰，最后一次采樣期(9月27日)呈富集特征，約為24.5‰。第2和第3葉位的δ18O變化趨勢(shì)基本相似，第1葉位的變化更為劇烈。

圖3 不同葉位δ2H和δ18O隨時(shí)間的變化特征

3 討論

植物中碳元素累積與葉片光合作用過(guò)程密切相關(guān)，氣候環(huán)境變化是影響光合作用的主要因素，本研究進(jìn)一步揭示了茶樹(shù)不同葉位δ13C隨時(shí)間的變化特征。同時(shí)，δ13C作為衡量光合強(qiáng)弱的指標(biāo)，本研究中的數(shù)據(jù)也間接反映了不同葉片的光合特征。δ15N是葉片中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要組分。植物體中δ15N的分餾主要與含氮化合物的運(yùn)輸和分配有關(guān)[26]。當(dāng)葉片處于自養(yǎng)階段、異養(yǎng)階段或兼容兩者階段時(shí)，δ15N通常會(huì)發(fā)生分餾效應(yīng)，光合作用較強(qiáng)的葉片中較輕14N會(huì)被優(yōu)先利用分配。通常初生新葉(嫩葉)光合能力較強(qiáng)，較重15N會(huì)滯留于光合能力較弱的葉片中(老葉)[27-28]。本研究結(jié)果表明，葉片中δ15N同位素具有頂端嫩葉富集特征，而老葉因具有較弱的代謝能力表現(xiàn)出δ15N貧化特征，因此δ15N可作為指示葉片代謝活躍度的重要指標(biāo)。

茶樹(shù)葉片中δ2H主要來(lái)源于降雨，如根部吸收的地下水和葉片氣孔獲取空氣中的水分。δ2H的分餾規(guī)律特征與葉片有機(jī)物質(zhì)合成和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分配運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程有關(guān)[29-30]。葉片δ18O主要來(lái)源于大氣CO2和H2O，植物光合作用生產(chǎn)有機(jī)物的過(guò)程與CO2吸收同化有較大關(guān)聯(lián)[31]，據(jù)此推測(cè)相比于其他葉位葉片，本研究第2～第 5葉片中有更多的δ18O來(lái)源于CO2中的氧元素。而其他葉位的葉片由于缺乏相對(duì)較強(qiáng)的光合作用能力，屬于被輸送或異養(yǎng)型對(duì)象。相對(duì)于δ13C、δ15N和δ2H，δ18O更能衡量植物綜合生理代謝的能力。

植物中穩(wěn)定同位素是與氣候環(huán)境密切相關(guān)的指標(biāo)，與植物在特定環(huán)境中生長(zhǎng)的生理代謝有關(guān)[32-33]，茶葉穩(wěn)定同位素會(huì)隨季節(jié)發(fā)生變化，這與葉片光合作用合成有機(jī)物過(guò)程以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分配運(yùn)輸有直接的關(guān)聯(lián)。然而，關(guān)于茶葉穩(wěn)定同位素對(duì)氣候環(huán)境變化的響應(yīng)還不清楚，其內(nèi)在機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)系統(tǒng)研究了茶樹(shù)10個(gè)葉位δ13C、δ15N、δ2H、δ18O的分布特征，明確了第1～第3葉位同位素特征隨時(shí)間變化的規(guī)律。隨葉位自上而下，δ13C、δ15N 和δ2H逐漸貧化，而δ18O在第2到第5葉位保持較高的值，而后也逐漸貧化。第1～第3葉位同位素特征的時(shí)間變化具有差異，δ13C和δ15N總體呈富集性特征，但δ2H和δ18O呈現(xiàn)出先貧化后富集的變化特征。本研究結(jié)果為探究茶樹(shù)不同葉位傳統(tǒng)穩(wěn)定同位素的分餾機(jī)制提供了參考，為同位素?cái)?shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。