朱怡臻，賈西云，馮智慧，傅聿銘

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450052）

0 引言

胃癌在全世界范圍每年大約有100 萬新發(fā)病例，死亡率約為80%[1]。我國胃癌發(fā)病率已趨于平穩(wěn),但總發(fā)病數(shù)還將隨人口老齡化的加劇而增加。胃癌具有發(fā)病隱匿，早期難確診，易轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)率高等特點。目前胃癌的診斷仍舊是主要依靠內(nèi)鏡手段來確診；然而，內(nèi)鏡檢查有其局限性和滯后性，往往會延誤最佳診斷和治療的時機(jī)。經(jīng)典的胃腸道腫瘤標(biāo)記物如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）或 糖 類 抗 原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）等相關(guān)腫瘤抗原的器官特異性均較低，對腫瘤的特定類型區(qū)分缺乏特異性和敏感性。為能早期診斷胃癌，改善胃癌的中晚期難治與較差的預(yù)后，尋找新的腫瘤標(biāo)志物成為了胃癌研究的重要任務(wù)。

circRNA 的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有20 多年的歷史，伴隨高通量技術(shù)的快速發(fā)展及大量應(yīng)用，它神秘的面紗逐漸被揭開：circRNA 具有高度的序列保守性和穩(wěn)定性，沒有5′帽和3′尾,不易被核酸外切酶降解[2]。以共價鍵形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的circRNA，具有豐富的生物學(xué)作用，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用。近幾年來，通過大量研究人們對circRNA 的認(rèn)識不再只停留在“剪接的副產(chǎn)物”上，而認(rèn)為其與許多疾病和各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。作為當(dāng)下的研究熱點，circRNA 擁有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)并廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，除通過血液直接檢測外，已有研究報道它也大量存在于外泌體中，以其作為新的生物標(biāo)志物來診斷胃癌和判斷預(yù)后有巨大潛力。深入研究胃癌與circRNA 之間的關(guān)系，有助于更多地闡明胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，并為胃癌尋找新的臨床靶向治療方法提供可能。

1 circRNA 的概述

最初，circRNA 被普遍認(rèn)為是由于錯誤的剪切拼接形成的。伴隨著對RNA 環(huán)化的深入研究，越來越多報道證明circRNA 具有復(fù)雜且靈活的剪接機(jī)制[3]。根據(jù)目前已有的報道，由于來源序列和形成方式的不同，可將主要的circRNA 分為以下4 種：外顯子序列形成的circRNA（exonic circular RNA,ecircRNA)、內(nèi)含子序列形成的circRNA（circular intronicRNA,ciRNA）、外 顯 子序列和內(nèi)含子序列共同形成的circRNA(exonintron circRNA,EIciRNA)、以 及 轉(zhuǎn) 運(yùn)RNA(transfer ribonucleic acid,tRNA)內(nèi)含子在tRNA 剪接前體時形 成 的circRNA(tRNAintroniccircRNA，tricRNA)，其中人類組織細(xì)胞中的circRNA 主要為單個或多個外顯子形成的ecircRNA。此外，環(huán)狀DNA 核胞病毒也可以形成circRNA。

不同于線性RNA 的經(jīng)典剪接，這些circRNA的擁有各自的形成機(jī)制：ecircRNA 是單個或多個外顯子通過直接反向拼接（back-splicing）機(jī)制或外顯子跳躍（exon skipping）機(jī)制形成的，可分別由5′或3′發(fā)起反向拼接形成，內(nèi)含子被核酸分支酶切除后，5′端/3′端剪接供體與3′端/5′端剪接受體相結(jié)合，產(chǎn)生環(huán)狀的外顯子套索[4,5]。ciRNA 通過套索驅(qū)動（lariat-driven）環(huán)化生成，其在5′剪接位點附近有一段7-nt 左右富含GU 堿基的序列，而在分支點附近存在一段11-nt 富含C堿基的片段，由于該保守序列的存在，使ciRNA 得以避免了脫支酶和核外降解，同時，該關(guān)鍵序列是ciRNA 進(jìn)行正常環(huán)化所必需的[6]。EIciRNA 的形成機(jī)制仍未完全清楚，但是已有文獻(xiàn)報道EIciRNA的側(cè)翼互補(bǔ)序列（尤其是ALU 序列）在外顯子環(huán)化中起著重要作用，通過內(nèi)含子之間的堿基互補(bǔ)配對，由前體mRNA（precursor messenger RNA，premRNA）形成的[7]。ecircRNA 和EIciRNA 在結(jié)構(gòu)上僅存在著是否保存內(nèi)含子序列的差異，由于剪接發(fā)生位點和剪接方式選擇的不同，兩者之間存在著相似的發(fā)生機(jī)制。tricRNA 是由tRNA 前體上的內(nèi)含子通過剪接形成的[8]。

除上述描述的circRNA 形成方式外，RNA 結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）對circRNA 的環(huán)化也有驅(qū)動作用：RBP 可通過與側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合，使供體和受體位點結(jié)合，從而驅(qū)動環(huán)化[9]。肌盲（muscleblind）蛋白，作為RBP 可參與circmbl的形成[10]。因此，RBP 對部分circRNA 的形成有重要意義。

2 circRNA 的分子功能

過去觀點認(rèn)為circRNA 僅作為ncRNA（noncoding RNA，ncRNA）：幾乎沒有開放閱讀框（open reading frame，ORF），無法翻譯蛋白質(zhì)。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，部分特定的ncRNA 可以在特定的組織中被翻譯[11]。某些circRNA 具有起始密碼子序列（AUG位點）和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點（internal ribosome entry site，IRES），這也就在一定程度說明其具備招募核糖體并進(jìn)行翻譯功能的潛力[12]。

作為內(nèi)源競爭性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），發(fā)揮miRNA 海綿作用，是circRNA目前最典型的一個功能[13]。小腦退化相關(guān)蛋白1 反義轉(zhuǎn)錄物（antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript，CDR1as），也稱ciRS-7（circular RNA sponge for miR-7）是經(jīng)典的miRNA 海綿，其包含74 個miR-7 的結(jié)合位點，可同時結(jié)合大量的miR-7，對miR-7 起負(fù)調(diào)控作用[14]。當(dāng)ciRS-7 過表達(dá)時，其對miR-7 的抑制作用增強(qiáng)，miR-7 的下游靶基因表達(dá)水平將上升，而抑制ciRS-7 的表達(dá)就會解除了對miR-7 的海綿作用，從而導(dǎo)致miR-7 作用的靶基因表達(dá)被抑制。ciRS-7 的MRE 與miR-7 的競爭性結(jié)合，可促進(jìn)胰島素分泌，影響中腦神經(jīng)組織發(fā)育，并參與結(jié)腸癌、肝癌發(fā)展的機(jī)制[15]。circRNA 可通過抑制阿格蛋白2（argonaute2，AGO2）與miRNA 的接觸，影響其復(fù)合靶向體對其他RNA 的調(diào)節(jié)[16]。Sry（Sex-determining region Y）基因相關(guān)的睪丸特異性circRNA 包含16 個miR-138 的結(jié)合位點，擁有與ciRS-7 相似的調(diào)節(jié)機(jī)制，與miR-138 的相互作用從而調(diào)節(jié)miR-138 靶基因的表達(dá)[17]。circRNA 也可以同時是多種miRNA 的海綿：位于HIPK3 基因上的exon2 環(huán)化成的circHIPK3，目前已知其可以結(jié)合9 種miRNA，并且找到18 個潛在位點，作為“海綿”可特異性結(jié)合miR-124 并抑制其功能，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[18]。

3 circRNA 與胃癌

胃癌確診時間的早晚直接決定了患者的預(yù)后，早期胃癌患者多因無明顯癥狀而錯過手術(shù)時機(jī)。尋找新的診斷方法與預(yù)后評估指標(biāo)，是當(dāng)今胃癌研究的重點?，F(xiàn)已證實許多circRNA 參與并影響了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，它們在胃癌中的差異表達(dá)，可為我們對胃癌的研究提供新思路。本文匯總了部分胃癌相關(guān)的circRNA，見表1。

表1 胃癌相關(guān)circRNA

3.1 circRNA 與胃癌的發(fā)生發(fā)展

許多實驗研究已經(jīng)證明circRNA 可在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在胃癌中，circRNA被闡述最多仍是作為其他生物分子的“海綿”。ciRs-7/miR7 調(diào)節(jié)軸影響了胃癌細(xì)胞的增殖，miR7具有抑癌作用并在胃癌腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)[30]。Pan 等[19]報道了過量表達(dá)的ciRs-7 結(jié)合了大量的miR7，從而引起后者的低表達(dá)，抑制其抑癌作用，此外還加強(qiáng)了PTEN/PI3K/AKT 通路，最終導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的增殖。PTEN/PI3K/AKT 被認(rèn)為參與有氧糖酵解[31]，由此推斷ciRs-7 可能具備調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞代謝的功能。相似的是，ciRs-7 的過表達(dá)也在結(jié)直腸癌中發(fā)揮類似作用，Weng 等[32]通過研究發(fā)現(xiàn)了過表達(dá)的ciRs-7 下調(diào)miR7 活性也存在于結(jié)腸癌細(xì)胞中，并通過增強(qiáng)EGFR/RAF1/MAPK 通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。circLARP4 是La 核糖核蛋白結(jié)構(gòu)域家族成員4（La ribonucleoprotein domain family member 4，LARP4）的一員，通常在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)的它可作為miR-424 的海綿，使后者的作用靶點巨大腫瘤抑制基因激酶1（large tumor suppressor kinase 1，LATS1）的抑制解除從而表達(dá)上調(diào)，這一過程可使胃癌細(xì)胞的增殖受到抑制，表明circLARP4 具有抑癌調(diào)控作用，侵襲實驗提示過表達(dá)的circLARP4 具備抑制胃癌細(xì)胞侵襲的功能[25]。circPVT1 作為miR-125 的海綿并在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，影響其與靶基因EFE2 的結(jié)合，失去miR-125 抑制的靶基因表達(dá)水平明顯上升，這一過程可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖[33]。Liu 等[34]研究表明，circYAP1 具有抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用并在胃癌組織中低表達(dá)，且circYAP1 低表達(dá)的胃癌患者獲得了更長的存活時間。Zhang 等[35]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_100269 在胃癌組織中低表達(dá)，上調(diào)該circRNA 后可抑制胃癌細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制與circRNA100269/miRNA630 信號通路相關(guān)。Zhao等[36]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000181 在胃癌細(xì)胞和血漿中均為低表達(dá)，其與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及糖類抗原CA19-9 水平相關(guān)。Tang 等[37]驗證了在胃癌組織中低表達(dá)的circ-KIAA1244 與胃癌TNM 分期和淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。

綜上，circRNA 對胃癌增殖、侵襲、代謝等生物學(xué)功能均有調(diào)控作用，但其確切的上下游分子靶點及復(fù)雜交叉的信號通路還沒有完全闡明，需要我們通過更深入的研究來具體詮釋。

3.2 circRNA 與胃癌的腫瘤微環(huán)境

腫瘤 微 環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是指除腫瘤細(xì)胞本身外的細(xì)胞和分子組成的能夠影響腫瘤生物學(xué)功能的細(xì)胞環(huán)境。外泌體（exosome）是TME 中腫瘤細(xì)胞來源的重要調(diào)控因子，它包含miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)等許多生物活性物質(zhì)，circRNA 也在其中。已有研究報道,hsa_circ_044366 在胃癌細(xì)胞外泌體中高表達(dá)，可通過吸附miR-29a 而使其表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、成環(huán)和增殖[38]。

除外泌體來源的circRNA 影響胃癌的TME外，腫瘤細(xì)胞自身的circRNA 也可影響TME。腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與腫瘤的多種生物學(xué)功能密切相關(guān), 其中，胃癌細(xì)胞的EMT 與其TME 中的E- 鈣黏蛋白（E-cadherin）的減少和波形蛋白的增多相關(guān)。Li 等[39]報道了，過表達(dá)的circ-104916 能夠下調(diào)胃癌TME 中的波形蛋白和上調(diào)E-鈣黏蛋白的含量，這對胃癌細(xì)胞的EMT 有抑制作用。Zhao 等[40]驗證了胰島素生長因子受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R) 的 表 達(dá) 量 與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)，miR-7 可以抑制IGF1R 從而上調(diào)E-cadherin，這個過程可以可部分逆轉(zhuǎn)EMT，從而抑制人胃癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移。由此可推測ciRS-7作為miR-7 的“海綿”，也可對EMT 產(chǎn)生相應(yīng)影響。

3.3 circRNA 與胃癌的治療

我們已知circRNA 參與并調(diào)節(jié)了胃癌發(fā)展過程中的眾多環(huán)節(jié)，基于“miRNA 海綿”功能的調(diào)節(jié)機(jī)制出發(fā)，影響其下游分子的表達(dá)量從而對胃癌細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)控作用。敲低或上調(diào)circRNA 的表達(dá)量，理論上就可以達(dá)到逆轉(zhuǎn)或干擾腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的治療目的。在胃癌中，以部分circRNA 作為腫瘤定向治療潛在的新靶點，可為患者帶來更多增益。

Xie 等[30]驗證了miR-7 對表皮生長因子受體(epidermalgrowth factor receptor，EGFR)的親本mRNA 有降解作用，這影響了其蛋白質(zhì)的翻譯從而抑制了胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Pan 等[19]驗證了在人胃癌裸鼠轉(zhuǎn)移實驗中，抑制ciRS-7 表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞生長速率。雖然目前對ciRS-7 在胃癌中的研究還停留在體外實驗及動物模型階段，但ciRS-7 很有潛力成為胃癌治療的重要靶點。

除了ciRS-7 外，還有許多circRNA 對胃癌的治療有重要意義。circNRIP1 作為miR-149-5p 的海綿能以AKT1/mTOR 通路影響胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[41]。作為叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，F(xiàn)OXO3 多以抑癌基因在胃癌中發(fā)揮作用[42]；Lu等[43]報道了hsa_circ_0001368 具備吸附并抑制miR-6506e5p 的能力，進(jìn)而解除了miR-6506e5p對FOXO3 的海綿作用，最終可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Chen 等[27]發(fā)現(xiàn)了在胃癌中高表達(dá)的circPVT1 可發(fā)揮miR-125 海綿的作用，miR-125 作為抑癌基因，敲低circPVT1 的表達(dá)量可抑制胃癌細(xì)胞增殖。此外，通過簡單連接酶人工合成的circRNA 也可發(fā)揮抑癌作用，Liu 等[44]在體外合成了抗酶解的人工circRNA 來抑制miR-21 以達(dá)到降低胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的目的；在miR-21 被抑制后，其下游的抑癌蛋白DAXX 的表達(dá)得以上調(diào)。

值得注意的是，以circRNA 為基礎(chǔ)尋找新的治療靶點還需要大量的實驗驗證，盲目地投入使用不僅不能為病人帶來治療獲益，還會增加醫(yī)療成本。聯(lián)合傳統(tǒng)治療方式，在兼顧安全性和精確度的前提下，如何選取高特異性的circRNA 并將其治療方式具體化，是今后研究中亟待克服的難點。

4 展望

circRNA 是RNA 家族中的晚輩，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，我們對它的了解也越來越多：作為非編碼RNA，它分布廣泛、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、功能多樣；作為競爭性內(nèi)源性RNA，它可以發(fā)揮“海綿”作用來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。目前對于circRNA 領(lǐng)域的研究仍處于起步階段，關(guān)于circRNA 與胃癌相關(guān)的發(fā)生機(jī)制和生物功能仍有太多的未知，需要不斷的探索發(fā)現(xiàn)。依據(jù)目前已有研究，circRNA 在胃癌與癌旁組織的差異性表達(dá)，以及其表達(dá)水平與腫瘤的大小、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM 分期等有著密切相關(guān)性，這使我們看到了circRNA 用于腫瘤早期診斷和預(yù)后評估的巨大潛力，以及為胃癌患者提供更多治療獲益的可能性。更深層、全面地揭示circRNA 在調(diào)控生命活動中的作用，可為今后胃癌的診斷及臨床治療提供新的思路。