李曉玲，楊 進(jìn)，孫 雷,，黃應(yīng)平，朱士江，呂 坤,，胥 燾,，黃桂云，張國禹

1 三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部工程研究中心，湖北省三峽地區(qū)生態(tài)保護(hù)與治理國際聯(lián)合研究中心, 宜昌 443002 2 三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，宜昌 443002 3 中國長江三峽集團(tuán)有限公司長江珍稀植物研究所，宜昌 443000

隨著全球氣候變暖,植物應(yīng)對干旱和水淹脅迫的生理生態(tài)適應(yīng)機(jī)制引起了生態(tài)學(xué)者的廣泛關(guān)注[1—2]。由于三峽大壩的修建,形成了水位落差將近30m、面積達(dá)349km2的季節(jié)性漲落的消落帶[3]。同時(shí),三峽庫區(qū)夏季暴雨洪水和高溫干旱頻發(fā),促使水位變化頻率加快,導(dǎo)致部分消落帶在短期內(nèi)形成水淹和干旱交叉脅迫現(xiàn)象[4]。這種大幅度、高頻次的水位漲落將嚴(yán)重影響三峽庫區(qū)的安全、健康和可持續(xù)發(fā)展[5]。因此,深入研究植物對干旱-水淹交叉脅迫下的特異性生理生態(tài)適應(yīng)機(jī)制,對高效保護(hù)庫區(qū)的生態(tài)環(huán)境、充分利用土著生物改善消落帶生態(tài)具有重要意義。

中華蚊母樹(Distyliumchinense)是金縷梅科(Hamamelidaceae)蚊母樹屬(Distylium)多年生常綠河岸帶小灌木[22],是三峽庫區(qū)河岸帶的優(yōu)勢樹種和表征種[23],具有耐淹性好、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn),其根系發(fā)達(dá)、生長快,分布廣泛,是三峽庫區(qū)消落帶理想的防沙固土樹種。同時(shí),也是一種較好的園林綠化植物[24]。目前研究主要集中在半淹或全淹等單一因子對中華蚊母樹形態(tài)、光合作用等方面的變化[25—26],而關(guān)于干旱-水淹交叉脅迫下,中華蚊母樹形態(tài)及ROS代謝的生理適應(yīng)機(jī)制尚未見報(bào)道。本文通過研究干旱-水淹交叉脅迫及恢復(fù)生長階段施加不同外源物質(zhì)(Glu、ABA、Pro),對中華蚊母樹幼苗的形態(tài)及ROS清除的狀況,擬解決以下3個(gè)問題：(1)作為三峽庫區(qū)河岸帶優(yōu)勢樹種的中華蚊母樹,在遭受干旱-水淹交叉脅迫時(shí),其在形態(tài)學(xué)方面產(chǎn)生哪些適應(yīng)性機(jī)制？(2)在遭受干旱-水淹交叉脅迫后,如果中華蚊母樹能夠存活和恢復(fù)生長,那么中華蚊母樹的ROS清除系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生哪些變化？(3)脅迫恢復(fù)階段,施加外源物質(zhì),是否對中華蚊母樹的恢復(fù)生長產(chǎn)生影響？通過對上述問題的回答以闡明中華蚊母樹對干旱-水淹交叉脅迫的形態(tài)和ROS代謝的適應(yīng)機(jī)制,可為進(jìn)一步研究如何提高其在消落帶生境存活率提供基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2017年9月中下旬采集野外種群隨機(jī)成熟的種子,共計(jì)2000粒,種植在15cm×13cm的塑料盆中讓其自然萌發(fā)生長,種植基質(zhì)選用腐殖質(zhì)土和壤土(按1∶4的比例混合均勻,土壤pH為6.25,土壤含水量為27.32%,土壤容重為1.38g/cm3),盆內(nèi)土層厚度約為12cm,所有幼苗具有相同的生長環(huán)境,且給予除草等常規(guī)管理。生長一年后,用于室外模擬實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)置在三峽大學(xué)生態(tài)實(shí)驗(yàn)基地(111°32′E,30°73′N,海拔高度134m,年平均降雨量992.1—1404.1mm)進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2018年12月從移栽苗中挑選長勢和大小相近的450盆進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。將實(shí)驗(yàn)用苗隨機(jī)分為5組,每組90盆,每組再隨機(jī)分為30盆,共3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30盆。其中,10盆用于形態(tài)學(xué)調(diào)查,20盆用于生理生化指標(biāo)的測定。共設(shè)置4個(gè)階段,階段1為干旱階段,包括對照組(常規(guī)供水,CK)、4組干旱(簡稱D)處理,共計(jì)5個(gè)處理組,每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30盆,每個(gè)處理組為90盆。對照組CK即為正常供水組,土壤含水量保持在田間持水量的80%(土壤含水量采用稱重法確定)。干旱時(shí)間設(shè)置4周；階段2為干旱恢復(fù)階段,將階段1的CK組繼續(xù)常規(guī)供水,D處理組于干旱階段結(jié)束當(dāng)天施加3種不同外源物質(zhì)(4mg/L ABA[27]、30mg/L Pro[28]、360mg/L Glu[29]),葉面均勻噴施ABA(簡稱A)和Pro(簡稱P)、根部澆灌Glu(簡稱G)以及脅迫后不施加外源物質(zhì)(簡稱N),見圖1。此時(shí),干旱恢復(fù)處理(簡稱R)組包括常規(guī)供水(CK)、施加脫落酸(該處理簡稱D-R-A)、施加脯氨酸(該處理簡稱D-R-P)、施加葡萄糖(該處理簡稱D-R-G)及脅迫恢復(fù)不施加外源物質(zhì)(該處理簡稱D-R-N)5個(gè)不同處理組。干旱恢復(fù)生長設(shè)置3周；干旱恢復(fù)階段結(jié)束后,立即將幼苗浸水進(jìn)行水淹(F)階段。階段3為水淹階段,將階段2的CK處理組常規(guī)供水(CK),其他4個(gè)處理組進(jìn)行水淹處理,共5個(gè)處理組,水淹時(shí)間設(shè)置9周；階段4為水淹恢復(fù)階段,將階段3的處理組(不包括CK)施加3種外源物質(zhì),此時(shí),水淹恢復(fù)處理組包括常規(guī)供水(CK)、施加脫落酸(該處理簡稱D-R-A-F-R-A)、施加脯氨酸(該處理簡稱D-R-P-F-R-P)、施加葡萄糖(D-R-G-F-R-G)及不施加外源物質(zhì)(該處理簡稱D-R-N-F-R-N)5個(gè)不同處理組,水淹恢復(fù)生長設(shè)置3周。

干旱及水淹處理植株放于80cm×50cm×40cm的塑料籃內(nèi),每個(gè)塑料籃放15盆,共計(jì)24個(gè)塑料籃,3種外源物質(zhì)4個(gè)處理(不包括CK),每個(gè)處理3次重復(fù),每個(gè)重復(fù)30盆,共360株,干旱、水淹及正常處理放置于13個(gè)水池(2m×1.5m×2.5m)中進(jìn)行(干旱6個(gè)水池、水淹6個(gè)水池、正常處理1個(gè)水池)；對照處理進(jìn)行常規(guī)供水,定期更換水池中的水,實(shí)驗(yàn)示意圖見圖1。盆內(nèi)土層厚度約為12cm,所有植株置于三峽大學(xué)生態(tài)實(shí)驗(yàn)基地生長。干旱從2018年10月25日開始,干旱采取自然連續(xù)干旱模式,每5天采用稱重法測一次土壤含水量,直至土壤含水量達(dá)到30%停止干旱,11月22日停止干旱復(fù)水恢復(fù)至12月13日,繼續(xù)進(jìn)行水淹處理至2019年2月14日停止水淹恢復(fù)至3月7日。采取裂區(qū)設(shè)計(jì)的方法,水池隨機(jī)放置植株和塑料籃,每兩周隨機(jī)輪換一次位置,以此減少位置效應(yīng)的影響。同時(shí),由于模擬用水相對清澈,為充分模擬庫區(qū)消落帶水體渾濁帶來的低光強(qiáng)環(huán)境,在水池上方布設(shè)一層遮陽網(wǎng),使到達(dá)水下植物的光照強(qiáng)度小于10μmol m-2s-1[30]。所有植株實(shí)驗(yàn)期間均不施肥。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖Fig.1 Experimental design drawingA：脫落酸 Abscisic acid；P：脯氨酸 Proline；G：葡萄糖 Glucose；C：對照 Control；N：進(jìn)行脅迫處理但恢復(fù)階段不施加外源物質(zhì) Stress treatment was carried out but no allogenic materials were applied in the recovery stage

在干旱及水淹處理的最后一天,與干旱及水淹恢復(fù)處理的最后一天,于每個(gè)重復(fù)內(nèi)隨機(jī)采集長勢良好的葉片10片,洗凈,并用定性濾紙擦干后迅速放入液氮,速凍5min,放置于超低溫冰箱(-78℃)保存,用于生理生化指標(biāo)的測定。

1.3 形態(tài)特征的測定

每個(gè)處理期最后一天,測定用于形態(tài)學(xué)調(diào)查的10株植物的株高、基徑、不定根數(shù)、葉片數(shù)及嫩枝數(shù)。

1.4 生理指標(biāo)的測定

參照Giannopolitis等[31]的方法檢測SOD活性。50μL酶液加入0.3mL 13mmol/L Met、0.3mL 1.3μmol/L核黃素、0.3mL 63μmol/L NBT、1.5mL 50 mmol/L PBS(pH 10.2)、0.3mL 0.1mmol/L EDTA、0.25mL蒸餾水。于4000 lx日光下反應(yīng)20min,測定560nm處吸光值。

參照Wang等[32]的方法檢測CAT活性。0.5mL酶液中加入2mL 50mmol/L PBS (pH7.0)、0.5mL 40mmol/L H2O2,于240nm下測定H2O2的分解率。

參照Kanamoto[33]的方法檢測APX活性。0.1mL酶液中加入0.1mL 0.1mmol/L EDTA、0.1mL 0.5mmol/L ASA、1.6mL 50mmol/L PBS(pH 7.0),加入0.1mL 0.1mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng),測定290nm處吸光值。

參照Bates等[35]的方法測定Pro含量。稱取0.5g葉片,加入10mL 3%磺基水楊酸沸水提取10min,3000r/min離心10min。取2mL清液,加入2mL冰醋酸、2mL 2.5%酸性茚三酮,沸水浴100min,加入甲苯萃取色素,于520nm測定甲苯相吸光度。采用脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算Pro含量。·OH采用ELISA試劑盒(南京建成)測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用R語言對數(shù)據(jù)進(jìn)行圖表繪制和統(tǒng)計(jì)分析。水淹、干旱脅迫對幼苗的影響,采用aov()函數(shù)進(jìn)行單因素方差分析；利用corrgram包中的corrgram()函數(shù)作出相關(guān)系數(shù)矩陣圖,以檢驗(yàn)施加不同外源物質(zhì)對ROS清除的影響,采用multcomp包中的glht()函數(shù)進(jìn)行單因素方差分析,并進(jìn)行多重比較；為了比較ROS清除系統(tǒng)的相對重要性,采用psych包的principal()函數(shù)進(jìn)行PCA分析,以對ROS清除系統(tǒng)進(jìn)行檢驗(yàn)。采用Excel 2010和SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件對形態(tài)指標(biāo)的差異性采用單因素方差分析(One-way ANOVA,Duncan′s multiple range test多重比較)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱-水淹交叉脅迫對中華蚊母樹形態(tài)學(xué)特征的影響

經(jīng)過干旱4周恢復(fù)至正常生長,后再水淹脅迫9周對中華蚊母樹幼苗形態(tài)學(xué)特征產(chǎn)生了顯著影響(P<0.05)。中華蚊母樹幼苗經(jīng)過4周干旱脅迫后,株高、基莖、不定根數(shù)、葉片數(shù)及嫩枝數(shù)與對照沒有顯著差異,但經(jīng)過后期水淹脅迫9周后,較對照組株高顯著降低,生長減緩,基莖顯著增加,不定根也顯著增加,葉片脫落,嫩枝略有增加但不顯著(表1)。結(jié)果表明干旱-水淹交叉脅迫過程中幼苗形態(tài)特征的變化,有利于幼苗適應(yīng)后期水淹脅迫的低氧條件,表明前期干旱脅迫促進(jìn)了對后期水淹脅迫的耐受性。

表1 干旱和水淹交叉脅迫對中華蚊母樹形態(tài)學(xué)特征的影響(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

2.2 干旱-水淹交叉脅迫對中華蚊母樹ROS代謝的影響

圖2 干旱和水淹交叉脅迫對中華蚊母樹幼苗ROS含量及ROS清除的影響Fig.2 Effects of alternate drought and flooding stresses on ROS content and ROS clearance of D. chinense seedlingsROS: 活性氧 Reactive oxygen species;不同處理間標(biāo)有不同字母者表示差異顯著(P<0.05)

2.3 脅迫恢復(fù)期施加不同外源物質(zhì)對ROS清除的協(xié)同作用

圖3 恢復(fù)期施加不同外源物質(zhì),中華蚊母樹酶促系統(tǒng)、非酶促系統(tǒng)、ROS的相關(guān)系數(shù)矩陣圖Fig.3 The matrix diagram of correlation coefficient of enzymatic system, non-enzymatic system and ROS of D. chinensewith different exogenous substances during the recovery growth 超氧陰離子自由基 Superoxide anion free radical；·OH：羥自由基 Hydroxyl radical; SOD：超氧化物歧化酶 Superoxide dismutas;；APX：抗壞血酸過氧化物酶 Ascorbate peroxidase；CAT:過氧化氫酶 Catalase; Pro：脯氨酸 Proline

2.4 恢復(fù)期施加不同外源物質(zhì)對中華蚊母樹幼苗的影響

干旱與水淹恢復(fù)階段施加ABA、Pro、Glu等外源物質(zhì),中華蚊母樹幼苗ROS含量及ROS清除系統(tǒng)產(chǎn)生了差異(圖4和圖5)。外源添加Pro,SOD、CAT、APX活性升高,·OH與含量降低；外源添加Glu,SOD、CAT、APX活性未升高,但·OH與含量降低；外源添加ABA,內(nèi)源Pro含量升高。說明外源添加Pro,可能是通過增強(qiáng)SOD、CAT、APX等保護(hù)酶的活性,進(jìn)而清除ROS；外源添加Glu,保護(hù)酶未增強(qiáng),但植株具有清除ROS的其他途徑；外源添加ABA,可誘導(dǎo)植株內(nèi)源Pro的生成,進(jìn)而可清除·OH。同時(shí),外源施加ABA,與內(nèi)源Pro含量表現(xiàn)出強(qiáng)的正相關(guān)性。

圖4 干旱脅迫恢復(fù)階段施加不同的外源物質(zhì)(ABA、Glu、Pro)對中華蚊母樹幼苗ROS含量及ROS清除的影響Fig.4 Effects of different exogenous substances (ABA, Glu, Pro) on ROS content and ROS clearance of D. chinense seedlings during the recovery growth of drought stressD-R-A：干旱-恢復(fù)施加脫落酸 Drought-recovery with abscisic acid (ABA)； D-R-N：干旱-恢復(fù)不施加任何物質(zhì)Drought-recovery with no any matter；D-R-G：干旱-恢復(fù)施加葡萄糖 Drought-recovery with glucose(Glu)；CK：對照 Control； D-R-P：干旱-恢復(fù)施加脯氨酸 Drought-recovery with proline (Pro)

圖5 干旱-水淹恢復(fù)階段施加不同的外源物質(zhì)(ABA、Glu、Pro)對中華蚊母樹幼苗ROS含量及ROS清除的影響Fig.5 Effects of different exogenous substances (ABA, Glu, Pro) on ROS content and ROS clearance of D. chinense seedling during the recovery growth of drought-flooding stressesD-R-A-F-R-A：干旱-恢復(fù)施加脫落酸-水淹-恢復(fù)施加脫落酸 Drought-recovery with abscisic acid (ABA)-flooding-recovery with ABA； D-R-N-F-R-N：干旱-恢復(fù)不施加任何物質(zhì)-水淹-恢復(fù)不施加任何物質(zhì) Drought-recovery with no any matter-flooding-recovery with with no any matter; D-R-G-F-R-G: 干旱-恢復(fù)施加葡萄糖-水淹-恢復(fù)施加葡萄糖Drought-recovery with glucose(Glu)-flooding-recovery with Glu；CK: 對照 Control; D-R-P-F-R-P：干旱-恢復(fù)施加脯氨酸-水淹-恢復(fù)施加脯氨酸 Drought-recovery with proline (Pro)-flooding-recovery with Pro

3 討論

3.1 干旱-水淹交叉脅迫對中華蚊母樹形態(tài)學(xué)特征的影響

水淹脅迫后,水分過多會(huì)引起土壤通氣性差和植株根際周圍缺氧[19]。這種不良的根際環(huán)境會(huì)影響根系對水分和礦物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn),從而引起植株生長減慢和葉片衰老脫落。脅迫后,植株的生長狀況可作為判斷植株幼苗水淹耐受能力的重要指標(biāo)之一[36- 37]。經(jīng)過4周干旱脅迫恢復(fù)后再水淹脅迫9周對中華蚊母樹的生長影響顯著(表1)。中華蚊母樹在形態(tài)學(xué)上對水分脅迫表現(xiàn)出了適應(yīng)性。面臨水淹脅迫,植物可能具有兩種策略：耐受性與逃避策略[38]。中華蚊母樹幼苗在遭受水淹脅迫時(shí),葉片的減少可能有利于植株的存活,植株通過脫落葉片的耐受性策略來應(yīng)對厭氧代謝等造成的巨大消耗,以此保證根部的存活。同時(shí)中華蚊母樹植株為適應(yīng)這種水淹缺氧狀態(tài),在水淹初期開始形成少量不定根、莖基部開始膨大,隨著水淹時(shí)間的延長形成更多的不定根,莖基部膨大部分形成大量皮孔,莖增粗[25]。水淹過程中不定根和肥大皮孔的產(chǎn)生,這是耐淹木本植物對水淹的標(biāo)志性形態(tài)反應(yīng)之一[39]。有研究表明這些肥大的皮孔有大量的細(xì)胞間隙增強(qiáng)了氣體擴(kuò)散,給被水淹的根系提供氧氣,是莖和不定根在大氣和內(nèi)部組織間進(jìn)行氣體交換的一種重要途徑,以便于植物在水淹脅迫下度過不良的外界環(huán)境[19,25,39]。同時(shí),在水淹脅迫過程中不定根的形成通過給植株提供水分、礦物質(zhì)和激素來維持其生長,使植株耐受水淹[40]。就不定根的發(fā)生和莖基部膨大的皮孔來講,中華蚊母樹在形態(tài)上表現(xiàn)出對水淹有一定的適應(yīng)能力。由此可見,前期干旱脅迫促進(jìn)了中華蚊母樹對后期水淹脅迫的適應(yīng),如通過葉片脫落、形成不定根及莖基部膨大等形態(tài)學(xué)的變化增強(qiáng)植物對水淹脅迫的適應(yīng)。

3.2 酶促系統(tǒng)對中華蚊母樹清除非生物脅迫冗余ROS的影響

圖6 非生物脅迫下,中華蚊母樹ROS可能的產(chǎn)生途徑及外源物質(zhì)對清除ROS的促進(jìn)作用Fig.6 Under abiotic stress, the possible ROS production pathways and the promoting effect of allogenic material on scavenging ROS in the D. chinensePPP：磷酸戊糖途徑 Pentose phosphate pathway；NADPH：還原型輔酶II,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(還原態(tài))Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(reduced state)；NADP+：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化態(tài)) Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(oxidation state)； NOX：NADPH氧化酶 NADPH oxidase；ASA-GSH：抗壞血酸-谷胱甘肽 Ascorbic-glutathione

3.3 非酶促系統(tǒng)對中華蚊母樹清除非生物脅迫冗余ROS的影響

圖7 干旱與水淹階段酶促系統(tǒng)及非酶促系統(tǒng)在清除ROS中的貢獻(xiàn)率Fig.7 Contribution rate of enzymatic and non-enzymatic system on ROS scavenging during drought and flooding stresses

3.4 外源物質(zhì)的添加對中華蚊母樹冗余ROS清除的影響

逆境脅迫解除后的快速生長恢復(fù)能力是判斷消落帶岸生物種幼苗水淹耐受能力的重要指標(biāo)之一[30]。Stewart等采用ABA處理干旱脅迫小麥葉片,Pro大量積累,表明外源添加ABA,可誘導(dǎo)植株內(nèi)源Pro的積累,進(jìn)而清除·OH[15]。外源施加ABA后,中華蚊母樹的Pro顯著增加(圖4和圖5),有利于·OH的清除。施加Pro后,中華蚊母樹幼苗CAT、APX酶活性顯著增強(qiáng)(圖4和圖5),表明外源施加Pro,中華蚊母樹可能通過增強(qiáng)CAT與APX等抗氧化酶系統(tǒng)的活性,進(jìn)而清除環(huán)境壓力產(chǎn)生的冗余ROS。在應(yīng)對應(yīng)激脅迫時(shí),植物體內(nèi)的可溶性糖含量將大量增加[51],Glu可通過氧化的PPP(磷酸戊糖途徑)提高NADPH的產(chǎn)生,而NADPH是ASA-GSH循環(huán)的重要輔助因子[17],同時(shí)Glu的添加與·OH表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)(圖4)。但外源施加Glu,保護(hù)酶活性未顯著升高(圖4)。因此,我們推斷外源添加Glu,可能是通過增強(qiáng)中華蚊母樹的ASA-GSH循環(huán),從而以ASA為底物的APX將H2O2降解為H2O,同時(shí),可間接降低·OH的含量(圖6)。因此,ABA、Pro、Glu等外源物質(zhì)的施加,可促進(jìn)中華蚊母樹對逆境脅迫產(chǎn)生的冗余ROS的有效清除。

3.5 干旱-水淹交叉脅迫對中華蚊母樹逆境脅迫耐受能力的影響