楊鴻雁，單紫軒，賴 亮，段 俊，汪錦才，霍嘉茵，郭嘉亮,,

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東佛山 528000；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510632；3.佛山馮了性藥業(yè)有限公司，廣東佛山 528000）

抗生素的過度使用導(dǎo)致了“超級細(xì)菌”的產(chǎn)生，人類可能面臨“無藥可用”的巨大風(fēng)險。WHO權(quán)威報告指出，每年約70萬人死于耐藥細(xì)菌感染；若無有效措施，至2050年將造成每年超過1000萬人死亡，逾100萬億美元經(jīng)濟(jì)損失。然而，過去40年里鮮見全新作用機制的抗生素獲批準(zhǔn)上市。這不僅對生物醫(yī)藥與大健康領(lǐng)域影響深遠(yuǎn)，同時也成為了我國畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及食品工業(yè)等領(lǐng)域可持續(xù)發(fā)展的重要桎梏。抗微生物肽（Antimicrobial peptide，AMP）亦作抗菌肽，是生物體免疫防御產(chǎn)生的一類內(nèi)源性小分子多肽，與傳統(tǒng)抗生素不同，AMP以細(xì)菌細(xì)胞膜為作用靶點而非某一個特定的識別位點，由于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和組分是細(xì)菌進(jìn)化過程中最保守的部分之一，故難以產(chǎn)生廣泛耐藥性。此外，AMP還具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好、水溶性佳、免疫原性低等優(yōu)點，因此被視為抗生素的最佳“替代物”。鑒于其重要性，本文將重點介紹天然產(chǎn)物中AMP的高效篩選方法及研究進(jìn)展。

目前，正處于臨床試驗階段的AMP藥物達(dá)數(shù)百種，當(dāng)中不乏 Daptomycin、Omigan、Pexiganan明星分子。近年來，隨著研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)某些抗細(xì)菌肽類對部分真菌、原蟲、病毒及癌細(xì)胞等均具有強有力的殺傷作用，因而舊有命名：“抗菌肽”，則顯得較為局限容易造成誤解，故對這類活性多肽的命名越來越多科學(xué)家傾向于稱之為“抗微生物肽”或者“多肽抗生素”（Peptide antibiotics），下文將統(tǒng)一稱為抗微生物肽（AMP）。如今，AMP在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域均有著廣泛的應(yīng)用，已逐漸成為了國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點。

值得關(guān)注的是，專業(yè)AMP數(shù)據(jù)庫（Antimicrobial peptide database，APD）累計收錄超 5000 種 AMP，但當(dāng)中接近一半是通過人工合成得到。合成肽普遍通過化學(xué)手段將氨基酸依次定向縮合而成，無法避免合成長度有限、個別序列難以獲得、成本高昂等技術(shù)難題，而且在突破結(jié)構(gòu)限制、實現(xiàn)骨架創(chuàng)新上存在先天性的不足。天然產(chǎn)物是由生命系統(tǒng)產(chǎn)生的化合成分，或者說是由動物、植物、微生物以及海洋生物等產(chǎn)生的特征次生代謝物。相較之下，生物多樣性（Biodiversity）決定了天然產(chǎn)物來源的AMP具有來源豐富、結(jié)構(gòu)多樣、骨架新穎等無可比擬的優(yōu)勢。自從1980年瑞典科學(xué)家Hultmark等在天蠶蛹發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性多肽天蠶素以來，從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的AMP分布極其廣泛，包括哺乳動物、甲殼動物、魚類、昆蟲、兩棲動物、鳥類到植物、細(xì)菌和病毒等。

然而，迄今為止已發(fā)現(xiàn)的天然AMP尚不足3000種，挖掘率較低（不足0.1%）。究其原因，一方面在于其在生物組織中含量極低，如一只成年工蜂蜇刺分泌的蜂毒肽僅有數(shù)十微升（μL），蝎子及蜘蛛的產(chǎn)量更是低至納升（nL）級別，這難以滿足多數(shù)分離篩選模式對受試量的要求；另一方面在于傳統(tǒng)篩選方法在分析通量、分析效率、分析內(nèi)涵上均存在重大缺陷，嚴(yán)重制約了從紛繁復(fù)雜的天然產(chǎn)物中篩選發(fā)現(xiàn)AMP成分。而今，關(guān)于AMP的結(jié)構(gòu)、生物活性及實際應(yīng)用的研究進(jìn)展已有不少綜述，本文將重點關(guān)注AMP作用機制及其高效篩選方法的研究進(jìn)展，以期為天然產(chǎn)物來源AMP的進(jìn)一步研究利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 抗微生物肽的作用機制

AMP的作用機制主要包括膜作用機制與非膜作用機制。無論哪種機制，AMP與細(xì)胞膜的結(jié)合都是公認(rèn)的入侵病原體的首要和關(guān)鍵步驟，因此AMP的作用機制為實現(xiàn)其高效、快速、簡便的分離提供了一種重要的依據(jù)和啟示。

1.1 膜作用機制

普遍認(rèn)為AMP穿過細(xì)胞壁后，帶正電荷的AMP與細(xì)胞膜通過靜電引力發(fā)生作用，在細(xì)胞膜上形成穿膜孔，使細(xì)胞膜裂解，導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。當(dāng)前膜作用機制有桶板模型、毯式模型、環(huán)膜孔模型，凝集模型、電穿孔模型、離子載體模型、無規(guī)則的環(huán)形模型等等膜作用方式。本文僅介紹以下比較常見的四種模型，相關(guān)機理如圖1所示。

桶板模型（Barrel-stave model）是指AMP單體以螺旋形式通過靜電作用結(jié)合到膜上，然后螺旋體插入細(xì)胞膜的疏水孔，AMP的疏水性區(qū)域與雙分子層的磷脂雙分子層結(jié)合，多個分子在膜中心呈束狀排列，構(gòu)成中空的管腔結(jié)構(gòu)（圖1A），形似這一結(jié)構(gòu)類似木桶形狀，隨著肽單體的聚集，孔隙增大，細(xì)胞內(nèi)容物外泄導(dǎo)致細(xì)胞死亡，采用這種機制的AMP，一般包含雙親性的-螺旋、疏水性的-螺旋或-折疊片層結(jié)構(gòu)，或同時具備這些結(jié)構(gòu)，這是AMP形成穿膜孔洞發(fā)揮作用所必需的。

環(huán)膜孔模型（Toroidal-pore model）是指AMP分子以靜電作用吸附在細(xì)胞膜上，并誘導(dǎo)細(xì)胞膜的磷脂單分子層發(fā)生連續(xù)彎曲直至形成穿孔（圖1B），因此形成了由AMP分子和磷脂親水端分子共同組成的親水性環(huán)孔。與桶板模型不同的是，此模板中孔洞的內(nèi)表面是由磷脂親水部分和AMP的親水部分共同組成，而桶板模型的孔洞內(nèi)表面由AMP的親水部分組成。

毯式模型（Carpet model）是指AMP分子與細(xì)胞膜上帶負(fù)電的磷脂親水端相互吸引，AMP并不插入細(xì)胞膜內(nèi)而是先像地毯一樣覆蓋在磷脂雙分子層的表面（圖1C上）。當(dāng)AMP在細(xì)胞膜上的濃度達(dá)到一定的濃度后，細(xì)胞膜穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致完整性喪失，其它AMP分子由此進(jìn)入膜內(nèi)（圖1C下），導(dǎo)致脂雙分子層彎曲、菌膜破裂、胞內(nèi)物外滲，引起細(xì)菌死亡。

凝集模型（Aggregation model）是指陽離子肽直接與革蘭氏陰性菌的外膜脂多糖或革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁肽聚糖相互作用結(jié)合成復(fù)合物（圖1D）。凝集的細(xì)胞易發(fā)生被吞噬，是獲得細(xì)胞殺死機制的深入了解所必需的。到現(xiàn)在為止，天然產(chǎn)物中AMP成分的高效篩選方法大部分都是基于AMP與膜的相互作用發(fā)展而來。

圖1 AMP的膜作用機制[21-22]Fig.1 Membrane action mechanism of AMP[21-22]

1.2 非膜作用機制

近年，有新的觀點認(rèn)為AMP的作用機制除了上述描述的多種模型的膜作用方式外，還有非膜作用的方式。非膜作用方式主要分為胞內(nèi)作用機制和胞外作用機制，包括與DNA結(jié)合、抑制DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制、抑制蛋白合成和折疊、抑制細(xì)胞壁合成、抑制酶活性、影響細(xì)胞分裂等。核酸和蛋白質(zhì)等相互作用，從而通過對基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)的調(diào)控，或者抑制胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮而抑制和殺死細(xì)菌。如AMP S-thanatin是通過抑制細(xì)菌的呼吸作用來殺滅細(xì)菌，它可與脂多糖在體外及多重耐藥性大腸桿菌所致膿毒性休克小鼠模型中發(fā)生相互作用；AMP P7不是作用細(xì)胞膜的作用機制，而是抑制DNA的復(fù)制，在P7的影響下，參與大腸桿菌DNA復(fù)制相關(guān)的基因的表達(dá)下降，還抑制大腸桿菌DNA和RNA的合成。

需注意的是，無論AMP作用于膜作用機制還是非膜作用機制中，AMP都需要與細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生相互作用。有些AMP可在細(xì)胞膜上形成瞬間通道，進(jìn)入胞內(nèi)發(fā)生作用；甚至有AMP通過粘附于細(xì)胞膜上，在不破壞膜結(jié)構(gòu)、保持膜結(jié)構(gòu)完整的情況下導(dǎo)致菌體死亡。

2 AMP的高效篩選方法

天然AMP來源于生物體的不同部位，樣品復(fù)雜、多樣，如何快速鎖定和獲得AMP成分是目前的難點問題。當(dāng)今，AMP的篩選普遍采用“抗生素之父”瓦克斯曼開發(fā)的經(jīng)典方法（Waksman’s approach）進(jìn)行篩選，即將制備好的粗肽經(jīng)逐級、反復(fù)柱色譜分離純化，結(jié)合抗菌實驗得到純化的單一AMP。此法依循“活性制導(dǎo)分離”（Bioassay-guided fractionation，BGF）策略，以整體活性為導(dǎo)向，先分離、后鑒定、再逐一評價。該過程線性分析通量低、單次檢測信息量有限，導(dǎo)致工作量大、效率低、成本高、周期長，容易造成微量活性成分丟失，且肽的活性在冗長的分離過程中必然受到影響。顯然，傳統(tǒng)篩選方法在分析通量、分析效率、分析內(nèi)涵上均存在重大缺陷，嚴(yán)重制約了從天然產(chǎn)物復(fù)雜體系中篩選發(fā)現(xiàn)AMP成分。近年，涌現(xiàn)出多種新型的AMP篩選方法，包括整體細(xì)菌吸附結(jié)合法、細(xì)胞膜色譜法、磷脂膜色譜法、毛細(xì)管電泳法、比色法（上述基于膜作用機制為主），以及薄層色譜法、熒光篩選法、高通量測序法以及數(shù)據(jù)庫挖掘法等（基于非膜作用機制為主），其應(yīng)用比較如表1所示。通過綜合利用多種與抗菌活性相關(guān)的理化參數(shù)或結(jié)構(gòu)參數(shù)對肽進(jìn)行分級篩選，再對得到的多肽序列進(jìn)行評估分析，最終獲得所需的AMP。

表1 AMP的高效篩選方法的匯總與比較Table 1 Summary and comparison of efficient screening methods for AMP

2.1 整體細(xì)菌吸附結(jié)合法

整體細(xì)菌吸附結(jié)合法（Bacterial adsorption）是利用AMP與細(xì)菌細(xì)胞膜通過靜電作用，對比整體細(xì)菌混合孵育前后所得液相色譜差異峰，獲得潛在AMP成分所在色譜峰位置以此篩選出所需AMP。Pei等利用黃油加工后的副產(chǎn)品廢牦牛奶，將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮再添加相應(yīng)的酶進(jìn)行水解，與水熱法制備的納米磁性脂質(zhì)體結(jié)合，在37 ℃下孵育24 h，經(jīng)分離純化，測定吸光度并比較峰值，篩選出兩種抗菌肽并確定其氨基酸序列，即Arg-Val-Met-Phe-Lys-Trp-Ala和Lys-Val-Ile-Ser-Met-Ile。Pei等用同樣的方法將磁性脂質(zhì)體吸附與反相高效液相色譜相結(jié)合，從大鯢的血液中篩選出新的抗菌肽，通過N末端測序確定氨基酸序列，為Gly-Leu-Thr-ArgLeu-Phe-Ser-Val-Ile-Lys，將其命名為 andricin B。該方法與傳統(tǒng)方法相比，操作簡便，大幅縮短了篩選時間，具有很好的開發(fā)應(yīng)用價值。然而，活體細(xì)菌可能會吸附粗肽中其他蛋白成分，導(dǎo)致篩選準(zhǔn)確性降低，加大后續(xù)分離難度。

2.2 細(xì)胞膜色譜法

細(xì)胞膜色譜法（Cell membrane chromatography，CMC）是將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠表面，制成細(xì)胞膜固定相，再利用色譜學(xué)技術(shù)研究藥物與受體之間的相互作用規(guī)律的方法。AMP與細(xì)胞膜發(fā)生相互作用，使其在色譜上保留增強，從而快速將AMP成分從復(fù)雜體系中分離出來。Xiao等使用小鼠心房細(xì)胞膜制備的細(xì)胞膜親和層析柱成功地從麻風(fēng)樹粕蛋白粉（L.）籽粕（Seed cake）中篩選獲得陽離子麻瘋樹AMP（KVFLGLK與JCpep7），通過抑菌活性測試發(fā)現(xiàn)，JCpep7對傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有較強的抗菌活性。值得注意的是，相比于革蘭氏陰性菌，JCpep7對革蘭氏陽性菌更為敏感。Tang等利用大腸桿菌細(xì)胞膜制得的細(xì)菌細(xì)胞膜脂質(zhì)體色譜柱（Bacterial membrane liposome chromatography，IBMLC），從鳀魚提取物中，純化獲得了一種新型陽離子AMP：Apep10。抑菌活性測定結(jié)果表明，Apep10對大腸桿菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和肺炎鏈球菌具有抑制作用，MIC值范圍為8～64 μg/mL；溶血實驗也表明，低于20 μg/mL 的Apep10對小鼠紅細(xì)胞幾乎沒有細(xì)胞毒性，是一種潛在的食品防腐劑和抗菌藥物。顯然，細(xì)胞膜色譜法比傳統(tǒng)的活性制導(dǎo)分離法具有更高效、更快速、更靈敏及可重復(fù)性高的優(yōu)勢，但是該方法需將收集的菌膜包覆在大孔硅膠上，制備過程較為繁瑣，且在篩選過程中細(xì)胞膜容易流失及失去活性，使用壽命較短、成本也相對較高；同時，對細(xì)胞膜的高需求以及較低的AMP捕獲量，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。

2.3 磷脂膜色譜法

深入研究表明細(xì)菌細(xì)胞膜由磷脂雙分子層與鑲嵌蛋白質(zhì)構(gòu)成，磷脂雙分子層是細(xì)胞膜的基本骨架，主要成分包括磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholin，PC）、磷脂酰甘油（Phosphatidylglycerol，PG）、心磷脂（Cardiolipin，CL）等，而 AMP正是通過對特定磷脂成分（如PG和/或CL等）的特異性識別而發(fā)揮作用。磷脂膜色譜法（Phospholipid membrane chromatography）正是模擬磷脂膜來構(gòu)建人工模擬細(xì)胞膜，用不同方法，從不同角度探究AMP與磷脂膜之間的作用。Tang等使用蛋黃磷脂酰膽堿（Egg-yolk phosphatidylcholine，EYPC）和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（Dimyristoyl-sn-glycero-phosphatidylglycerol，DMPG）為單體，構(gòu)建人工模擬細(xì)胞膜固定相，以此模擬AMP與細(xì)胞膜的相互作用，結(jié)合固相萃取與高效液相技術(shù)，成功從卵白蛋白水解物中篩選到新型AMP Opep12（肽序為：RVASMASEKMKI），該 AMP 對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑菌活性。該方法是細(xì)胞膜色譜法的延伸，使用仿生磷脂模擬生物細(xì)胞膜，可避免生物菌膜活性降低及細(xì)胞膜大規(guī)模獲取困難的問題，具有使用壽命長、可選擇性多、操作簡單、制備簡易等優(yōu)點，在保證特異性的基礎(chǔ)上大幅提高其穩(wěn)定性。但是，磷脂膜色譜法與真實的活性細(xì)胞膜還存在著一定的區(qū)別；此外，受限于商品化磷脂的種類，這些模擬細(xì)胞膜材料在仿生性和特異性上還有所欠缺。

2.4 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法（Capillary electrophoresis，CE）是基于AMP有效電荷和相對分子質(zhì)量比例與離子遷移率的高度相關(guān)性，實現(xiàn)對已知氨基酸序列AMP的篩選。其核心仍然是基于AMP與膜結(jié)合的原理，建立與活菌結(jié)合的毛細(xì)管電泳模型，利用模型中的兩者親和力作用實現(xiàn)篩選。T?mová等選取12條已知序列的陽離子AMP化合物（在可變區(qū)域設(shè)定3～7個堿性氨基酸），構(gòu)建毛細(xì)管電泳模型，分別考察AMP有效電荷以及離子遷移率等物理-化學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，采用毛細(xì)管電泳法測定聚陽離子AMP的有效電荷和離子遷移率呈相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)了具有10～12個氨基酸殘基的較短HAL型AMP的有效電荷與相對分子質(zhì)量之比高于具有4～6個較長氨基酸殘基的HYL型 AMP。?olínová等采用此方法通過反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析，從大白蛉幼蟲血淋巴提取物中分離出二肽-丙氨酰酪氨酸（-Ala-Tyr），對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有抗菌活性，也有抗真菌性。CE法篩選效率高、重現(xiàn)性好、篩選速度快，但目前理論依據(jù)尚不完善，技術(shù)不成熟，因此存在明顯局限性，易造成漏檢和錯檢，故國內(nèi)外的報道較少。

2.5 比色法

比色法（Colorimetry）是通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來檢測待測組分的方法。 Jelinek等通過利用基于磷脂和聚合物聚二乙炔（Polydiacetylene，PDA）脂質(zhì)組成的囊泡與AMP相互作用時表現(xiàn)出顯著的顏色變化，從而實現(xiàn)AMP（K7L-蜂毒肽和W19-蜂毒肽）的篩選。Pan等用此方法對亞洲海洋蛤蜊Grube的勻漿經(jīng)濃縮、純化、匯集吸收峰并在凍干后測定微生物的活性，發(fā)現(xiàn)了一種新肽命名為：Perinerin，對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌均顯示出顯著的活性，這也表明具有殺菌作用。Perinerin 有可能作為一種方便的“評估標(biāo)記”來研究宿主生物化學(xué)的變化，特別是在環(huán)境變化方面。此類方法甚至能在幾秒內(nèi)得到天然肽類似物，并提供有關(guān)肽-膜相互作用和膜通透性機制的結(jié)構(gòu)和功能信息，具有操作簡單、快速有效等優(yōu)勢；但同時適用范圍有限，選擇性待提高。

2.6 薄層色譜法

薄層色譜法（Thin layer chromatography，TLC）是采用薄層色譜分離和生物活性測定相結(jié)合的生物技術(shù)，是一種直觀、可視化的篩選方法。Jaskiewicz等提出了一種快速分離、篩選AMP的薄層色譜法，粗肽在薄層板上分離后，將預(yù)先制備的板加入微生物懸浮液并進(jìn)行孵化，用細(xì)胞染色劑刃天青（Resazurin）預(yù)處理薄層板，潛在AMP成分將會在該區(qū)域出現(xiàn)染色的黃色斑點；使用標(biāo)準(zhǔn)AMP進(jìn)行試驗，證實了方法的可行性。其中CAMEL（KWKLFKKIGAVLKVLNH）和脂肽 PAL-KK-NH、Pal-KGK-NH在最低濃度下的抗菌活性最有效。Ramya等用此方法對海蛞蝓中的抗菌化合物進(jìn)行篩選，使用丙酮、丁酮、乙醇等不同溶劑的提取，在硅膠板均勻厚涂提取物并噴灑定位試劑（茚三酮試劑）時，觀察到TLC板上出現(xiàn)紫色至粉紅色斑點；該板顯示粉紅色斑點，表明存在氨基酸和肽。該方法為快速有效地篩選活性肽提供了可能性，可直觀從薄層板中尋找到潛在的AMP成分，然而該方法的分離能力有限，僅適用于簡單樣品的分析，難以滿足復(fù)雜體系的分離與篩選。

2.7 熒光篩選法

熒光篩選法（Fluorescence screening）是一種通過使用熒光染料檢查細(xì)胞對熒光染料的攝取情況或者測量細(xì)胞內(nèi)成分泄漏來篩選AMP的方法。Kodedová等通過使用新開發(fā)的熒光 diS-C3（3）檢測方法與 96 微孔板結(jié)合，從群居性蜜蜂（）的毒液中分離出Lasioglossin LL-III，測試并比較了蜜蜂毒液中分離的肽及其合成類似物，對念珠菌的7種菌株，具有生物技術(shù)潛力的非傳統(tǒng)酵母和14株釀酒酵母均有效。Pasupuleti等利用-半乳糖苷酶能降解非顯色底物鄰硝基苯基-D-吡喃半乳糖苷（Dgalactopyranoside，ONPG）為顯色底物鄰硝基苯酚（O-Nitrophenolate，ONP）的特性，通過AMP將-半乳糖苷酶從大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中流出來并切割ONPG以產(chǎn)生ONP，該方法可在4 h內(nèi)得出化合物的抗菌活性，測定肽GKH175W和KNK5W在低pH和高鹽濃度的有效性。該方法篩選靈敏度高、消耗量少、快速、成本低，精確度高且不需要載體，但可測量的化合物數(shù)量少，有些化合物反應(yīng)熒光持續(xù)的時間較短，熒光的發(fā)散方向不集中。

2.8 高通量測序法

基于基因的高通量測序的篩選方法（Highthroughput sequencing，HTS）是近幾年正在發(fā)展的新興的AMP篩選技術(shù)之一，根據(jù)AMP的基因具有同源序列相似性的特點實施精準(zhǔn)篩選。Yi等用此方法根據(jù)彈涂魚（，BP）和大鰭彈涂魚（，PM）的基因組和轉(zhuǎn)錄，鑒定出507個AMP轉(zhuǎn)錄本。在被鑒定的AMP中，449個序列是此前未曾出現(xiàn)的，且大部分的AMP在兩種彈涂魚中的轉(zhuǎn)錄模式是不同的，并發(fā)現(xiàn)兩種AMP（血紅蛋白1和淀粉樣蛋白），對藤黃微球菌（）具有高度抑制作用。該方法高效快速，可一次性獲得大量AMP的信息，但具有一定局限性，必須依賴已知的AMP的基因為模板預(yù)測基因序列，并且只對同源性物種有效。目前常規(guī)分析軟件已經(jīng)不能滿足大量的數(shù)據(jù)資料的需求，只有進(jìn)一步發(fā)展出快速準(zhǔn)確的分析軟件和方法才能更好地展現(xiàn)高通量測序技術(shù)的優(yōu)勢和應(yīng)用價值。

2.9 數(shù)據(jù)庫挖掘法

數(shù)據(jù)庫挖掘法（Mining databases screening）是在生物活性篩選之前，利用數(shù)據(jù)庫中的分子對接軟件模擬目標(biāo)靶點與候選藥物之間的相互作用，計算兩者之間的親和力大小，以降低實際篩選化合物數(shù)目，同時提高先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)效率。AMP數(shù)據(jù)庫挖掘法包含來自不同生物來源的候選肽，如細(xì)菌、昆蟲、蛛形綱動物、被膜動物、兩棲動物、魚類和哺乳動物等。Menousek等基于“APD專業(yè)數(shù)據(jù)庫”評估了30種潛在的肽對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant，MRSA）的抑制效果，發(fā)現(xiàn)了6種有效的抗 MRSA 候選藥物，并獲得了一種易于生產(chǎn)的合成類AMP（DASamP1），其能有效防止金黃色葡萄球菌生物膜建立。Liu等對自建的“內(nèi)源性牛乳肽數(shù)據(jù)庫”進(jìn)行虛擬篩選，篩選出248種多肽中有23個被確定為具有抗菌作用的候選肽，利用此方法表明乳源AMP可能作為功能性食品成分，有助于揭示乳抗感染作用的分子機制。Yi等利用“Fish-T1K數(shù)據(jù)庫”通過轉(zhuǎn)錄組生成的擴展數(shù)據(jù)集高通量篩選出小免疫肽和AMP，獲得了來自87個鰓轉(zhuǎn)錄組的小免疫相關(guān)肽的大規(guī)模數(shù)據(jù)集，首次闡明不同生境和遺傳對小免疫肽和AMP轉(zhuǎn)錄數(shù)的影響。此外，Universal Protein、ZINC數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫也是AMP篩選較為常用的數(shù)據(jù)庫。

近年，人工智能法（Artificial intelligence，AI）飛速發(fā)展，深度學(xué)習(xí)（Deep learning）模型為人們從天然產(chǎn)物中快速發(fā)現(xiàn)AMP提供了劃時代的“武器”；同時，也推動非監(jiān)督式或半監(jiān)督式的特征學(xué)習(xí)和分層特征提取高效算法的發(fā)展，可替代固定數(shù)據(jù)庫挖掘模型的手工獲取特征。如Chen和他的研究團(tuán)隊采用自然語言學(xué)習(xí)（Nature language processing，NLP）的多種神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法，把氨基酸序列作為學(xué)習(xí)語言，訓(xùn)練人工智能學(xué)習(xí)現(xiàn)有AMP的組織方式，根據(jù)經(jīng)驗識別氨基酸短序列，區(qū)分相似的多肽。這種模式提高了篩選的“洞察力”及“自動學(xué)習(xí)性”。通過選取三種NLP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型來預(yù)測鑒定，該研究實現(xiàn)了AMP挖掘模型的構(gòu)建和優(yōu)化：在測試集中，該模型的精確度達(dá)到了91.31%；對1萬多個天然來源微生物組進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)216種潛在的新型AMP，其中83.8%具有抗菌活性。

綜上可見該方法效率高、成本較低、精確度高、實時性強，加快AMP的檢索速度且保證AMP數(shù)據(jù)的一致性和安全性，但其結(jié)果尚需要進(jìn)一步驗證，一般僅適合初篩。

3 總結(jié)及展望

天然AMP具有廣泛的生物活性存在于各種生物體內(nèi)，其作為宿主防御系統(tǒng)的第一道防線備受關(guān)注。一般認(rèn)為AMP的膜作用機制是最普遍的，但深入研究發(fā)現(xiàn)AMP還可能有多種途徑發(fā)揮作用，其多樣性與作用機制研究還需深入研究。在過去的幾十年里，AMP傳統(tǒng)的篩選方法中從步驟、效率、成本等方面得到大幅度提高。應(yīng)運而生的眾多高效、快速篩選新方法中，很大一部分方法需要特定的基因模板和載體，但并非所有的化合物都能產(chǎn)生熒光，因此限制了其發(fā)展。

近年，精密儀器加工技術(shù)的成熟，推動了許多新的篩選策略突破傳統(tǒng)BGF策略的桎梏，得到了長足的發(fā)展。展望未來，新興的“近線超微分離”（At-line nanofractionation，ANF）高內(nèi)涵篩選策略有可能成為AMP篩選的重要方法。其基本原理主要是復(fù)雜樣本經(jīng)色譜高效分離后分流，一部分進(jìn)入高分辨質(zhì)譜獲取結(jié)構(gòu)信息，另一部分經(jīng)流分收集后同步進(jìn)行生物活性評價獲取活性數(shù)據(jù)；通過色譜、質(zhì)譜及活性譜圖的擬合實現(xiàn)篩選。近年，Kool及其團(tuán)隊通過整合常規(guī)液相、質(zhì)譜及自主改造的384孔板微流分收集裝置，成功創(chuàng)建了基于ANF策略的篩選平臺，應(yīng)用于一系列天然產(chǎn)物的分析，從中發(fā)現(xiàn)了多種酶抑制劑活性成分，證明了相關(guān)策略和技術(shù)的合理性；最近，Richardson和Kool團(tuán)隊等合作，以ANF篩選模式為基礎(chǔ)結(jié)合刃天青還原試驗（Resazurin-reduction assay），從41種蛇毒毒液中篩選并鑒定得到28種抗菌活性蛋白，說明了ANF策略用于抗菌活性成分的可行性。然而，常規(guī)液相的分析尺度存在明顯的局限性，一般沒有紫外吸收的AMP成分對相關(guān)檢測器有一定要求，而且384孔板的分析通量也嚴(yán)重不足，刃天青還原試驗評價抗菌活性也缺乏普適性，勢必影響其AMP篩選上的推廣。目前，有關(guān)ANF策略應(yīng)用于AMP樣品篩選上的研究尚鮮見報道，但在研究邏輯上的突破為AMP篩選揭示了一種全新的篩選方法與理念。

除了實篩以外，虛擬篩選也是未來重要的技術(shù)發(fā)展方向。隨著機器學(xué)習(xí)的深入發(fā)展，或?qū)⑦M(jìn)入AMP藥物及活性成分虛選技術(shù)的高速發(fā)展階段；也意味著甚至可通過海量的基因組數(shù)據(jù)，發(fā)掘主動設(shè)計、從頭生產(chǎn)自然界不存在的AMP。值得高度關(guān)注的是，微生物在復(fù)雜的人體環(huán)境中產(chǎn)生AMP的巨大潛能，提供了通過微生態(tài)關(guān)系從微生物組數(shù)據(jù)中直接發(fā)現(xiàn)活性成分的科學(xué)依據(jù)。綜上所述，研究AMP動態(tài)作用機制的細(xì)節(jié)，有助于對其臨床應(yīng)用前景及可能產(chǎn)生的問題有充分的認(rèn)識，使醫(yī)療、食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的研究開發(fā)更具有針對性，也為AMP的工業(yè)化制備、產(chǎn)業(yè)化規(guī)模擴大奠定了基礎(chǔ)。