董曉敏 王朝南 林瑞芳 林雅靜

骨質(zhì)疏松癥是因骨代謝平衡失調(diào)導致的以骨強度降低、骨折風險增加為特征的骨骼系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞，進而引起骨脆性增加，容易發(fā)生骨折[1]。骨質(zhì)疏松癥相關性疾病的發(fā)病率、致殘率和病死率在老年患者中逐年增加，尤其是絕經(jīng)后婦女罹患骨質(zhì)疏松癥遠大于男性，主要與雌激素缺乏相關，通過積極治療延緩骨量減少速度，可顯著減低骨折發(fā)生，對已發(fā)生骨折的患者也可有效防止再次發(fā)生骨折。阿魏酸是一種酚酸類成分，是抗骨質(zhì)疏松癥常用中藥當歸、川芎的有效成分之一。除抗氧化作用外，研究表明，阿魏酸還能通過調(diào)節(jié)凋亡基因，從而發(fā)揮抗成骨細胞凋亡的作用[2]。阿魏酸可刺激體外培養(yǎng)的成骨細胞增殖、分化和礦化，促進成骨相關基因的表達[3]。本研究通過觀察阿魏酸對去勢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨微結(jié)構(gòu)和骨代謝的影響，探討其防治骨質(zhì)疏松癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取2 月齡Wistar 雌性大鼠40只，體質(zhì)量為（225±25）g，實驗動物由溫州醫(yī)科大學動物實驗中心提供。實驗中，所有大鼠自由進食和飲水，使用標準飼料，其中鈣含量為1%，磷含量0.8%，70%～80%碳水化合物和5%脂肪。飼養(yǎng)環(huán)境溫度25 ℃，相對濕度50%～70%，12 h 晝夜循環(huán)周期。本研究得到溫州醫(yī)科大學動物實驗中心倫理委員會批準（批號wydw2021-0580）。

1.2 試劑和儀器 阿魏酸（上海源葉生物科技有限公司，批號B20007）、堿性磷酸酶（ALP）（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號ml003360）、骨鈣素酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號ml002883）。雙能X 線骨密度儀（美國Hologic 公司，型號：Discovery Wi）、Micro-CT（德國BRUKER 公司，型號：Skycan1276）、LEICA RM2235切片機（德國LEICA 公司，型號：RM2235）、生物顯微鏡（德國Zeiss 公司，型號：Axio Lab.A1）。

1.3 分組和模型制備 所有大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，40 只Wistar 雌性大鼠采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、阿魏酸低劑量組和阿魏酸高劑量組，每組10 只。使用1%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉所有大鼠，在左右軟肋下剪開皮膚，分離筋膜，顯露腹腔，找到雙側(cè)卵巢及周圍組織，其中假手術(shù)組僅切除卵巢周圍脂肪組織（卵巢大小），模型組、阿魏酸低劑量組和阿魏酸高劑量組切除雙側(cè)卵巢組織建立骨質(zhì)疏松模型。手術(shù)結(jié)束時所有大鼠均給予青霉素預防感染，過程順利，無大鼠死亡。術(shù)后所有大鼠連續(xù)3 d 肌注青霉素鈉預防感染（每天20 萬U）。術(shù)后1 周，待大鼠狀態(tài)恢復后，開始喂養(yǎng)干預。假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水[50 mL/（kg·d）]灌胃，阿魏酸低劑量組和阿魏酸高劑量組分別給予等量阿魏酸[20、80 mg/（kg·d）]灌胃，藥物劑量參考文獻[4]，研究顯示該劑量可改善骨質(zhì)高轉(zhuǎn)換狀態(tài)。每天上午灌胃1 次，連續(xù)12 周。

1.4 檢測指標 治療結(jié)束時用適量水合氯醛麻醉處死大鼠，經(jīng)下腔靜脈采血，4 ℃離心分離制備血清，使用全自動生化儀測定血鈣、血磷濃度，按照ALP 及骨鈣素ELISA 試劑盒說明測定ALP 和骨鈣素（OC）水平。獲取各組大鼠雙側(cè)股骨，剔除肌肉等結(jié)締組織，對右側(cè)股骨采用骨密度儀及Micro-CT 測定骨密度和骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括皮質(zhì)骨骨小梁體積比率（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁間隙（Tb.Sp）。各組大鼠左側(cè)股骨取10%甲醛固定液固定24 h，轉(zhuǎn)75%乙醇脫水過夜，常規(guī)石蠟包埋，制作病理學切片，片厚3 μm，HE 染色，生物顯微鏡下觀察股骨HE 染色情況及骨小梁形態(tài)。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間樣本比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA）分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸對大鼠血清骨代謝指標的影響 給藥12 周后，與模型組比較，阿魏酸低、高劑量組大鼠血清鈣、磷濃度和ALP 含量均無明顯差異（P＞0.05），阿魏酸低、高劑量組大鼠OC 含量有所下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠骨代謝指標比較（）

表1 各組大鼠骨代謝指標比較（）

注：假手術(shù)組為僅切除卵巢周圍脂肪，未切除卵巢；模型組為手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，等量生理鹽水灌胃；阿魏酸低劑量組為手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，給予阿魏酸20 mg/（kg·d）灌胃；阿魏酸高劑量組為手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，給予阿魏酸80 mg/（kg·d）灌胃；ALP 為堿性磷酸酶；OC 為骨鈣素；與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.2 阿魏酸對大鼠股骨骨小梁的影響 在股骨骨微結(jié)構(gòu)測定上，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨密度、BV/TV、Tb.Th 以及Tb.N 都有不程度下降，而Tb.Sp增大（P<0.05）；與模型組比較，阿魏酸低、高劑量組骨密度、BV/TV、Tb.Th 以及Tb.N 均有明顯回升，而Tb.Sp 變?。≒<0.05），見表2。

表2 各組大鼠股骨近端骨骨微結(jié)構(gòu)指標比較（）

表2 各組大鼠股骨近端骨骨微結(jié)構(gòu)指標比較（）

注：假手術(shù)組為僅切除卵巢周圍脂肪，未切除卵巢；模型組為手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，等量生理鹽水灌胃；低劑量組為手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，給予阿魏酸20 mg/（kg·d）灌胃；高劑量組為手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，給予阿魏酸80 mg/（kg·d）灌胃；BMD 為骨密度；BV/TV 為骨小梁體積比率；Tb.Th 為骨小梁厚度；Tb.N 為骨小梁數(shù)目；Tb.Sp 為骨小梁間隙；與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.3 股骨組織切片觀察 股骨干骺端HE 染色如下圖顯示，與假手術(shù)組比較，模型組切除雙側(cè)卵巢后，大鼠股骨骨松質(zhì)骨小梁排列變薄稀疏，髓腔增大；與模型組比較，阿魏酸組組織切片顯示骨皮質(zhì)增厚且連續(xù)，骨小梁相對體積變大，數(shù)量增多，表明骨結(jié)構(gòu)有所恢復。見圖1。

3 討論

絕經(jīng)后女性由于雌激素的缺乏，造成骨吸收和骨成形的動態(tài)平衡失調(diào)，導致骨成形率低于骨吸收率，進而使得體內(nèi)骨量減少和骨強度逐漸下降[5]。中藥治療骨質(zhì)疏松，在有效改善骨量的同時，能明顯減少相關不良反應的發(fā)生[6]。研究表明，去勢大鼠模型的雌激素、骨骼變化和絕經(jīng)后婦女改變相似[7]，故本研究通過去勢大鼠建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型來研究阿魏酸抗骨質(zhì)疏松的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激會抑制成骨細胞分化，增加破骨細胞的分化的吸收功能[8]，被認為是骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制中重要原因[9]。眾所周知，阿魏酸被認為具有抗炎抗氧化等多種生物作用[10]。在誘導缺氧誘導因子通路傳導時，阿魏酸同時會促進β-連環(huán)蛋白在間充質(zhì)干細胞表達，此過程可促進間充質(zhì)干細胞成骨，增加ALP 和OC 的含量[11]，同時促進成骨細胞表達骨保護素mRNA 和骨活素mRNA，誘導生成鈣化結(jié)節(jié)，進而促進成骨形成。有學者發(fā)現(xiàn)，阿魏酸40～640 μmol/L 濃度時可以促進骨細胞鈣化結(jié)節(jié)形成，在40～2560 μmol/L 濃度時會促進成骨細胞分化功能[3]。ALP 是成骨細胞分化早期特異性標志之一，而骨鈣素不僅是成骨細胞活性標志[12]，還能反映骨轉(zhuǎn)化狀態(tài)，即血清骨鈣素水平會隨著骨轉(zhuǎn)化增強而升高[13]。在實驗中，經(jīng)過去卵巢處理，缺乏雌激素的模型組和阿魏酸組大鼠血清ALP 和OC 濃度都高于假手術(shù)組，同時由于阿魏酸低、高劑量組均能抑制骨轉(zhuǎn)化過程中血清OC 水平的升高，實驗中測定OC 含量均低于模型組（P＜0.05），這也反映阿魏酸具有增強成骨細胞活性、促進增殖分化的作用。此外，有學者發(fā)現(xiàn)雌激素受體亞型GPR30 對骨保護有重要作用[14]，阿魏酸等中藥的相關活性成分可通過特異性激活GPR3O 通路促進骨生長，還能避免傳統(tǒng)雌激素替代治療引起子宮內(nèi)膜增厚等副作用[2]。目前已知破骨細胞是體內(nèi)唯一具有骨吸收能力的細胞，在骨代謝中破骨細胞的數(shù)量和活性與骨質(zhì)疏松癥的形成密切相關[15]。

研究表明，核因子κB（NF-κB）信號通路是介導骨吸收和骨成形之間平衡的重要通路[16]，其中NFκB 是成熟破骨細胞存活和發(fā)揮作用的關鍵調(diào)節(jié)因子[17]。阿魏酸通過下調(diào)核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）誘導的NF-κB 活化水平，抑制RANKL 誘導的破骨細胞分化，從而減少破骨細胞的生成，并使破骨細胞的骨吸收活性下降[18]。研究表明，通過Micro-CT 觀察骨微結(jié)構(gòu)能較靈敏反映骨質(zhì)疏松癥的早期表現(xiàn)[19]。本實驗結(jié)果顯示，通過去勢干預，模型組大鼠股骨骨小梁排列稀疏變薄，髓腔變大，而阿魏酸組的大鼠骨皮質(zhì)增厚且連續(xù)，皮質(zhì)骨量增加，松質(zhì)骨網(wǎng)結(jié)構(gòu)致密，且骨量增加與阿魏酸劑量成正相關，大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 較模型組顯著增加，Tb.Sp呈下降趨勢（P＜0.05），表明阿魏酸在合適濃度范圍內(nèi)可以防止骨質(zhì)流失，增加骨礦沉積，糾正雌激素缺乏的骨代謝失衡，改善去勢骨質(zhì)疏松癥的骨微結(jié)構(gòu)，這對預防骨質(zhì)疏松有重要作用。

總之，本研究結(jié)果表明，阿魏酸對去勢大鼠骨微結(jié)構(gòu)有一定改善作用，可促進骨形成，增加骨量，可能是治療骨質(zhì)疏松的潛在選擇。