馮 莉 楊佳雪 李 新 賈長琪 蔣晨曦

(首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科， 北京 100029)

先天性長QT綜合征(congenital long QT syndromes, LQTs)屬編碼心肌細胞離子通道基因缺陷致心室復極延長的心電生理疾病，具有靜息心電圖QT間期延長、惡性室性心律失常發(fā)生、心臟結(jié)構(gòu)正常及家族分布性和遺傳傾向等特征。臨床癥狀可表現(xiàn)為心悸、黑朦，典型心律失常發(fā)作時呈現(xiàn)尖端扭轉(zhuǎn)性室速，可誘發(fā)暈厥和心源性猝死。自1995年首例LQTs致病基因突變位點發(fā)現(xiàn)以來，目前已確認致病基因17個，均為離子通道/通道復合體蛋白編碼基因[1]。依據(jù)致病基因，LQTs臨床上分為17型，其中LQT2最為常見，約占所有LQTs的35%～40%。相關(guān)致病基因KCNH2編碼心肌細胞快速延遲整流鉀離子通道(rapidly activating delayed rectifier K+channel, IKr)α亞基(the human ether-à-go-go-related gene，hERG)，全長1 159個氨基酸，包含6個跨膜結(jié)構(gòu)域、N末端和C末端兩個細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。傳統(tǒng)觀念認為Ikr結(jié)構(gòu)為單源四聚體結(jié)構(gòu)，通道主體由4個a亞基(hERG1a)構(gòu)成(圖1)，目前相關(guān)致病突變功能學研究結(jié)果多源自hERG1a單源四聚體通道。

圖1 KCNH2、hERG1a、 hERG1b結(jié)構(gòu)簡圖

1997年,Lees-Miller等[2]和London等[3]同年分別證實了人、犬心肌中均存在KCNH2的其他轉(zhuǎn)錄本：hERG1b，提示組成IKr通道四聚體存在hERG1a/hERG1b二源四聚體可能。hERG1b轉(zhuǎn)錄起始于KCNH2外顯子5與外顯子6之間，形成特有hERG1b 外顯子1，其氨基酸構(gòu)成相對于hERG1a缺少其N末端340氨基酸[4-5](圖1)。hERG1b的發(fā)現(xiàn)推動IKr通道結(jié)構(gòu)研究進入另一個新的階段。2008年，Sale等[6]通過體外共轉(zhuǎn)染hERG1a/hERG1b，發(fā)現(xiàn)IhERG1a/hERG1b較IhERG1a通道在激活、失活后恢復以及滅活速度方面顯著加快，更接近IKr生理特性；且hERG1b獨有突變亦可致LQT2發(fā)生, 表明了hERG1b參與形成的二源四聚體對維持IKr生理功能的重要性。后續(xù)研究[7-8]相繼證明了IhERG1a/hERG1b二源四聚體通道是人體心肌細胞IKr電流調(diào)控的重要靶點，并參與心力衰竭等病理過程中心律失常的發(fā)生。既往LQT2致病基因功能學研究多圍繞hERG1a單源四聚體通道(IhERG1a)，鮮有致病突變對hERG1a/hERG1b二源四聚體通道(IhERG1a/hERG1b)功能影響的研究。McPate等[9]對hERG突變N588K功能學的研究顯示，該突變對IhERG1a和IhERG1a/hERG1b功能學影響存在差異，提示hERG突變相關(guān)研究，應同時考慮突變表達hERG1a/1b通道功能的影響。

KCNH2c. 209核苷酸位點 A>G雜合子錯義突變，導致第70位密碼子由組氨酸替換精氨酸(H70R)，位于hERG1b缺失的340氨基酸內(nèi)，hERG1a獨有的PAS結(jié)構(gòu)域內(nèi)。已有研究[10-11]顯示，H70R可導致IhERG電流密度下降，且可能加快通道滅活。因H70R屬hERG1a特有突變，變異不影響hERG1b編碼，對IhERG1a/hERG1b二源四聚體功能的影響尚不清楚。本研究旨在已有報道研究的基礎上，進一步對H70R二源四聚體功能進行探討，比較hERG1a特有突變對二源四聚體與單源四聚體功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMEM 高糖培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司，美國);Lipo-fectamineTM2000 試劑(Invitrogen 公司，美國)。細胞內(nèi)外液試劑(NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、D-glucose、HEPES、NaOH、EGTA、MgATP、KOH)(Sigma 公司，美國)。攜帶KCNH2 c. 209 A>G突變pcDNA3.1質(zhì)粒及野生型KCNH2 cDNA的pcDNA3.1質(zhì)粒(美國Wisconsin大學CMARP實驗組贈予)，Axopatch 700B膜片鉗放大器(Axon公司,美國)，Digidata 1322數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Axon公司,美國)。Sutter p-97微電極拉制儀(Sutter公司,美國)，MF-830微電極拋光儀(Narishige公司,日本)。

1.2 突變誘導，載體表達

應用定點突變誘導試劑盒，對攜帶有野生型KCNH2 cDNA的pcDNA3.1進行c. 209 A>G突變誘導。突變誘導后進行DNA測序證實c. 209 A>G突變存在。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，應用人胚腎(human embryonic kidney, HEK)293細胞分別轉(zhuǎn)染入KCNH2(c. 209 A>G)突變型、野生型KCNH2-1a、KCNH2-1b質(zhì)粒；應用pEGFP基因與目的基因共轉(zhuǎn)染作為熒光指示劑。

1.3 全細胞膜片鉗記錄

在HEK293細胞瞬時轉(zhuǎn)染后24～48 h，采用全細胞膜片鉗記錄細胞IKr通道電流，并分析通道功能。應用Axopatch 700B放大器記錄通道電流；Digidata1322數(shù)模轉(zhuǎn)化器對采集電流進行轉(zhuǎn)換(采樣頻率 50 kHz，濾波 5 kHz)；所有實驗均在室溫(20 ℃～24 ℃)下進行。以pClampex 10.0軟件設計電壓刺激程序、采集電流數(shù)據(jù)；設定鉗制電壓為-80 mV，在不同去極化電壓-80～60 mV之間鉗制4 s，以10 mV階躍，使通道激活，記錄通道激活電流; 階躍后保持電壓-50 mV持續(xù)5 s，記錄尾電流。滅活曲線記錄：鉗制電壓-80 mV，短暫去極化至+40 mV并自-40 mV～-110 mV以-10 mV階躍獲得不同激活電壓尾電流。電極阻抗于2～4 MΩ。電流密度以電流值除以細胞電容得出。細胞外液(mmol/L)：NaCl 135、KCl 5.4、CaCl21.8、MgCl21、D-glucose 10和HEPES 10，用NaOH液將pH值調(diào)至7.4，細胞內(nèi)液(mmol/L)： KCl 130、MgCl2l、HEPES 5、EGTA 10、MgATP 5，用KOH液將pH值調(diào)至7.2。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用pClampex 10.0和Orgin 6.0軟件擬合分析數(shù)據(jù)并繪圖。穩(wěn)態(tài)激活曲線應用Boltzmann方程擬合獲得：I-V=Gmax×(V-Erev)/(1 + exp(V-V)/k),Gmax代表最大電導，Erev代表反轉(zhuǎn)電位，V代表半激活電壓，k為斜率因子。應用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗或方差分析(組間兩兩比較采用Tukey檢驗)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H70R突變對IhERG1a單源四聚體通道功能的影響

分別瞬時轉(zhuǎn)染野生型hERG1a(WT)以及突變型hERG1a(H70R)質(zhì)粒入HEK293細胞。利用全細胞膜片鉗記錄IhERG1a電流，結(jié)果顯示，H70R突變型IhERG1a較野生型峰電流密度[(27.55±6.69)PA/PFvs(48.56 ±9.45)PA/PF]及尾電流密度[(24.09±7.08)PA/PFvs(60.46±9.19)PA/PF,P<0.001]顯著降低約42%(圖2)。穩(wěn)態(tài)激活曲線分析顯示IhERG1a(H70R)曲線較IhERG1a(WT)明顯左移，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,IhERG1a(H70R)顯著降低半激活電壓[IhERG1a(H70R): (-15.07±0.59) mVvsIhERG1a(WT):(-7.05±0.51)mV,P< 0.05]，通道動力學參數(shù)詳見表1。

圖2 HEK293細胞表達KCNH2 (H70R)正常對照電流圖及I-V曲線

表1 hERG通道動力學激活/滅活參數(shù)

2.2 H70R突變對IhERG1a/hERG1b二源四聚體通道功能的影響

分別共轉(zhuǎn)染野生型hERG1a(WT)/hERG1b及突變型hERG1a(H70R)/hERG1b質(zhì)粒入HEK293細胞。全細胞膜片鉗記錄Ikr電流結(jié)果顯示，突變型IhERG1a(H70R)/hERG1b較野生型IhERG1a(WT)/hERG1b峰電流密度[(44.31±15.24) PA/PFvs(130.41 ±13.75) PA/PF)]及尾電流密度[(42.07 ±12.42) PA/PFvs(97.10 ±7.28) PA/PF])顯著降低約61%(圖3)。穩(wěn)態(tài)激活曲線分析顯示突變型IhERG1a(H70R)/hERG1b較野生型IhERG1a(WT)/hERG1b通道左移，半激活電壓顯著下降[(-15.14± 0.72) mVvs(-8.77±1.36) mV]。

圖3 HEK293細胞表達KCNH2 (H70R)及正常對照 hERG1a/1b二源四聚體通道電流圖及I-V曲線

2.3 H70R突變對IhERG1a與IhERG1a/hERG1b滅活動力學研究

應用全細胞膜片鉗記錄IKr滅活曲線(圖4A)，結(jié)果顯示,H70R對IhERG1a與IhERG1a/hERG1b滅活速度無顯著影響，快速及緩慢滅活時間常數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。IhERG1a/hERG1b較IhERG1a滅活速度顯著加快，快速及緩慢滅活時間常數(shù)顯著縮短(圖4B,C,D)。

圖4 HEK 293細胞表達hERG通道滅活電流曲線

3 討論

LQT2是最早發(fā)現(xiàn)的LQTs之一，已有超過200個以上KCNH2突變證實與LQT2發(fā)病相關(guān)，我國目前報道LQT2相關(guān)KCNH2突變10余個[12]。致病突變往往影響IKr功能，通過負顯性效應或單倍體不足最終導致患者心肌細胞IKr電流減弱，復極時間延長而致病。目前LQT2發(fā)病機制歸納為四類：(1)突變影響hERG1轉(zhuǎn)錄/翻譯，至IKr表達減少，電流減弱。(2)突變影響蛋白結(jié)構(gòu)，無法轉(zhuǎn)運至細胞膜，滯留并降解于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；(3)突變造成通道動力學障礙，直接導致電流減弱；(4)突變致通道對鉀離子通透性降低，電流減弱[13]。約40%的LQT2相關(guān)突變屬于無意突變、移碼突變、插入、缺失或形成截短蛋白影響hERG合成或翻譯屬于1類機制。錯意突變占LQT2已知突變的約60%，往往通過改變hERG單個氨基酸造成hERG轉(zhuǎn)運障礙或通道動力學改變致病，屬2,3,4類機制。

IKr為單源/二源四聚體結(jié)構(gòu)，通道主體由4個a亞基(hERG1)構(gòu)成。其全長轉(zhuǎn)錄本hERG1a含有1 159個氨基酸，包含6個跨膜結(jié)構(gòu)域以及N末端、C末端2個細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。N末端含有PerArntSim結(jié)構(gòu)域(PASD)并含有PAS帽，形成EAG鉀通道所特有的保守“EAG”結(jié)構(gòu)域[14]。C末端包含環(huán)核苷酸結(jié)構(gòu)域(cyclic-nucleotid-binding-domain,CNBHD),以及C 末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號結(jié)構(gòu)域(ER retention signal，RXR)和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil，CCD)。

目前對PAS結(jié)構(gòu)域突變致病機制尚存在爭議，1999年Chen等[10]對8個PAS結(jié)構(gòu)域突變(F29L、 N33T、 G53R、 R56Q、 C66G、 H70R、 A78P、 L86R)利用爪蟾卵母細胞進行體外表達，全細胞膜片鉗研究結(jié)果提示，8個突變(包括H70R)均顯著加速IKr電流滅活，部分突變同時減慢了IKr失活后恢復速度,從而認為PAS結(jié)構(gòu)域功能參與調(diào)節(jié)IKr滅活速度。2011年， Gianulis 等[11]應用HEK293細胞表達體系對11個PAS突變的膜片鉗研究結(jié)果顯示，包括H70R在內(nèi)的3個突變致病機制為HERG轉(zhuǎn)運障礙，對IKr通道滅活速度無影響。同樣作為IKr的a亞基hERG1a和hERG1b最大區(qū)別之處即為是否含有PAS結(jié)構(gòu)域， hERG1b全長890個氨基酸，缺少N末端PAS結(jié)構(gòu)域。IKr單源四聚體與二源四聚體最主要不同為PAS數(shù)量，hERG1a單源四聚體含有4個PAS結(jié)構(gòu)域，hERG1a/hERG1b二源四聚體可含1～3個PAS結(jié)構(gòu)域。PAS結(jié)構(gòu)域具有高度保守特點，其功能學研究一直是IKr功能的重點[15]。本研究突變H70R位點位于PAS結(jié)構(gòu)域內(nèi)，因此推測H70R可能僅導致hERG1a異常，進而出現(xiàn)IKr單源四聚體與二源四聚體功能的改變不同。且已有研究[9]顯示，HERG突變對IKr單源四聚體與二源四聚體功能影響存在不一致性。因此本研究進一步比較了已知hERG1a突變H70R對hERG1a單源四聚體及hERG1a/hERG1b二源四聚體通道功能改變的影響。

結(jié)果顯示，H70R可顯著抑制IhERG1a及IhERG1a/hERG1b峰電流及尾電流密度；對IhERG1a/hERG1b電流抑制程度更為顯著。H70R可使IhERG1a及IhERG1a/hERG1b穩(wěn)態(tài)激活曲線左移，均顯著降低半激活電壓。對IKr滅活功能分析結(jié)果顯示，hERG1a(H70R)對IhERG1a及IhERG1a/hERG1b滅活無顯著影響，而IhERG1a/hERG1b較IhERG1a滅活顯著加快。與既往研究相比，本研究結(jié)果顯示，H70R并不加快hERG1a單源四聚體滅活，與Gianulis 等[11]報道一致，支持H70R致LQT2機制為轉(zhuǎn)運障礙。進一步對hERG1a/hERG1b二源四聚體功能的研究顯示，H70R對IhERG1a/hERG1b與IhERG1a功能的改變趨勢一致，但更顯著抑制IhERG1a/hERG1b電流密度(61%vs42%；P<0.001)，此結(jié)果是對H70R致LQT2機制的重要補充。本研究的局限性在于體外轉(zhuǎn)染HEK293細胞不能準確表達hERG1a與1b的生理狀態(tài)比例，無法精確控制表達探索雜合狀態(tài)H70R對HERG二源四聚體功能的改變，這也是異源表達系統(tǒng)的局限性限制。2006年人類多能誘導干細胞衍化成功奠定了建立自體細胞模型的基礎，LQT1、 LQT2 hiPSC-CMs模型功能學研究結(jié)果先后被報道，證實了患者特異hiPSC-CM LQTs模型在表型模擬和機制研究中的可靠性[16-17]，包括藥物治療和進一步功能探索也有進展[18-19]，望今后能通過同源表達系統(tǒng)進一步明確此機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明馮莉: 研究設計,主要膜片鉗實驗,論文撰寫; 楊佳雪: 細胞培養(yǎng),轉(zhuǎn)染, 參與論文撰寫投稿; 李新: 基因信息檢索, 細胞培養(yǎng); 賈長琪: 臨床咨詢, 論文撰寫; 蔣晨曦: 研究設計, 論文撰寫。