張 鑫，李 晨，4，張 帥，王 羽，田洪濤，2，4*，王妙姝

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定 071000 2 國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 河北保定 071000 3 河北新希望天香乳業(yè)有限公司 河北保定 071000 4 河北省益生功能性乳制品技術(shù)創(chuàng)新中心 河北保定 071000）

乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一類(lèi)發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[1]，近年來(lái)，乳酸菌發(fā)酵食品行業(yè)迅速崛起，在食品工業(yè)中占有越來(lái)越重要的地位[2]。然而，在乳酸菌在發(fā)酵食品的生產(chǎn)、貯藏、銷(xiāo)售、食用以及進(jìn)入人體胃腸道過(guò)程中，經(jīng)常受到多種環(huán)境脅迫，嚴(yán)重影響了乳酸菌的正常代謝、發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)和益生作用的發(fā)揮[3]。

發(fā)酵乳制品工業(yè)目前已成為國(guó)民經(jīng)濟(jì)中的“朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)”，但目前發(fā)酵乳制品普遍存在后酸化現(xiàn)象，已成為目前發(fā)酵乳制品工業(yè)亟待解決的技術(shù)瓶頸[4]。有研究表明，保加利亞乳桿菌是導(dǎo)致酸奶后酸化的主要菌種[4]。該菌發(fā)酵乳制品在貯藏過(guò)程中往往會(huì)同時(shí)遭受多種環(huán)境脅迫，不同環(huán)境脅迫之間交叉復(fù)雜，簡(jiǎn)單的單一環(huán)境脅迫的研究具有一定局限性[5]。目前研究發(fā)現(xiàn)：不同環(huán)境脅迫之間存在關(guān)聯(lián)，菌體細(xì)胞在處于多種環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)發(fā)生交互保護(hù)作用，使菌體細(xì)胞抵抗脅迫的能力增強(qiáng)[6-11]。而目前尚缺少有關(guān)保加利亞乳桿菌在不同環(huán)境脅迫下交互保護(hù)作用詳盡系統(tǒng)的研究報(bào)道。

目前有學(xué)者認(rèn)為： 交互保護(hù)作用可能由菌體細(xì)胞體內(nèi)一些環(huán)境脅迫應(yīng)激基因的重疊效應(yīng)引起[12-14]。此外，作為目前先進(jìn)的研究方法和技術(shù)手段，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于菌體細(xì)胞目的基因表達(dá)水平的定量分析研究之中[15]。

本文以保加利亞乳桿菌的模式菌株ATCC 11842 為試驗(yàn)菌株，探究不同環(huán)境脅迫條件（酸、鹽、膽鹽、氧、冷）對(duì)菌株存活率的影響，確定菌體細(xì)胞在不同環(huán)境脅迫（酸、鹽、膽鹽、氧、冷）下的亞致死條件與最低致死條件；在此基礎(chǔ)上，研究菌體細(xì)胞在多重環(huán)境脅迫下的交互保護(hù)作用；根據(jù)前期ATCC 11842 菌株在酸奶后酸化不同條件下轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）技術(shù)，分析響應(yīng)酸脅迫基因在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）下轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量變化。本研究為進(jìn)一步揭示保加利亞乳桿菌在多種環(huán)境脅迫下抗逆保護(hù)機(jī)制與定向選育抗逆性菌株，提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.buLgaricus ATCC 11842）：保加利亞乳桿菌模式菌株，本研究試驗(yàn)菌株，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心 （China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC），-80 ℃低溫冰箱保存于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院發(fā)酵工程研究室。

1.1.2 培養(yǎng)基和生理鹽水 MRS 培養(yǎng)基：液體用于菌種的活化，固體用于活菌計(jì)數(shù)。

生理鹽水：用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取9 g 氯化鈉，用蒸餾水稀釋至1 L，115 ℃滅菌20 min，用于活菌計(jì)數(shù)的稀釋液。

1.1.3 主要試劑 TaKaRa RNAiso Plus 總RNA提取試劑盒、Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser cDNA 第一鏈合成試劑盒，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 有限公司；2 ×SYBR Green qPCR Master Mix 熒光定量PCR 試劑盒，蘇州宇恒生物科技有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備 高壓蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器公司；DW-86L33 超低溫保存箱，廈門(mén)森態(tài)儀器儀表有限公司；Hettich UNIVERSAL 320高速冷凍離心機(jī)、Micro 120 型高速離心機(jī)，德國(guó)hettich 公司；羅氏LightCycler96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫條件下交互保護(hù)作用研究

1.2.1.1 不同環(huán)境脅迫條件對(duì)ATCC 11842 菌株存活率的影響 ATCC 11842 菌株經(jīng)MRS 液體培養(yǎng)基42 ℃活化后，以1%（體積分?jǐn)?shù)） 接入起始pH值6.8、100 mL 液體MRS 培養(yǎng)基的錐形瓶中，42 ℃靜置培養(yǎng)10 h 至對(duì)數(shù)中期，4 ℃、6 000 r/min、離心10 min 收集10 mL 菌體并重懸于等體積的液體MRS 培養(yǎng)基中。將重懸液分別按表1不同脅迫條件下處理后，4 ℃、6 000 r/min、離心10 min 收集1 mL 菌體，分別用生理鹽水洗滌2 次，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每次試驗(yàn)重復(fù)3 次。

表1 不同環(huán)境脅迫因素與水平Table 1 The factors and levels of different environmental stress

1.2.1.2 ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫條件下的交互保護(hù)作用研究 通過(guò)上述1.2.1.1 節(jié)不同環(huán)境脅迫條件對(duì)ATCC 11842 菌株存活率的影響試驗(yàn)，確定了ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫下的亞致死（菌株存活率50%左右）條件與最低致死（菌株存活率1%左右）條件。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫條件下的交互保護(hù)作用試驗(yàn)，即首先對(duì)ATCC 11842 菌株進(jìn)行不同環(huán)境脅迫下的亞致死條件的處理；然后再對(duì)ATCC 11842 菌株進(jìn)行對(duì)應(yīng)的不同環(huán)境脅迫下的最低致死條件的處理。通過(guò)檢測(cè)ATCC 11842菌株在不同環(huán)境脅迫下亞致死條件處理后和最低致死條件處理后的活菌數(shù)，計(jì)算菌株存活率，探明ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫條件下的交互保護(hù)作用。具體試驗(yàn)方法如下：

①ATCC 11842 菌株先在不同環(huán)境脅迫下亞致死條件的處理 ATCC 11842 菌株經(jīng)液體MRS培養(yǎng)基42 ℃活化后，以1%（體積分?jǐn)?shù)）接入起始pH 值6.8，100 mL 液體MRS 培養(yǎng)基錐形瓶中，42℃靜置培養(yǎng)10 h 至對(duì)數(shù)中期，4 ℃，6 000 r/min，離心10 min 收集10 mL 菌體，分別置于不同環(huán)境脅迫亞致死條件的10 mL MRS 培養(yǎng)基離心管中（酸脅迫pH 4.8，40 min；鹽脅迫6%，1 h；膽鹽脅迫0.1% 牛膽鹽，1 h；氧脅迫15 mmol/L H2O2，1 h；冷脅迫10 ℃，2 h）處理后，4 ℃，6 000 r/min，離心10 min 收集1 mL 菌體，菌體分別用生理鹽水洗滌2次，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每次試驗(yàn)重復(fù)3 次。

②ATCC 11842 菌株再對(duì)應(yīng)不同環(huán)境脅迫最低致死條件下的處理 經(jīng)過(guò)1.2.1.2 節(jié)①不同環(huán)境脅迫下亞致死條件處理后的ATCC 11842 菌體細(xì)胞，分別4 ℃，6 000 r/min，離心10 min 收集10 mL 菌體，分別用生理鹽水洗滌2 次，再分別置于酸脅迫最低致死條件（pH 3.7，40 min）、鹽脅迫最低致死條件（10% NaCl，1 h）、膽鹽脅迫最低致死條件（0.125% 牛膽鹽，1 h）、氧脅迫最低致死條件（15 mmol/L H2O2，1 h）的10 mL MRS 培養(yǎng)基錐形瓶中進(jìn)行處理后，分別4 ℃，6 000 r/min，離心10 min 收集1 mL 菌體，用生理鹽水洗滌2 次，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每次試驗(yàn)重復(fù)3 次。

③ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫條件下交互保護(hù)作用存活率的計(jì)算

式中：NA——經(jīng)過(guò)某環(huán)境脅迫亞致死條件處理和對(duì)應(yīng)某環(huán)境脅迫最低致死條件處理后的活菌數(shù)，CFU/mL；NB——對(duì)應(yīng)NA 經(jīng)過(guò)某環(huán)境脅迫亞致死條件處理后的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.2 ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫（亞致死

條件處理）下基因表達(dá)量分析

1.2.2.1 ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）后樣品制備 根據(jù)1.2.1.2 節(jié)①試驗(yàn)方法對(duì)ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫下進(jìn)行亞致死條件處理后，分別4 ℃、6 000 r/min、離心10 min 收集1 mL 菌體，經(jīng)液氮冷凍后，入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）后樣品總RNA 提取 將各凍藏樣品分別在預(yù)冷研缽中用液氮研磨至質(zhì)地細(xì)膩的粉末；按照美國(guó)Thermo Fisher Scientific TaKaRa RNAiso Plus 總RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取各凍藏樣品總RNA；利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各樣品RNA 質(zhì)量和完整性；采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各樣品OD260/OD280與OD260/OD230的比值，判斷各樣品總RNA 純度和濃度。

1.2.2.3 各樣品總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，去除各樣品總RNA 中的基因組DNA，反應(yīng)體系：5×g DNA Eraser Buffer 1 μL，g DNA Eraser 1 μL，總RNA 1 μL，RNase Free dH2O 7 μL；并合成各樣品cDNA 第一鏈，反應(yīng)體系：上述反應(yīng)液10 μL，Prime-Script RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 2 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20 ℃凍藏備用。

1.2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）內(nèi)參基因與目的基因的選擇及其引物設(shè)計(jì)與合成 本研究以L(fǎng)DB_RS01640 基因?yàn)閮?nèi)參基因，以11 個(gè)響應(yīng)酸脅迫的基因?yàn)槟康幕?，根?jù)NCBI 上GenBank中公布的保加利亞乳桿菌ATCC 11842 的基因組中內(nèi)參基因和目的基因的堿基序列，利用Primer Premier 5.0 和DNAMAN 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物，由金唯智生物科技有限公司合成引物序列。內(nèi)參基因和目的基因引物見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）內(nèi)參基因與目的基因的引物序列Table 2 Primers sequence of reference gene and target gene for qRT-PCR

1.2.2.5 ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）后目的基因的qRT-PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)?zāi)康幕虻膓RT-PCR 擴(kuò)增程序，根據(jù)蘇州宇恒生物科技有限公司的2×SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行，采用羅氏LightCycler96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀完成。qRT-PCR 20 μL 反應(yīng)體系：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA template 2 μL，ddH2O 6 μL。qRT-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min 激活Taq DNA polymerase 活性；95 ℃變性5 s，51 ℃退火5 s，72 ℃延伸25 s，共45 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品反應(yīng)重復(fù)3 次。根據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

作圖軟件為GraphPad Prism 8.0；試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0 進(jìn)行方差分析并用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫條件下交互保護(hù)作用研究

2.1.1 不同環(huán)境脅迫條件對(duì)ATCC 11842 菌株存活率的影響 為確定ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫下的亞致死（菌株存活率50%左右）條件與最低致死（菌株存活率1%左右）條件，以便后續(xù)進(jìn)行ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫條件下的交互保護(hù)作用研究，根據(jù)1.2.1.1 節(jié)試驗(yàn)方法，進(jìn)行不同環(huán)境脅迫條件對(duì)ATCC 11842 菌株存活率影響試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1a、1b、1c、1d、1e。

由圖1可見(jiàn)：ATCC 11842 菌株在圖1a 酸脅迫不同水平的處理中，其亞致死（菌株存活率50%左右）條件和最低致死條件（菌株存活率1%左右）分別為pH 4.8，40 min 和pH 3.7，40 min；在圖1b 鹽脅迫不同水平的處理中，其亞致死條件和最低致死條件分別為NaCl 6%，1 h 和NaCl 10%，1 h；在圖1c 膽鹽脅迫不同水平的處理中，其亞致死條件和最低致死條件分別為牛膽鹽0.075%，1 h和牛膽鹽0.125%，1 h；在圖1d 氧脅迫不同水平的處理中，其亞致死條件和最低致死條件分別為H2O215 mmol/L，1 h 和H2O225 mmol/L，1 h；在圖1e 冷脅迫不同水平的處理中，其亞致死條件為10℃，2 h。

圖1 ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫條件下的存活率結(jié)果Fig.1 The survival rate of L.bulgaricus ATCC 11842 under different environmental stress

2.1.2 ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫條件下的交互保護(hù)作用研究 在上述2.1.1 節(jié)試驗(yàn)確定了ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫下的亞致死（菌株存活率50%左右）條件與最低致死（菌株存活率1%左右）條件的基礎(chǔ)上，根據(jù)1.2.1.2 節(jié)①②③試驗(yàn)方法，進(jìn)行ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫條件下的交互保護(hù)作用研究，結(jié)果見(jiàn)圖2a、2b、2c、2d。

圖2 ATCC 11842 菌株經(jīng)不同環(huán)境脅迫亞致死條件處理再對(duì)應(yīng)不同環(huán)境脅迫最低致死條件處理后存活率變化結(jié)果Fig.2 The survival rate of L.bulgaricus ATCC 11842 after sublethal treatment corresponding to lowest lethal conditions of different environmental stresses

由圖2看出：ATCC 11842 菌株在圖2a 酸致死交互保護(hù)試驗(yàn)中，酸脅迫、鹽脅迫、H2O2脅迫和冷脅迫亞致死處理，均能激活細(xì)胞應(yīng)對(duì)酸致死條件的防御作用而提高菌體存活率，其中，酸脅迫和氧脅迫亞致死處理細(xì)胞應(yīng)對(duì)酸致死條件的存活率結(jié)果差異極顯著（P＜0.01），菌體存活率分別提高了7.9 倍和5.2 倍；在圖2b 鹽致死交互保護(hù)試驗(yàn)中，酸脅迫和氧脅迫亞致死處理能顯著提高菌株在鹽致死條件下的存活率（P＜0.01），分別提高了5.9 倍和10.4 倍；在圖2c 膽鹽致死交互保護(hù)試驗(yàn)中，酸脅迫和氧脅迫亞致死處理能顯著提高菌株在鹽致死條件下的存活率，分別提高了1.28 倍（P＜0.05）和2.57 倍（P＜0.01）；在圖2d 氧致死交互保護(hù)試驗(yàn)中，酸脅迫和氧脅迫亞致死處理能顯著提高菌株在鹽致死條件下的存活率，分別提高了1.5 倍（P＜0.05）和2.22 倍（P＜0.01）。

上述結(jié)果表明：ATCC 11842 菌株經(jīng)酸脅迫和氧脅迫亞致死條件預(yù)處理均能提高在不同環(huán)境致死條件下的交互保護(hù)作用，即增強(qiáng)了在不同壓力致死條件下的脅迫抗性。我們推測(cè)：酸脅迫和氧脅迫亞致死條件預(yù)處理，激活了ATCC 11842 菌株體內(nèi)響應(yīng)脅迫的抗性基因，使響應(yīng)脅迫應(yīng)激抗性基因發(fā)生表達(dá)量變化，產(chǎn)生響應(yīng)脅迫應(yīng)激抗性基因在不同環(huán)境致死條件下的重疊效應(yīng)和交互保護(hù)作用。因此，有必要進(jìn)一步分析ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）下相關(guān)脅迫應(yīng)激抗性基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量變化。

2.2 ATCC 11842 菌株在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）下基因表達(dá)量分析

根據(jù)2.1.2 節(jié)試驗(yàn)結(jié)果以及前期ATCC11842菌株在酸脅迫和酸冷脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果，本試驗(yàn)從ATCC 11842 菌株響應(yīng)酸脅迫的基因中選取與糖代謝、氨基酸代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、分子伴侶和應(yīng)激相關(guān)基因，利用qRT-PCR 技術(shù)，分析這些基因在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）下轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量變化。

2.2.1 不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）對(duì)糖代謝相關(guān)基因 LDB_RS00810、LDB_RS04920、LDB_RS00230 表達(dá)量的影響 根據(jù)1.2.2.1～1.2.2.5 節(jié)試驗(yàn)方法，進(jìn)行ATCC 11842 菌株與糖代謝相關(guān)基因LDB_RS00810、LDB_RS04920、LDB_RS00230在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理） 下表達(dá)量分析，結(jié)果見(jiàn)圖3a、3b、3c。

圖3 在不同環(huán)境脅迫條件下ATCC 11842 中基因LDB_RS00810、LDB_RS04920 和LDB_RS00230 的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of the LDB-RS00810，LDB_RS04920 and LDB_RS00230 gene in L.bulgaricus ATCC 11842 under different stress treatment

由圖3可知：在圖3a 中，ATCC 11842 面對(duì)不同的環(huán)境脅迫時(shí)，基因LDB-RS00810 的轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)上調(diào)方式適應(yīng)酸脅迫和氧脅迫（P＜0.05）；而鹽脅迫、膽鹽脅迫和冷脅迫對(duì)基因LDB-RS00810的表達(dá)量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。在圖3b 中，基因LDB_RS04920 受酸脅迫、膽鹽脅迫和氧脅迫的影響而表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05）；而鹽脅迫和冷脅迫對(duì)基因LDB_RS04920 表達(dá)量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。在圖3c 中，基因LDB_RS00230 的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)通過(guò)上調(diào)方式適應(yīng)酸脅迫、氧脅迫和冷脅迫（P ＜0.05）；而鹽脅迫和膽鹽脅迫對(duì)基因LDB_RS00230 的表達(dá)量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。結(jié)果表明： 基因LDB-RS00810 響應(yīng)酸脅迫和氧脅迫，基因LDB_RS04920 響應(yīng)酸脅迫、膽鹽脅迫和氧脅迫，基因LDB_RS00230 響應(yīng)酸脅迫、氧脅迫和冷脅迫。

2.2.2 不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）對(duì)氨基酸代謝相關(guān)基因LDB_RS02110、LDB_RS06340 表達(dá)量的影響 根據(jù)1.2.2.1～1.2.2.5 節(jié)試驗(yàn)方法，進(jìn)行ATCC 11842 菌株與氨基酸代謝相關(guān)基因LDB_RS02110、LDB_RS06340 在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理） 下表達(dá)量分析，結(jié)果見(jiàn)圖4a、4b。

圖4 在不同環(huán)境脅迫條件下ATCC 11842 中基因LDB_RS02110、LDB_RS06340 的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of the LDB_RS02110，LDB_RS06340 gene in L.bulgaricus ATCC 11842 under different stress treatment

圖4顯示：在圖4a 中，ATCC 11842 面對(duì)不同的環(huán)境脅迫時(shí)，基因LDB_RS02110 在酸脅迫和膽鹽脅迫的調(diào)控下，其表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）；而鹽脅迫、氧脅迫和冷脅迫處理對(duì)基因LDB_RS02110 的表達(dá)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。在圖4b 中，基因LDB_RS06340 受酸脅迫、氧脅迫和冷脅迫處理的影響，其表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05）；但鹽脅迫和膽鹽脅迫處理對(duì)基因LDB_RS06340 表達(dá)量無(wú)顯著影響 （P＞0.05）。由此表明： 基因LDB_RS02110 響應(yīng)酸脅迫和膽鹽脅迫，基因LDB_RS06340 響應(yīng)酸脅迫、氧脅迫和冷脅迫。

2.2.3 不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因LDB_RS09405、LDB_RS05285 表達(dá)量的影響 根據(jù)1.2.2.1～1.2.2.5 節(jié)試驗(yàn)方法，進(jìn)行ATCC 11842 菌株與轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因LDB_RS09405、LDB_RS05285 在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）下表達(dá)量分析，結(jié)果見(jiàn)圖5a、5b。

由圖5可見(jiàn)：在圖5a 中，ATCC 11842 面對(duì)不同的環(huán)境脅迫時(shí)，基因LDB_RS09405 受酸脅迫的誘導(dǎo)，表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05）；而鹽脅迫、膽鹽脅迫、氧脅迫和冷脅迫對(duì)基因LDB_RS09405 的表達(dá)量無(wú)顯著影響 （P＞0.05）。在圖5b 中，基因LDB_RS05285 受酸脅迫和氧脅迫的誘導(dǎo)，表達(dá)量顯著上升（P＜0.05）；而鹽脅迫、膽鹽脅迫、冷脅迫對(duì)基因LDB_RS05285 的表達(dá)量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。結(jié)果表明：基因LDB_RS09405 只響應(yīng)酸脅迫，基因LDB_RS05285 響應(yīng)酸脅迫和氧脅迫。

圖5 在不同環(huán)境脅迫條件下L.bulgaricus ATCC 11842 中基因LDB_RS09405、LDB_RS05285 的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of the LDB_RS09405，LDB_RS05285 gene in L.bulgaricus ATCC 11842 under different stress treatment

2.2.4 不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）對(duì)分子伴侶相關(guān)基因LDB_RS05615、LDB_RS06995 表達(dá)量的影響 根據(jù)1.2.2.1～1.2.2.5 節(jié)試驗(yàn)方法，進(jìn)行ATCC 11842 菌株與分子伴侶相關(guān)基因LDB_RS05615、LDB_RS06995 在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）下表達(dá)量分析，結(jié)果見(jiàn)圖6a、6b。

圖6 在不同環(huán)境脅迫條件下L.bulgaricus ATCC 11842 中基因LDB_RS05615、LDB_RS06995 的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relative expression levels of the LDB_RS05615，LDB_RS06995 gene in L.bulgaricus ATCC 11842 under different stress treatment

由圖6看出：在圖6a 中，ATCC 11842 面對(duì)不同的環(huán)境脅迫時(shí)，基因LDB_RS05615 受酸脅迫、鹽脅迫和冷脅迫處理的影響，其表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），并且在氧脅迫下其表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；但膽鹽脅迫對(duì)基因LDB_RS05615 的表達(dá)量無(wú)顯著影響 （P ＞0.05）。在圖6b 中，基因LDB_RS06995 表達(dá)量在酸脅迫、氧脅迫和冷脅迫下顯著上調(diào)（P＜0.05）；在鹽脅迫和膽鹽脅迫下表達(dá)量顯著下調(diào) （P ＜0.05）。由此表明： 基因LDB_RS05615 響應(yīng)酸脅迫、鹽脅迫、氧脅迫和冷脅迫，基因LDB_RS06995 響應(yīng)酸脅迫、鹽脅迫、膽鹽脅迫、氧脅迫和冷脅迫。

2.2.5 不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）對(duì)應(yīng)激相關(guān)基因LDB-RS01180、LDB_RS03130 表達(dá)量的影響 根據(jù)1.2.2.1～1.2.2.5 節(jié)試驗(yàn)方法，進(jìn)行ATCC 11842 菌株與應(yīng)激相關(guān)基因LDB-RS01180、LDB_RS03130 在不同環(huán)境脅迫 （亞致死條件處理）下表達(dá)量分析，結(jié)果見(jiàn)圖7a、7b。

由圖7可知：在圖7a 中，ATCC 11842 面對(duì)不同的環(huán)境脅迫時(shí)，基因LDB-RS01180 受酸脅迫、氧脅迫和冷脅迫時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào) （P＜0.05），受鹽脅迫時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），而膽鹽脅迫對(duì)基因LDB-RS01180 表達(dá)量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。在圖7b 中，基因LDB_RS03130 在酸脅迫、鹽脅迫、膽鹽脅迫、氧脅迫和冷脅迫處理后表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果表明：基因LDB-RS01180 響應(yīng)酸脅迫、鹽脅迫、氧脅迫和冷脅迫，基因LDB_RS03130 響應(yīng)酸脅迫、鹽脅迫、膽鹽脅迫、氧脅迫和冷脅迫。

圖7 在不同環(huán)境脅迫條件下L.bulgaricus ATCC 11842 中基因LDB_RS01180、LDB_RS03130 的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of the LDB_RS01180，LDB_RS03130 gene in L.bulgaricus ATCC 11842 under different stress treatment

上述2.2 節(jié) （2.2.1～2.2.5 節(jié)） 結(jié)果表明：在ATCC 11842 菌株體內(nèi)響應(yīng)酸脅迫的11 個(gè)基因中，發(fā)現(xiàn)10 個(gè)基因 （除與轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因LDB_RS09405 之外） 也響應(yīng)其它不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理），并探明了該10 個(gè)響應(yīng)酸脅迫的基因 （LDB_RS02110、LDB -RS00810、LDB_RS04920、LDB_RS05285、LDB_RS00230、LDB_RS06340、LDB_RS05615、LDB-RS01180、LDB_RS06995、LDB_RS03130）在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理） 下表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)與下調(diào)的具體轉(zhuǎn)錄水平。

3 討論

發(fā)酵乳制品工業(yè)已成為促進(jìn)國(guó)民健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的“朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)”，保加利亞乳桿菌既是發(fā)酵乳制品的常用菌種，又是引起發(fā)酵乳制品后酸化的主要菌種[4]。目前一般運(yùn)用誘變和原生質(zhì)體融合育種、改變工藝條件、添加抑菌劑等技術(shù)手段來(lái)控制發(fā)酵乳制品的后酸化[16]，但保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳制品在貯藏期間常會(huì)遭受多種環(huán)境脅迫，不同環(huán)境脅迫之間交叉復(fù)雜，在不了解該菌在多種環(huán)境脅迫下交叉抗逆保護(hù)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的情況下，很難從根本上解決發(fā)酵乳制品的后酸化問(wèn)題。因此，研究保加利亞乳桿菌在不同環(huán)境脅迫下交互保護(hù)作用及其與相關(guān)基因表達(dá)的應(yīng)答關(guān)系，勢(shì)在必行。

迄今已有研究表明： 保加利亞乳桿菌ATCC 11842 在2% NaCl 中預(yù)處理2 h，冷凍干燥存活率顯著提升[17]；保加利亞乳桿菌CFL1 經(jīng)酸脅迫預(yù)處理后，抵抗冷脅迫的能力增強(qiáng)[18]。這些研究雖然印證了保加利亞乳桿菌在某些環(huán)境脅迫下的交互保護(hù)作用，但目前尚缺少保加利亞乳桿菌在不同環(huán)境脅迫下交互保護(hù)作用的系統(tǒng)研究資料。本研究表明：ATCC 11842 菌株經(jīng)酸脅迫和氧脅迫亞致死條件（pH 4.8，40 min；15 mmol/L H2O2，1 h）預(yù)處理后，均可顯著提高在不同環(huán)境脅迫（酸、鹽、膽鹽、氧）最低致死條件下（pH 3.7，40 min；10% NaCl，1 h；0.125%牛膽鹽，1 h；25 mmol/L H2O2，1 h）的存活率，即試驗(yàn)菌株經(jīng)酸脅迫和氧脅迫亞致死條件預(yù)處理均能顯著提高在不同環(huán)境最低致死條件下的交互保護(hù)作用，增強(qiáng)了在不同壓力致死條件下的脅迫抗性。本研究結(jié)果豐富了保加利亞乳桿菌在不同環(huán)境脅迫下交互保護(hù)作用的系統(tǒng)研究資料。

目前研究發(fā)現(xiàn)：乳酸菌在各種環(huán)境脅迫下，具有自我調(diào)控能力，可通過(guò)合成應(yīng)激蛋白、參與代謝的某些蛋白以及脅迫誘導(dǎo)的特定應(yīng)激蛋白等各種生理反應(yīng)來(lái)適應(yīng)不利環(huán)境[19]。例如：德氏乳桿菌保加利亞亞種在酸脅迫過(guò)程中，分子伴侶基因DanK，GroES 和GroEL 被誘導(dǎo)[20]；植物乳桿菌CAUH2 在H2O2脅迫過(guò)程中，銅穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄因子CopR 被誘導(dǎo)[21]，熱激蛋白在鹽脅迫、酸脅迫及冷脅迫下也被誘導(dǎo)表達(dá)[22-23]。由此說(shuō)明：在不同環(huán)境脅迫下，乳酸菌的應(yīng)激抗性機(jī)制存在一定程度的重疊效應(yīng)[24]。本研究根據(jù)前期ATCC 11842 菌株在酸脅迫和酸冷脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序結(jié)果，從響應(yīng)酸脅迫的基因中選取與糖代謝相關(guān)的基因（LDB_RS00810、LDB_RS04920、LDB_RS00230）、與氨基酸代謝相關(guān)的基因（LDB_RS02110、LDB_RS06340）、與轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)的基因（LDB_RS05285、LDB_RS09405）、分子伴侶基因（LDB_RS05615、LDB_RS06995） 和應(yīng)激相關(guān)基因（LDB_RS01180、LDB_RS03130） 等11 個(gè)基因，采用RT-qPCR 技術(shù)，分析了這11 個(gè)響應(yīng)酸脅迫基因在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）下轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量變化，探明了這11 個(gè)響應(yīng)酸脅迫基因在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）下表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)與下調(diào)的具體轉(zhuǎn)錄水平。本研究結(jié)果表明：在ATCC 11842 菌株體內(nèi)響應(yīng)酸脅迫的11 個(gè)基因中，發(fā)現(xiàn)10 個(gè)基因 （除與轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因LDB_RS09405 之外）也響應(yīng)了其它不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理），本研究結(jié)果不僅與前人提出的觀點(diǎn)相符，而且擴(kuò)充了保加利亞乳桿菌響應(yīng)酸脅迫基因在不同環(huán)境脅迫下交互保護(hù)作用中應(yīng)答反應(yīng)的研究資料。根據(jù)現(xiàn)有的理論推測(cè)：這些響應(yīng)酸脅迫的基因可能使ATCC 11842 菌株在其它不同環(huán)境脅迫下的交互保護(hù)作用中產(chǎn)生重疊效應(yīng)，從而使菌體細(xì)胞在亞致死條件下處理后應(yīng)對(duì)其它環(huán)境脅迫的抗性增強(qiáng)；此外，ATCC 11842 菌株還可能通過(guò)調(diào)控脅迫基因的轉(zhuǎn)錄水平，起到修復(fù)環(huán)境脅迫導(dǎo)致的蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊、修復(fù)維持DNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)、調(diào)控糖代謝和氨基酸代謝和修復(fù)細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[25-28]等作用，從而進(jìn)一步調(diào)控菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，緩解脅迫造成的紊亂。

總之，本研究以保加利亞乳桿菌的模式菌株ATCC 11842 為試驗(yàn)菌株，探究了不同環(huán)境脅迫條件（酸、鹽、膽鹽、氧、冷）對(duì)菌株存活率的影響，確定了菌體細(xì)胞在不同環(huán)境脅迫（酸、鹽、膽鹽、氧、冷） 下的亞致死條件與最低致死條件；在此基礎(chǔ)上，比較了不同環(huán)境脅迫（酸、鹽、膽鹽、氧、冷）亞致死條件處理后的菌體細(xì)胞在不同環(huán)境脅迫（酸、鹽、膽鹽、氧）最低致死條件下的存活率變化，發(fā)現(xiàn)菌株經(jīng)酸脅迫和氧脅迫亞致死條件 （pH 4.8，40 min；15 mmol/L H2O2，1 h）預(yù)處理后，均可顯著提高在不同環(huán)境脅迫（酸、鹽、膽鹽、氧）最低致死條件下 （pH 3.7，40 min；10% NaCl，1 h；0.125% 牛膽鹽，1 h；25 mmol/L H2O2，1 h）的存活率，即試驗(yàn)菌株經(jīng)酸脅迫和氧脅迫亞致死條件預(yù)處理均能顯著提高在不同環(huán)境最低致死條件下的交互保護(hù)作用；分析了菌株體內(nèi)11 個(gè)響應(yīng)酸脅迫基因在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）下轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量變化，探明了該11 個(gè)響應(yīng)酸脅迫基因在不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）下表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)與下調(diào)的具體轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)了10 個(gè)基因（與轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因LDB_RS09405 除外的10 個(gè)基因：LDB_RS02110、LDB-RS00810、LDB_RS04920、LDB_RS05285、LDB_RS00230、LDB_RS06340、LDB_RS05615、LDB -RS01180、LDB_RS06995、LDB_RS03130）也響應(yīng)其它不同環(huán)境脅迫（亞致死條件處理）。本研究為進(jìn)一步揭示保加利亞乳桿菌在多種環(huán)境脅迫下抗逆保護(hù)機(jī)制與定向選育抗逆性菌株，提供了科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。