楊 帆，舒林飛，袁志舟，李 濤，龍永其，諶 磊△

(1.湖南省株洲市中心醫(yī)院泌尿外一科 412007；2.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院器官移植科，?？?570216)

膿毒癥是臨床常見的危重癥，其救治難度大、病死率高。膿毒癥的主要病理生理特征是全身炎癥反應(yīng)激活，涉及炎癥細(xì)胞因子的大量釋放、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的異常激活等生物學(xué)環(huán)節(jié)，嚴(yán)重者可進(jìn)展為多器官功能障礙綜合征[1-2]。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在膿毒癥病情發(fā)展、多臟器功能損傷中起到重要作用，造成內(nèi)皮損傷的因素復(fù)雜，其中從細(xì)胞核小體釋放進(jìn)入細(xì)胞外的組蛋白具有細(xì)胞毒性。多項(xiàng)臨床研究[3-4]和基礎(chǔ)研究[5]證實(shí)，膿毒癥患兒及動(dòng)物模型的血清細(xì)胞外組蛋白水平升高且與預(yù)后相關(guān)。采用大劑量組蛋白短時(shí)間沖擊處理的方式通過激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及p38通路可建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型[6]。

雌激素是目前已知具有心腦血管保護(hù)作用的激素，有臨床研究顯示血清雌二醇(estradiol,E2)水平不足是膿毒癥患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素之一[7]，另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)充E2可減輕膿毒癥動(dòng)物的臟器損傷[8]。但E2在膿毒癥發(fā)病過程中的內(nèi)皮保護(hù)作用及機(jī)制尚不十分清楚。有研究報(bào)道，E2在神經(jīng)元損傷及心肌肥大模型中的細(xì)胞保護(hù)作用與抑制p38通路及NF-κB通路有關(guān)[9-10]?；诖?，本研究在大劑量組蛋白短時(shí)間沖擊誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中探索了E2的保護(hù)作用，以及NF-κB、p38通路相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)購自美國ATCC公司。

1.1.2試劑

小牛胸腺組蛋白(calf thymus histone，CTH)、四唑氮化合物(MTS)細(xì)胞增殖試劑盒購自武漢艾美捷科技公司，E2、p38激動(dòng)劑P79350(儲(chǔ)存液濃度0.5 mol/L)購自美國Sigma公司，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的ELISA檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，裂解液及TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天公司，活化型caspase-3(cleaved caspase-3)、p38、磷酸化p38(p-p38)、NF-κB、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)特異性一抗購自美國CST公司。

1.1.3儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，多功能酶標(biāo)儀購自美國Bio-tek公司，熒光顯微鏡購自日本Nikon公司，凝膠成像儀購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1HUVECs培養(yǎng)及分組

HUVECs在含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，密度生長(zhǎng)至90%時(shí)用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。傳代的HUVECs接種在不同規(guī)格的培養(yǎng)板，分為對(duì)照組、CTH組、E2組、二甲基亞砜(DMSO)組、DMSO+CTH組、DMSO+E2組、P79350+E2組，處理方法如下：對(duì)照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理60 min；CTH組用含有200 μg/mL CTH的培養(yǎng)基處理60 min；E2組先給予含有0.1 mmol/L E2的培養(yǎng)基預(yù)處理60 min，而后用含有200 μg/mL CTH的培養(yǎng)基處理60 min；DMSO組用含有0.1% DMSO的培養(yǎng)基連續(xù)處理2 h；DMSO+CTH組用含有0.1% DMSO的培養(yǎng)基預(yù)處理60 min，而后用含有200 μg/mL CTH的培養(yǎng)基處理60 min；DMSO+E2組用含有0.1% DMSO和0.1 mmol/L E2的培養(yǎng)基預(yù)處理60 min，而后用含有200 μg/mL CTH的培養(yǎng)基處理60 min；P79350+E2組用含有50 μmol/L P79350和0.1 mmol/L E2的培養(yǎng)基預(yù)處理60 min，而后用含有200 μg/mL CTH的培養(yǎng)基處理60 min。所有分組均重復(fù)5次。

1.2.2細(xì)胞活力的檢測(cè)

HUVECs接種在96孔培養(yǎng)板中，CTH處理后15、30、45、60 min時(shí)，采用MTS法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，在每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μL檢測(cè)液并繼續(xù)培養(yǎng)4 h，而后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度(A490)值。

1.2.3培養(yǎng)基中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)

HUVECs接種在12孔培養(yǎng)板中，CTH處理后60 min分別收集培養(yǎng)基和細(xì)胞，采用南京建成生物工程研究所的ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、SOD水平，采用BCA法檢測(cè)細(xì)胞中的蛋白水平，計(jì)算每毫克細(xì)胞蛋白中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、SOD水平。

1.2.4細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

HUVECs接種在24孔培養(yǎng)板中，CTH處理后60 min收集細(xì)胞并用4%多聚甲醛固定，采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，按照試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL染色和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，在顯微鏡下觀察TUNEL陽性細(xì)胞及DAPI陽性細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

HUVECs接種在12孔培養(yǎng)板中，CTH處理后60 min收集細(xì)胞并加入上海碧云天公司的裂解液提取細(xì)胞蛋白，與上樣緩沖液混合、煮沸變性后進(jìn)行Western blot檢測(cè)，將樣品加入聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后4 ℃孵育cleaved caspase-3、p38、p-p38、NF-κB、p-NF-κB及β-actin特異性一抗過夜，次日孵育辣根過氧化物酶二抗1 h并在凝膠成像儀中采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯影得到蛋白條帶，按照蛋白條帶的灰度值計(jì)算cleaved caspase-3/β-actin、p-p38/p38、p-NF-κB/NF-κB水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 E2對(duì)CTH誘導(dǎo)HUVECs活力降低的影響

CTH處理后15、30、45、60 min，CTH組的A490值均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，E2組的A490值均明顯高于CTH組(P<0.05)，見表1。

表1 3組HUVECs活力A490值比較

2.2 E2對(duì)CTH誘導(dǎo)HUVECs中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)激活的影響

CTH處理后60 min，CTH組細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平均明顯高于對(duì)照組，SOD水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；E2組細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平均明顯低于CTH組，SOD水平明顯高于CTH組(P<0.05)，見表2。

表2 3組HUVECs培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA及SOD水平比較

2.3 E2對(duì)CTH誘導(dǎo)HUVECs中細(xì)胞凋亡激活的影響

CTH處理后60 min，CTH組的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；E2組的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3表達(dá)水平均明顯低于CTH組(P<0.05)，見圖1。

A：細(xì)胞凋亡的TUNEL染色；B：細(xì)胞凋亡率柱狀圖；C：cleaved caspase-3蛋白條帶；D：cleaved caspase-3表達(dá)水平柱狀圖。a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與CTH組比較。

2.4 E2對(duì)CTH誘導(dǎo)HUVECs中p38/NF-κB通路激活的影響

CTH處理后60 min，CTH組細(xì)胞中p-p38、p-NF-κB表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；E2組細(xì)胞中p-p38、p-NF-κB表達(dá)水平均明顯低于CTH組(P<0.05)，見圖2。

A：p38/NF-κB通路相關(guān)蛋白的蛋白條帶；B：p-NF-κB表達(dá)水平柱狀圖；C：p-p38表達(dá)水平柱狀圖；a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與CTH組比較。

2.5 p38激動(dòng)劑對(duì)E2改善CTH誘導(dǎo)HUVECs中p38/NF-κB通路激活的影響

CTH處理后60 min，DMSO+CTH組細(xì)胞中p-p38、p-NF-κB表達(dá)水平均高于DMSO組(P<0.05)；DMSO+E2組細(xì)胞中p-p38、p-NF-κB表達(dá)水平均明顯低于DMSO+CTH組(P<0.05)；P79350+E2組細(xì)胞中p-p38、p-NF-κB表達(dá)水平均明顯高于DMSO+E2組(P<0.05)，見圖3。

A：p38/NF-κB通路相關(guān)蛋白的蛋白條帶；B：p-p38表達(dá)水平柱狀圖；C：p-NF-κB表達(dá)水平柱狀圖；a：P<0.05，與DMSO組比較；b：P<0.05，與DMSO+CTH組比較；c：P<0.05，與DMSO+E2組比較。

2.6 p38激動(dòng)劑對(duì)E2改善CTH誘導(dǎo)HUVECs活力降低的影響

CTH處理后15、30、45、60 min，DMSO+CTH組的A490值均明顯低于DMSO組(P<0.05)，DMSO+E2組的A490值均明顯高于DMSO+CTH組(P<0.05)，P79350+E2組的A490值均明顯低于DMSO+E2組(P<0.05)，見表3。

表3 4組HUVECs活力A490值比較

2.7 p38激動(dòng)劑對(duì)E2改善CTH誘導(dǎo)HUVECs中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)激活的影響

CTH處理后60 min，DMSO+CTH組細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平均明顯高于DMSO組，SOD水平明顯低于DMSO組(P<0.05)；DMSO+E2組細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平均明顯低于DMSO+CTH組，SOD水平明顯高于DMSO+CTH組(P<0.05)；P79350+E2組細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平均明顯高于DMSO+E2組，SOD水平明顯低于DMSO+E2組(P<0.05)，見表4。

表4 4組HUVECs培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA及SOD水平比較

2.8 p38激動(dòng)劑對(duì)E2改善CTH誘導(dǎo)HUVECs中細(xì)胞凋亡激活的影響

CTH處理后60 min，DMSO+CTH組的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3表達(dá)水平均明顯高于DMSO組(P<0.05)；DMSO+E2組的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3表達(dá)水平均明顯低于DMSO+CTH組(P<0.05)；P79350+E2組的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3表達(dá)水平均明顯高于DMSO+E2組(P<0.05)，見圖4。

A：細(xì)胞凋亡的TUNEL染色；B：細(xì)胞凋亡率柱狀圖；C：ceaved caspase-3的蛋白條帶；D：cleaved caspase-3表達(dá)水平柱狀圖；a：P<0.05，與DMSO組比較；b：P<0.05，與DMSO+CTH組比較；c：P<0.05，與DMSO+E2組比較。

3 討 論

組蛋白是一種在細(xì)胞核內(nèi)與DNA互相結(jié)合形成核小體的核蛋白，在不同病理因素刺激下組蛋白異常釋放進(jìn)入細(xì)胞外并產(chǎn)生細(xì)胞毒性。近些年，多項(xiàng)膿毒癥相關(guān)的研究證實(shí)細(xì)胞外組蛋白的產(chǎn)生與疾病病情及預(yù)后相關(guān)[3-4]，但相關(guān)的分子機(jī)制及防治手段尚不清楚。在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與病情加重及全身多個(gè)臟器功能損傷有關(guān)，細(xì)胞外組蛋白的細(xì)胞毒性作用可能是膿毒癥病程中引起內(nèi)皮損傷的關(guān)鍵因素[11]。有多項(xiàng)細(xì)胞研究通過大劑量組蛋白短時(shí)間沖擊處理，即200 μg/mL CTH處理1 h的方式誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷[6，12]。

本研究采用0.1 mmol/L E2預(yù)處理HUVECs，200 μg/mL CTH處理15、30、45、60 min后細(xì)胞的A490值明顯降低，與既往研究中CTH誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合[6，12]。膿毒癥發(fā)病過程中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的過度激活是與多器官功能障礙、內(nèi)皮細(xì)胞損傷直接相關(guān)的因素[13-14]。本研究在CTH誘導(dǎo)HUVECs損傷模型中檢測(cè)到培養(yǎng)基中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA水平均升高，抗氧化酶SOD水平降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中凋亡基因cleaved caspase-3表達(dá)水平升高，與膿毒癥發(fā)病過程中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡激活的特點(diǎn)吻合[13-14]。以此為基礎(chǔ)，本研究將繼續(xù)在CTH誘導(dǎo)HUVECs損傷模型中以炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn)研究相關(guān)的分子機(jī)制及防治手段。

E2是具有心血管保護(hù)作用的性激素，在多種病理因素引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的模型中發(fā)揮保護(hù)作用，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞在病理狀態(tài)下的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡均具有抑制作用[15-16]。本研究在CTH誘導(dǎo)HUVECs損傷前進(jìn)行E2預(yù)處理，E2預(yù)處理后給予CTH 15、30、45、60 min時(shí)細(xì)胞的A490值均明顯增加，表明E2對(duì)CTH誘導(dǎo)HUVECs損傷具有改善作用。進(jìn)一步分析炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡可知：E2預(yù)處理后CTH誘導(dǎo)HUVECs損傷模型中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA的生成，凋亡率及cleaved caspase-3表達(dá)水平均降低，SOD水平升高，表明E2在改善CTH誘導(dǎo)HUVECs損傷時(shí)發(fā)揮了抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用，與既往研究中有關(guān)E2生物學(xué)特性的報(bào)道一致[15-16]，也與本研究已經(jīng)觀察到E2減輕CTH誘導(dǎo)HUVECs損傷的作用吻合。

根據(jù)國內(nèi)曹清等[6]研究中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CTH誘導(dǎo)HUVECs損傷與激活NF-κB和p38通路有關(guān)。p38屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族，發(fā)生磷酸化后生成有活性的p-p38，后者能夠引起下游NF-κB發(fā)生磷酸化并參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的調(diào)控[17]。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，E2的心腦血管保護(hù)作用與抑制p38及NF-κB的磷酸化有關(guān)[9-10,18]，本研究在CTH誘導(dǎo)HUVECs損傷的模型中檢測(cè)到p-p38及p-NF-κB的表達(dá)水平增加，符合NF-κB和p38激活的特點(diǎn)；E2預(yù)處理后，p-p38及p-NF-κB的表達(dá)水平降低，表明E2在CTH誘導(dǎo)HUVECs損傷模型中抑制NF-κB和p38的激活。進(jìn)一步通過使用p38激動(dòng)劑P79350與E2聯(lián)合預(yù)處理的方式驗(yàn)證p38/NF-κB通路在E2減輕CTH誘導(dǎo)HUVECs損傷中的作用，加用p38激動(dòng)劑后，E2預(yù)處理減輕細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的作用被削弱，表明E2改善CTH誘導(dǎo)HUVECs損傷的作用部分與抑制p38/NF-κB通路有關(guān)。

綜上所述，本研究通過一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)E2具有改善CTH誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用，這一改善作用與抑制p38/NF-κB通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡有關(guān)。以上結(jié)果為今后深入認(rèn)識(shí)細(xì)胞外組蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制及防治手段提供了依據(jù)，E2可能作為細(xì)胞外組蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的防治藥物，p38/NF-κB通路則有望成為研究細(xì)胞外組蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷分子機(jī)制的靶點(diǎn)。