楊禮，楊蛟，陳磊，杜勇，張勝國(guó)，牟慧蓉，冉隆權(quán)，張依浴

（1.貴州省沿河縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 銅仁 565300；2.貴州省銅仁市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 銅仁 554300；3.貴州大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550000）

0 引言

世界各地的許多雞品種不僅需要通過(guò)選擇培育去提高它的生長(zhǎng)特性，而且要提高屠宰和肉質(zhì)屬性。傳統(tǒng)的育種方法得到了各種分子遺傳學(xué)工具的支持，以提高生產(chǎn)性狀的遺傳增益率，加速育種目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。在標(biāo)記輔助選擇中，使用對(duì)這些特性具有顯著和積極影響的適當(dāng)分子標(biāo)記可以改善胴體和肉質(zhì)性狀。

胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（Insulin-like growth factor receptor 1，IGF1R）是一種酪氨酸激酶受體，由異四聚體跨膜糖蛋白的兩個(gè)細(xì)胞外α亞基（135 kDa）和2個(gè)跨膜β亞基（90 kDa）組成[1-2]。IGF1R屬于細(xì)胞調(diào)節(jié)劑家族，由3種激素組成，包括胰島素樣生長(zhǎng)因子1（Insulin-like growth factor 1，IGF1），IGF2和胰島素（Insulin），以及另一種稱為胰島素樣生長(zhǎng)因子2受體的受體（IGF2R）和6個(gè)胰島素樣受體生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（Six insulin-like growth factor binding proteins，IGFBP1-6）[3-4]。這些蛋白質(zhì)充當(dāng)內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌刺激物，在胚胎發(fā)生、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、有絲分裂、存活和代謝調(diào)節(jié)中起重要作用[5]。當(dāng)IGF1，IGF2或胰島素中的任何一種與受體結(jié)合，就會(huì)發(fā)生IGF1R信號(hào)，而這種信號(hào)可介導(dǎo)并促進(jìn)肌肉肥大的途徑，抑制有利于肌肉萎縮的生物途徑，進(jìn)而對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育起調(diào)控作用。由于具有上述功能，IGF1R基因已被認(rèn)為多種動(dòng)物生長(zhǎng)和胴體性狀的功能候選基因[6]。

在雞體內(nèi)，IGF1R基因定位于10號(hào)染色體上，含有21個(gè)外顯子和20個(gè)內(nèi)含子，跨域基因組140 315個(gè)bp（NCBI RefSeq：NC_006097.5，區(qū)域范圍為17，124，349-17，264，663）編碼一個(gè)900個(gè)氨基酸多肽（NCBI RefSeq：NM_205032.1）。目前有關(guān)IGF1R基因?qū)﹄u的體尺性狀和大多數(shù)屠宰性狀的影響的相關(guān)研究較為匱乏，特別是以貴州沿河鐵叫雞為研究動(dòng)物的研究信息則不存在。本研究目的是進(jìn)行IGF1R基因的多態(tài)性調(diào)查，并且評(píng)估其多態(tài)性及其基因型對(duì)雞體尺性狀和屠宰性狀的影響，以期為雞的科學(xué)選育培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

研究在貴州省沿河縣鐵叫雞育種場(chǎng)選取同批出殼、健康無(wú)病和同一飼養(yǎng)環(huán)境下的20周齡雞100只，每只雞翅靜脈采取血液2 mL用于總DNA的提取。

1.2 體重與體尺測(cè)定

在雞禁食12 h后稱量其活重，按照NY/T823—2004規(guī)定測(cè)定體尺[7]。

1.3 屠宰性能測(cè)定

在測(cè)定完體尺指標(biāo)后將雞頸靜脈放血致死，利用濕拔毛法，根據(jù)NY/T823—2004規(guī)定測(cè)定沿河鐵叫雞的屠宰性狀。

1.4 引物的設(shè)計(jì)和基因組DNA提取

按照大連寶生物血液基因組DNA提取試劑盒（TaKaRa，Dalian，China）說(shuō)明書提取基因組DNA。根據(jù)NCBI GeneBank已公布雞IGF1R基因（NCBI RefSeq：NC_006097.5）序列。Primer 3（美國(guó)Applied Biosystem公司）設(shè)計(jì)多態(tài)引物[8]，由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.5 DNA池PCR擴(kuò)增及測(cè)序分型

PCR反應(yīng)體系30.0 mL：15.0 mL PCR MasterMix，正、反向引物各2.0 mL，DNA模板1.0 mL，12.0 mL ddH2O。按預(yù)變性、退火、延伸、終延伸程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析，篩選出單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲取產(chǎn)物繼續(xù)送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，進(jìn)行基因分型。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

在線軟件SHEsis（http：//analysis.bio-x.cn/）構(gòu)建單倍型和雙倍型；PopGene 軟件（ver.1.32）計(jì)算等位基因頻率和等位基因型；PowerMarker 軟件（ver.3.25）對(duì)多態(tài)信息含量（PIC）進(jìn)行分析；采用PASW Statistics 18.0軟件對(duì)屠宰性能和體尺測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行有效性檢測(cè)，剔除不符合正態(tài)分布個(gè)體。一般線性模型（GLM）分析屠宰性能和體尺與IGF1R基因的關(guān)聯(lián)性，差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞IGF1R基因多態(tài)性分析結(jié)果

使用MegAlign分析雞IGF1R基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)在雞IGF1R基因的第3外顯子（Exon-3）有3個(gè)SNPs位點(diǎn)，即g.105384 C＞T、g.105333 A＞C和g.110681 A＞C。3個(gè)SNPs位點(diǎn)均存在3種基因型，突變點(diǎn)為同義突變，編碼氨基酸未改變。見圖1、圖2、圖3。

圖1 g.110681

圖2 g.105384

圖3 g.105333

2.2 雞IGF1R基因群體遺傳特性分析

雞IGF1R基因群體遺傳特性分析見表2。g.105384 C＞T、g.105333 A＞C和g.110681 A＞C這3個(gè)SNP位點(diǎn)均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）；優(yōu)勢(shì)基因型分別為CT、AC和AC，頻率均是0.580；優(yōu)勢(shì)等位基因和頻率分別為C（0.647）、C（0.647）、A（0.735）。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，g.105384 C＞T、g.105333 A＞C和g.110681 A＞C均未偏離Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

表2 SNP位點(diǎn)群體遺傳信息分析

2.3 雞IGF1R基因SNP單倍型和雙倍型分析結(jié)果

在線軟件SHEsis（http：//analysis.bio-x.cn/）構(gòu)建單倍型和雙倍型。結(jié)果顯示（表3），在試驗(yàn)沿河鐵叫雞群體中，存在4種單倍型（H1，H2，H3，H4），9種雙倍型（H1H1、H1H2、H1H3、H1H4、H2H2、H2H4、H3H3、H3H4和H4H4）。優(yōu)勢(shì)單倍型H1（73），頻率0.365，其次是H4（67），頻率0.335；優(yōu)勢(shì)雙倍型為H1H4（40），頻率0.400，其次是 H1H3（12）和H3H4（12）頻率均為0.120。

表3 SNPs的單倍型和雙倍型分析

2.4 雞IGF1R基因SNP與體尺的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

一般線性模型（GLM）分析了IGF1R基因多態(tài)與體尺的關(guān)聯(lián)性（表4）。結(jié)果顯示，g.105384 C＞T突變位點(diǎn)CC和CT基因型雞的體斜長(zhǎng)顯著大于CC基因型（P＜0.05）；g.105333 A＞C位點(diǎn)AA和AC基因型體斜長(zhǎng)顯著大于CC基因型（P＜0.05），g.110681 A＞C位點(diǎn)AA基因型髖骨寬顯著大于AC和CC基因型（P＜0.05）。

表4 IGF1R基因多態(tài)與體尺的關(guān)聯(lián)性分析

2.5 雞IGF1R基因SNP與屠宰性能的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

試驗(yàn)分析IGF1R基因多態(tài)與體尺的關(guān)聯(lián)性，詳見表5。結(jié)果表面，g.105384 C＞T位點(diǎn)TT基因型半凈膛和全凈膛重顯著高于CC基因型（P＜0.05），g.105333 A＞C位點(diǎn)AA基因型半凈膛和全凈膛重顯著高于CC基因型（P＜0.05），g.110681 A＞C突變位點(diǎn)CC基因型腿肌重顯著高于AA和AC基因型。

表5 IGF1R基因多態(tài)與屠宰性狀的關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

IGF1R基因已被研究為多種動(dòng)物體尺和胴體性狀的功能候選基因。在水牛、牦牛、山羊、豬和雞身上發(fā)現(xiàn)了與許多這些特性的顯著關(guān)聯(lián)[9-12]。雖然在雞方面，高鳳華等[13]研究IGF1R基因多態(tài)性對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響，但雞的衍生品種中進(jìn)行研究，同時(shí)IGF1R基因多態(tài)性與雞屠宰性狀的關(guān)聯(lián)相對(duì)較少。Ekegbu[14]檢測(cè)了新西蘭羅姆尼綿羊IGF1R基因從9號(hào)外顯子到10號(hào)內(nèi)含子片段中核苷酸變異，并發(fā)現(xiàn)其影響羊的屠宰性狀。而Byun等[15]發(fā)現(xiàn)了綿羊IGF1R基因核苷酸變異與壽命之間的關(guān)聯(lián)。鑒于上述IGF1R基因的生物學(xué)功能，并且IGF1R基因與許多其他候選基因一樣，對(duì)多個(gè)性狀具有多效性作用[16]。在這種情況下，雞的生長(zhǎng)、胴體和肌肉質(zhì)量的改善也可能伴隨著肉質(zhì)的改善。因此，廣泛和復(fù)雜的研究，包括廣泛的生產(chǎn)性狀，有可能提供適當(dāng)?shù)膬r(jià)值的分子標(biāo)記育種。

研究對(duì)IGF1R基因跨越部分內(nèi)含子和全部外顯子的片段進(jìn)行多態(tài)性分析，3個(gè)SNP位點(diǎn)g.105384 C＞T、g.105333 A＞C和g.110681 A＞C分別在IGF1R基因的外顯子3被檢測(cè)到，3個(gè)SNPs基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。某個(gè)群體未來(lái)世代的基因型和等位基因頻率，當(dāng)前種群的平衡狀態(tài)常用Hardy-Weinberg平衡預(yù)測(cè)，當(dāng)一個(gè)符合孟德爾群體之間交配隨機(jī)，并且無(wú)選擇、突變、遷移和遺傳漂變等事件發(fā)生時(shí)，那么基因頻率將保持不變，即這個(gè)群體被稱為處于Hardy-Weinberg平衡[17]。根據(jù)關(guān)聯(lián)分析法，3個(gè)SNPs可聯(lián)合組成8種單倍型和36雙倍型，但本試驗(yàn)只找到了4種單倍型和9種雙倍型，與理論有差距，可能與試驗(yàn)群體小或其他單倍體個(gè)體在人工選育中被淘汰有關(guān)。

關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示g.105384 C＞T突變位點(diǎn)CC和CT基因型雞的體斜長(zhǎng)顯著大于CC基因型（P＜0.05）；g.105333 A＞C位點(diǎn)AA和AC基因型體斜長(zhǎng)顯著大于CC基因型（P＜0.05），g.110681 A＞C位點(diǎn)AA基因型髖骨寬顯著大于AC和CC基因型（P＜0.05）。g.105384 C＞T位點(diǎn)TT基因型半凈膛和全凈膛重顯著高于CC基因型（P＜0.05），g.105333 A＞C位點(diǎn)AA基因型半凈膛和全凈膛重顯著高于CC基因型（P＜0.05），g.110681 A＞C突變位點(diǎn)CC基因型腿肌重顯著高于AA和AC基因型。前人研究證實(shí)，同義突變SNP在IGF1R基因中的雖不直接改變蛋白的一級(jí)序列[18]。然而，它可以引起IGF1R蛋白表達(dá)、構(gòu)象和功能的改變。而在羊中，3號(hào)外顯子核苷酸c.654G ＞ A突變，它編碼了IGF1R的尿道亞基的一部分，子亞基包含1個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域，參與配體結(jié)合。因此，該區(qū)域的任何變異，例如由IGF1R基因特定片段的核苷酸替換引起的變異，可能會(huì)影響IGF1R與IGF1或胰島素的相互作用，從而導(dǎo)致信號(hào)通路的改變。在綿羊IGF1R基因中，同義突變，c.654G ＞ A突變可擾亂轉(zhuǎn)錄、剪接、共翻譯折疊、mRNA穩(wěn)定，從而導(dǎo)致其他功能相關(guān)的變化[19]。此外，同義替換可以影響蛋白質(zhì)編碼區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)節(jié)因子，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。此外，最近研究揭示了非同義編碼SNP和同義編碼SNP在性狀方面表現(xiàn)出相似的似然性和效應(yīng)大小。g.105384 C＞T、g.105333 A＞C和g.110681 A＞C位點(diǎn)一些基因型對(duì)雞的體尺和屠宰性狀有顯著影響可能與此相關(guān)，不可忽視。在今后的選育培養(yǎng)過(guò)程中可根據(jù)實(shí)際需求選擇培育。