鄭秋樺,鄭翼澤,劉博婷,劉羽佳,曾松榮,黎棟然,李德有,吳京圩

鉆喙蘭快速繁殖技術(shù)體系優(yōu)化

鄭秋樺1,鄭翼澤2,劉博婷1,劉羽佳1,曾松榮1,黎棟然1,李德有1,吳京圩2

1. 韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院, 廣東 韶關(guān) 512005 2. 韶關(guān)市綠沃農(nóng)業(yè)科技有限公司, 廣東 韶關(guān) 512005

本文通過鉆喙蘭（(L.) Bl.）的快速繁殖技術(shù)體系優(yōu)化，以期提高鉆喙蘭的繁殖效率。分別考察初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)中培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度和配比對(duì)培養(yǎng)效果的影響，考察移栽煉苗遮光率對(duì)組培苗成活率的影響。結(jié)果表明：適宜鉆喙蘭種子外植體組培快繁體系為初代培養(yǎng)采用1/2MS培養(yǎng)基中添加6-芐氨基嘌呤（0.9 mg·L-1）和萘乙酸（0.1 mg·L-1）獲得愈傷組織的誘導(dǎo)率較高，可達(dá)96.8%；繼代培養(yǎng)采用1/2MS繼代培養(yǎng)基并添加6-芐氨基嘌呤（2.5 mg·L-1）和萘乙酸（1.4 mg·L-1）誘導(dǎo)率較高，可達(dá)96.4%；生根培養(yǎng)采用1/2MS培養(yǎng)基并添加萘乙酸（1.6 mg·L-1）鉆喙蘭生根率較高，可達(dá)95.1%；移栽練苗采用50%遮光率組培苗成活率最高，可達(dá)97.4%。通過鉆喙蘭的組培快繁技術(shù)體系的優(yōu)化，可為鉆喙蘭的栽培生產(chǎn)提供可借鑒的參考。

鉆喙蘭; 組培培養(yǎng); 技術(shù)優(yōu)化

附生蘭鉆喙蘭（(L.) Bl.）為蘭科鉆喙蘭屬的多年生草本植物，其株型緊湊，花繁色艷，花序懸垂，芳香怡人，花朵較?。ㄖ睆郊s為2 cm），唇尖不裂且向上翹起，頗具觀賞價(jià)值。鉆喙蘭花期在5～6月，花序纖長(zhǎng)，花瓣和花萼片紙質(zhì)，多白色，常具不規(guī)則排列的紫紅色斑點(diǎn)，唇瓣肉質(zhì)（多呈紫紅色），距白色，兩側(cè)壓扁，底端鈍圓[1-3]。在沒有人工控制的自然條件下，鉆喙蘭的種子不容易萌發(fā)，故而常用的繁殖方法是通過分株進(jìn)行繁殖，但常規(guī)方法效率較低，成為限制鉆喙蘭規(guī)?；a(chǎn)的瓶頸，故而通過繁殖系數(shù)較高，繁殖速度較快的組培快繁技術(shù)來獲得較高的繁殖效率，是解決海南鉆喙蘭栽培生產(chǎn)中種苗繁育效率問題的有效舉措[4-6]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物的脫毒和快繁方面，對(duì)植物種質(zhì)資源保護(hù)和轉(zhuǎn)基因育種也有重要作用[7-10]。但植物的組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)常因植物品種的不同和外植體部位的不同而差異較大。前人對(duì)蝴蝶蘭組織培養(yǎng)技術(shù)的研究結(jié)果表明，外植體誘導(dǎo)類原球莖可以采用種子（或胚），營(yíng)養(yǎng)體包括葉片、莖尖和根尖，以及花梗腋芽、花葶節(jié)間、花梗節(jié)等，進(jìn)而再增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)產(chǎn)生分生苗，最終移栽成活實(shí)現(xiàn)快速繁殖[11,12]。前人采用文心蘭的花梗腋芽為外植體進(jìn)行組培的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指明，以幼莖花梗腋芽為外植體能夠直接誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽[13]。在蘭花的組織培養(yǎng)過程中，經(jīng)常采用的培養(yǎng)基中包含無機(jī)鹽類、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等營(yíng)養(yǎng)組分，以促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)和胚狀體的分化。其中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和用量，以及不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比組合常常對(duì)外植體的誘導(dǎo)和分化效果以及原球莖和胚狀體的形成影響較大。有研究者指出，NAA和BA組合對(duì)多數(shù)蘭科植物的組培快繁誘導(dǎo)效果較好[14]。

本研究采用鉆喙蘭未成熟的種子為外植體，通過優(yōu)化鉆喙蘭的組培快繁技術(shù)體系，明確適宜的培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度和配比，提高誘導(dǎo)率和增殖率，以期為鉆喙蘭的工廠化育苗和規(guī)?；耘嗌a(chǎn)，提供必要的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以鉆喙蘭授粉后95 d的未成熟種子為材料，試驗(yàn)采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS和VW培養(yǎng)基，1/2MS培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中大量營(yíng)養(yǎng)元素成分含量減半的培養(yǎng)基。試驗(yàn)采用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（NAA和6-BA）均為北京康倍斯科技有限公司生產(chǎn)分裝生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初代培養(yǎng)將清水沖洗后的鉆喙蘭種子，用75.0％乙醇表面消毒3～5次，待乙醇揮發(fā)后剖開蒴果取出種子作為外植體進(jìn)行初代培養(yǎng)。取200粒種子接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在室溫（25 ℃）下，每天12 h光照（光照強(qiáng)度為1000～1500 lx）+12 h黑暗條件下培養(yǎng)60 d。采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，探究不同培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基，1/2MS培養(yǎng)和VW培養(yǎng)基），0.1，0.5，0.9 mg·L-16-BA以及0，0.10，0.20 mg·L-1NAA的不同組合，對(duì)鉆喙蘭種子外植體分化出愈傷組織的誘導(dǎo)率的影響。

1.2.2 繼代培養(yǎng)分別考察1/2MS繼代培養(yǎng)基中不同濃度的6-BA和NAA對(duì)指狀胚狀體（類原球莖）的誘導(dǎo)率的影響，設(shè)置1/2MS繼代培養(yǎng)基中6-BA濃度分別為0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg·L-1，NAA濃度分別為 0，0.2，0.8，1.4，2.0 mg·L-1，培養(yǎng)60 d后計(jì)算誘導(dǎo)率。

1.2.3 生根培養(yǎng)將胚狀體轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)62 d后調(diào)查組培苗的生根率。向1/2MS生根培養(yǎng)基中加入0，0.40，0.80，1.20和1.60 mg·L-1的NAA，考察不同濃度對(duì)組培苗生根率的影響。

1.2.4 移苗鍛煉將葉片長(zhǎng)約2 cm，并有2～3條粗壯的根（約1 cm長(zhǎng)），且生長(zhǎng)較為健壯的完整植株，轉(zhuǎn)移至陰涼處煉苗，7 d后將幼苗轉(zhuǎn)移至事先準(zhǔn)備好的砂床（粗椰糠:河沙為1:1）上，保持砂床濕度為80%～90%，在不同遮陰條件下（遮光30%，50%，70%）培養(yǎng)14 d，調(diào)查移栽成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行。誘導(dǎo)率和生根率的計(jì)算公式如下：

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）＝（產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)）×100

組培苗生根率（%）＝（生根苗數(shù)/培養(yǎng)苗總數(shù)）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 鉆喙蘭初代培養(yǎng)條件的優(yōu)化

由表1可以看出，初代培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基中添加0.9 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1NAA的處理愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)96.8%。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的最佳組合為A2B3C2，即在1/2MS+0.9 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA條件下以種子為外植體的鉆喙蘭初代培養(yǎng)，外植體的誘導(dǎo)率最高。三個(gè)因素中培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響最大，極差為8.6。

表 1 鉆喙蘭初代培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化

2.2 鉆喙蘭繼續(xù)代培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 不同6-BA濃度對(duì)鉆喙蘭繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)率的影響由圖1中的數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，隨著繼代培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA濃度的增加，鉆喙蘭繼代培養(yǎng)的胚狀體誘導(dǎo)率先升高后降低，當(dāng)培養(yǎng)基中添加6-BA的濃度為2.5 mg·L-1時(shí)，繼代培養(yǎng)鉆喙蘭胚狀體誘導(dǎo)率最高，可達(dá)96.4%。當(dāng)培養(yǎng)基中添加6-BA的濃度為2.0 mg·L-1和3.0 mg·L-1時(shí)，鉆喙蘭繼代培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率略低于2.5 mg·L-1處理，均超過92%。不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA時(shí)，胚狀體的誘導(dǎo)率最低。

圖 1 不同6-BA濃度對(duì)鉆喙蘭繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)率的影響

2.2.2 不同NAA濃度對(duì)鉆喙蘭繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)率的影響

圖 2 不同NAA濃度對(duì)鉆喙蘭繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)率的影響

由圖2可知看出，培養(yǎng)基中添加NAA后，鉆喙蘭繼代培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率逐漸增加，但當(dāng)NAA濃度高于1.4 mg·L-1后，鉆喙蘭胚狀體誘導(dǎo)率不再繼續(xù)增加，反而呈降低趨勢(shì)。可見，當(dāng)NAA濃度為1.4 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率最高，達(dá)93.1%，比不添加NAA的處理誘導(dǎo)率升高了13.4%。

2.3 不同濃度NAA對(duì)鉆喙蘭生根的影響

由圖3可知，鉆喙蘭組培苗的生根率隨生根培養(yǎng)基中NAA濃度的增加而升高。當(dāng)生根培養(yǎng)基中不添加NAA（0 mg·L-1）時(shí)，鉆喙蘭組培苗的生根率僅為81.3%；隨著鉆喙蘭組織培養(yǎng)生根培養(yǎng)基中添加的NAA濃度升高，鉆喙蘭組培苗的生根率也隨之升高，當(dāng)生根培養(yǎng)基中添加NAA的濃度為1.60 mg·L-1時(shí)，鉆喙蘭組培苗的生根率達(dá)到最高，為95.1%，比未添加NAA的處理生根率提高17%?？梢姡蜚@喙蘭組織培養(yǎng)生根培養(yǎng)基中添加NAA，可以起到顯著促進(jìn)鉆喙蘭組培苗生根的作用。

圖 3 不同濃度NAA對(duì)鉆喙蘭組培苗生根的影響

2.4 不同遮陰處理對(duì)鉆喙蘭組培苗移栽成活率的影響

由圖4可以看出，隨著遮光率的增加，鉆喙蘭組培苗移栽成活率呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，各遮光處理組培苗的移栽成活率均高于90%。當(dāng)遮光率為50%時(shí)，組培苗成活率達(dá)到最高，為97.4%，分別較遮光率為30%和70%的處理成活率升高了6.8%和1.7%，可見，半遮光即可有效增加組培苗的移栽成活率，繼續(xù)遮光對(duì)成活率產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖 4 不同遮陰處理對(duì)鉆喙蘭組培苗移栽成活率的影響

3 討論與結(jié)論

由于蘭花種子不適合自然條件下培育成苗，并且繁殖過程中存在繁殖周期長(zhǎng)以及繁殖效率低等問題，嚴(yán)重制約了鉆喙蘭栽培產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。蘭科植物的人工栽培生產(chǎn)中，常常將優(yōu)良單株通過組織培養(yǎng)的技術(shù)手段在短期內(nèi)進(jìn)行大批量的擴(kuò)繁，這樣不僅能獲得品種一致性較好的優(yōu)良群體，還能大大增加繁殖效率[15-18]。

植物器官的分化通常受內(nèi)源激素的影響，因此可以通過外源施加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理來改變內(nèi)源激素的平衡而產(chǎn)生影響器官分化的作用[19]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不僅在愈傷組織誘導(dǎo)中起到重要作用，而且在愈傷組織的生長(zhǎng)和分化中作用關(guān)鍵。前人研究結(jié)果表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA在誘導(dǎo)芽的萌發(fā)與不定芽增殖的過程中常常能起到促進(jìn)作用，另外，在低濃度下6-BA還能起到促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)的作用。6-BA和NAA的組合經(jīng)常用在植物組織培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化體系中[20]。

不管用哪個(gè)部位的外植體，在蘭科觀賞植物的組織培養(yǎng)過程通常都是按照從外植體先經(jīng)過分化形成原球莖，再形成叢生原球莖，最后生根發(fā)芽發(fā)育成苗[21]。本試驗(yàn)研究以鉆喙蘭未成熟種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過優(yōu)化組織培養(yǎng)條件參數(shù)，達(dá)到提高繁殖效率的目的，最終獲得了能夠顯著提高繁殖效率的較優(yōu)培養(yǎng)條件。

本研究結(jié)果表明，以鉆喙蘭未成熟種子為外植體，較優(yōu)的初代培養(yǎng)條件為1/2MS培養(yǎng)基中添加0.9 mg·L-16-BA和0.1 mg·L-1NAA，在此條件下愈傷組織誘導(dǎo)率較高；繼代培養(yǎng)采用1/2MS繼代培養(yǎng)基中加入2.5 mg·L-16-BA和1.4 mg·L-1NAA；生根培養(yǎng)中采用1/2MS+1.6 mg·L-1NAA培養(yǎng)基能獲得較高的生根率；移栽煉苗采用50%遮光率組培苗成活率最高，可達(dá)97.4%。通過鉆喙蘭的組培快繁技術(shù)體系的優(yōu)化，可為鉆喙蘭的栽培生產(chǎn)提供可借鑒的參考。

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Optimization for the Rapid Propagation Techological System of(L.) Bl.

ZHENG Qiu-hua1, ZHENG Yi-ze2, LIU Bo-ting1, LIU Yu-jia1, ZENG Song-rong1, LI Dong-ran1, LI De-you1, WU Jing-xu2

1.512005,2.512005,

The division propagation method which was commonly used in usual was inefficient and hard to satisfy production requirements. The efficiency of propagation could be raised by optimization of tissue culture system for rapid propagation of(L.) Bl.. The substrates and plant growth regulators in primary culture, subculture and root induction culture were investigated in order to promote tissue culture, and the shading coefficient was observed after transplanting in order to promote propagation. The research results showed that the optimized tissue culture system for rapid propagation ofwere 1/2Ms+6-BA0.9 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1in primary culture with the frequency of callus induction of 96.8%, 1/2MS+6-BA 2.5 mg·L-1+NAA 1.4 mg·L-1in subculture with the frequency of induction of 96.4% and 1/2MS+NAA1.6 mg·L-1in root induction culture with the rooting percentage of 95.1%. The 50% of shading coefficient had the highest survival rate of 97.4% after transplanting. The research results could provide references for. cultivation and production with higher efficiency.

(L.) Bl.; tissue culture; techological optimization

S682.31

A

1000-2324(2022)04-0548-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.04.008

2022-01-11

2022-02-31

廣東省韶關(guān)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(200810224537589);廣東省韶關(guān)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(200812154532904);廣東省韶關(guān)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(200811114531461);韶關(guān)學(xué)院2020年度國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(202010576003X)

鄭秋樺(1980-),男,碩士,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,主要從事植物組織培養(yǎng)、蘭花產(chǎn)業(yè)化等方面的研究. E-mail:55y55@126.com