王雪娟 宋玉霞 崔培林 李建彪 石晶 魏會娟

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期女性最常見疾病之一，發(fā)病率占育齡期女性的10%左右[1]。臨床癥狀主要有：腹痛(進(jìn)行性痛經(jīng)、性交痛、慢性盆腔痛)和不孕，大約50%的子宮內(nèi)膜異位癥患者伴有盆腔痛，40%～50%的患者合并不孕癥，嚴(yán)重影響了患者身心健康和生活質(zhì)量[2]。因此，對影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞在異位處存活、侵襲、生長等因素進(jìn)行分子機(jī)制研究，可完善內(nèi)異癥的發(fā)生機(jī)制，而且有助于確定內(nèi)異癥治療的潛在分子靶點(diǎn)。越來越多的證據(jù)表明微小RNAs(miRNAs)在人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療轉(zhuǎn)歸過程中起重要作用[3-5]。miR-205是一種重要的miRNA分子。生物信息學(xué)軟件分析表明miR-205可靶向調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA )的表達(dá)，且在腫瘤的研究中也證實(shí)miR-205可直接靶向作用VEGFA[6-8]。子宮內(nèi)膜異位癥雖然是一種良性疾病，但具有種植、侵襲、復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)行為，血管生成是異位病灶處存活和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。因此，本研究擬檢測miR-205和VEGFA在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者在位、異位內(nèi)膜中的表達(dá)情況，探討二者的作用，并分析二者表達(dá)水平的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年12月至2021年6月于石家莊市人民醫(yī)院婦科住院行腹腔鏡手術(shù)治療的50例卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者(病例組)在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織。所有患者經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥，根據(jù)美國生育學(xué)會修正的分期標(biāo)準(zhǔn)(r-AFS)分期為Ⅲ、Ⅳ期卵巢子宮內(nèi)膜異位癥。收集同期因卵巢冠囊腫行腹腔鏡手術(shù)或行腹腔鏡下輸卵管結(jié)扎術(shù)患者的正常內(nèi)膜組織55例為對照組，術(shù)中排除患有子宮內(nèi)膜異位癥。病例組年齡21～40歲，平均年齡(36.5±6.7)歲；對照組年齡23～42歲，平均年齡(37.6±5.6)歲。2組患者年齡分布匹配，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2組患者均月經(jīng)規(guī)律，內(nèi)膜收集均在月經(jīng)周期的分泌期(末次月經(jīng)時期及病理特征來確定)，且2組患者術(shù)前6個月內(nèi)均未應(yīng)用激素類藥物。標(biāo)本收集及臨床資料經(jīng)患者及家屬知情同意。組織標(biāo)本均在離體后30 min內(nèi)收集，放入裝有RNAlater 液的EP管里浸泡，4℃冰箱過夜后轉(zhuǎn)入-20℃保存。此項(xiàng)研究獲石家莊市人民醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑 購于天根生化科技有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa生物技術(shù)有限公司；Quantinova TMSYBR green pcr Kit試劑盒購于上海凱杰生物技術(shù)有限公司；miRNA提取試劑盒和miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 購于美國Invitrogen公司；miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒購于美國Invitrogen公司；PCR擴(kuò)增引物序列上海生工生物工程有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 內(nèi)膜組織總RNA提取及合成cDNA： 應(yīng)用TRIzol抽提對照內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000檢測其濃度和純度后，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。miRNA提取試劑盒抽提上述在位、異位及對照內(nèi)膜組織的miRNA，Nanodrop2000檢測其濃度和純度，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20℃冰箱。

1.3.2 VEGFA和miR-205表達(dá)水平檢測： 目的基因VEGFA的表達(dá)水平應(yīng)用PCR擴(kuò)增來檢測，使用QuantiNova TMSYBR green pcr Kit試劑盒按說明書操作進(jìn)行。反應(yīng)體系為：Mix液10.0 μl、Rox 0.1 μl、cDNA模板1.0 μl、上下游引物各1.4 μl、最后加去離子水至20 μl。反應(yīng)引物序列：目的基因VEGFA的上游引物為5’-ACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCAT-3’，下游引物為5’-TCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCAAGT-3’；GAPDH為內(nèi)參基因，其上、下游引物序列為5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’和5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。目的基因miR-205的表達(dá)水平檢測應(yīng)用miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒按說明書操作進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：Mix液5.0 μl、上下游引物各1.0 μl、cDNA 模板1.0 μl、最后加去離子水至10 μl。反應(yīng)引物序列：目的基因miR-205的上游引物為：5’-ACACTCCAGCTGGGTCCTTCATTCC-3’，下游引物為：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAG

TCGGCAATTCAGTTGAGCAGACT-3’；內(nèi)參U6基因的上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，下游引物為5’-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3’。每個組織樣本設(shè)置3個副孔，VEGFA和miR-205在不同內(nèi)膜組織中的相對表達(dá)量應(yīng)用2-△△CT法計(jì)算獲得。

2 結(jié)果

2.1 VEGFA基因mRNA在異位、在位和對照內(nèi)膜中表達(dá)情況 與在位和對照內(nèi)膜相比，VEGFA基因mRNA在異位內(nèi)膜中的表達(dá)量顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；且在位內(nèi)膜組織中VEGFA基因mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照內(nèi)膜組織(P<0.007)。見表1。

表1 VEGFA基因mRNA在不同內(nèi)膜組織中表達(dá)情況

2.2 miR-205在不同內(nèi)膜中的表達(dá) 異位內(nèi)膜組織中miR-205的表達(dá)量顯著低于在位和對照內(nèi)膜，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且在位內(nèi)膜組織中miR-205的相對表達(dá)量顯著低于對照內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.009)。見表2。

表2 miR-205在不同內(nèi)膜組織中表達(dá)情況

2.3 異位內(nèi)膜組織中VEGFA和miR-205表達(dá)水平相關(guān)性 Pearson分析結(jié)果顯示：miR-205與VEGFA基因mRNA在異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.637，P<0.05)。見表3。

表3 異位內(nèi)膜組織中miR-205和VEGFA基因mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.4 異位內(nèi)膜組織中miR-205表達(dá)對卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的診斷意義 結(jié)果提示miR-205診斷卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的ROC曲線下面積(AUC值)為0.918，95%可信區(qū)間為0.858～0.978，與AUC=0.5比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明異位內(nèi)膜組織中miR-205表達(dá)對卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的診斷具有較高的準(zhǔn)確性。最優(yōu)截?cái)帱c(diǎn)為0.7665，在最優(yōu)截?cái)帱c(diǎn)靈敏度和特異度分別為83.6%和98.0%。見圖1。

圖1 異位內(nèi)膜組織中miR-205表達(dá)水平判斷卵巢子宮內(nèi)膜

3 討論

miRNAs是一類廣泛分布于組織細(xì)胞的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約19～25個核苷酸，具有高度保守性、時序性和組織特異性，通過與靶基因mRNA的 3'UTR結(jié)合引起mRNA降解或者抑制其翻譯來調(diào)控基因表達(dá)。國內(nèi)外學(xué)者們對大腸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌等惡性腫瘤的研究表明腫瘤組織中miRNAs呈不同的表達(dá)，異常表達(dá)的miRNAs參與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲及預(yù)后等過程[9-12]。子宮內(nèi)膜異位癥具有惡性腫瘤相似的生物學(xué)特性，其發(fā)生和發(fā)展是多個基因參與的、錯綜復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)作用的結(jié)果，miRNAs與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制的研究日漸關(guān)注。研究證實(shí)miRNA在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜和異位病灶中的表達(dá)存在顯著差異，這些異常的miRNA通過調(diào)控靶基因及其下游的信號通路參與子宮內(nèi)膜異位癥的形成[13-15]。

miR-205是miRNAs家族重要成員之一，研究表明其在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起作用。先前的文獻(xiàn)報(bào)道了miR-205在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，而在甲狀腺乳頭狀癌、大腸癌中表達(dá)下調(diào)，表明miR-205根據(jù)腫瘤組織和類型的不同發(fā)揮不同的作用，既可作為癌基因促進(jìn)腫瘤發(fā)生，又可作為抑癌基因而起到抑制腫瘤生成的角色[16-19]。本研究檢測了miR-205在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及對照內(nèi)膜中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中miR-205的表達(dá)水平顯著低于在位內(nèi)膜及對照內(nèi)膜，且在位內(nèi)膜組織中miR-205的表達(dá)水平顯著低于對照內(nèi)膜。

生物信息學(xué)軟件分析顯示miR-205可靶向調(diào)控VEGFA的表達(dá)，且在腫瘤的研究中也證實(shí)miR-205可靶向作用VEGFA的表達(dá)。Zhao等[6]研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的miR-205通過降低VEGFA水平來抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Cao等[7]研究表明表達(dá)下調(diào)的miR-205通過靶向上調(diào)VEGFA表達(dá)來促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。此外，Wang等[8]報(bào)道了卵巢癌中miR-205也通過作用VEGFA來調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡。以上研究結(jié)果均表明miR-205通過調(diào)控VEGFA起作用，但miRNA具有組織特異性，子宮內(nèi)膜組織中miR-205是否調(diào)控VEGFA表達(dá)目前尚未見報(bào)道。本研究通過Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)異位病灶中miR-205的表達(dá)水平與VEGFA基因mRNA的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)性，這些結(jié)果表明表達(dá)下調(diào)的miR-205可能通過靶向調(diào)控VEGFA表達(dá)來促進(jìn)卵巢子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展。

VEGFA是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，具有維持血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性和促進(jìn)血管生成的功能，是調(diào)控血管生成的關(guān)鍵蛋白因子。先前的研究報(bào)道了子宮內(nèi)膜異位癥患者血清及異位病灶中VEGFA的表達(dá)水平顯著高于對照患者，且隨著病情的加重而升高[20-23]。與先前的結(jié)果一致，本研究應(yīng)用RT-qPCR檢測了卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者在位和異位內(nèi)膜組織中VEGFA基因mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示異位內(nèi)膜組織中VEGFA的表達(dá)量顯著高于在位和對照內(nèi)膜組織，且在位內(nèi)膜組織中VEGFA的表達(dá)量顯著高于對照內(nèi)膜。血管生成是異位病灶處存活和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，經(jīng)血逆流入腹腔的內(nèi)膜組織，在異位處黏附形成新生血管，從而在異位處存活并發(fā)展成異位病灶。因此，我們的研究結(jié)果表明表達(dá)下調(diào)的miR-205可能通過靶向上調(diào)VEGFA，導(dǎo)致新生血管生成增多，從而促進(jìn)卵巢子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生和發(fā)展。當(dāng)然，我們的結(jié)果需要更進(jìn)一步的驗(yàn)證，并需要在內(nèi)膜細(xì)胞上應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因載體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-205與VEGFA的靶向關(guān)系。

綜上所述，表達(dá)下調(diào)的miR-205可能通過靶向調(diào)控VEGFA的表達(dá)來促進(jìn)卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展。進(jìn)一步探索miR-205在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中的作用機(jī)制，可為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的早期診斷及治療提供新思路。