柏發(fā)蕊 許棟

不可逆的氣流限制是慢性阻塞性肺疾病(Chrinic obstructive pulimonary disease，COPD)主要病理特征，與肺對(duì)有毒粒子/氣體的異常炎性反應(yīng)相關(guān)[1]。研究表明，隨著生活方式、環(huán)境的發(fā)展，COPD已成為導(dǎo)致死亡的主要病因，且其發(fā)病率、病死率趨于逐年升高，對(duì)社會(huì)健康造成嚴(yán)重威脅[2,3]。肺氣腫作為常見(jiàn)影像學(xué)表現(xiàn)，已被認(rèn)定是其重要表型。在COPD合并肺氣腫發(fā)病過(guò)程中肺部產(chǎn)生異常炎性反應(yīng)釋放炎性介質(zhì)，如白介素、C反應(yīng)蛋白等，是評(píng)估炎性反應(yīng)的常用評(píng)價(jià)指標(biāo)，但缺乏可靠的預(yù)測(cè)診斷指標(biāo)[4,5]。相關(guān)研究表明，血清不規(guī)則趨化因子(CX3CL1/FKN)作為跨膜糖蛋白，其生化特征、染色體定位等均表明其在白細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞趨化的分子控制機(jī)制中發(fā)揮獨(dú)特作用，而由Clara細(xì)胞分泌合成的Clara 細(xì)胞分泌蛋白(CC16)具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)活性，是促進(jìn)COPD發(fā)生、發(fā)展的重要因素[6,7]。有研究指出，GULP1作為調(diào)控凋亡細(xì)胞的吞噬關(guān)鍵蛋白，在COPD凋亡細(xì)胞清理缺陷中發(fā)揮重要作用[8]?；诖耍ㄟ^(guò)檢測(cè)COPD合并肺氣腫患者血清CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達(dá)，了解COPD合并肺氣腫發(fā)生情況及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取我院2019年1月至2021年1月收治的98例慢性阻塞性肺疾病患者為觀察組，其中男52例，女46例；年齡45～73歲，平均年齡(59.00±11.90)歲；同期選取100例體檢健康人員為對(duì)照組，其中男52例，女48例；年齡43～76歲，平均年齡(59.5±14.02)歲。按照是否合并肺氣腫將觀察組分為COPD患者43例，COPD合并肺氣腫患者55例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬知情并簽署同意書(shū)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《慢性阻塞性肺疾病基層診療指南(實(shí)踐版·2018)》中COPD相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；均為穩(wěn)定期COPD患者，經(jīng)影像學(xué)檢查確診；健康人員身體健康無(wú)任何疾病。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：心肺、肝腎等臟器功能嚴(yán)重?fù)p傷者；合并基礎(chǔ)疾病、免疫障礙、血液系統(tǒng)疾病者；合并惡性腫瘤者；既往有氣管插管病史；合并影響呼吸系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病者；近期內(nèi)吸入/口服糖皮質(zhì)激素者；長(zhǎng)效應(yīng)用抗膽堿能藥物。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 肺功能檢測(cè):采用Master Screen肺功能儀檢測(cè)用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、第1秒用力呼氣量(forced expiratory volume in first second，F(xiàn)EV1)、FEV1/FVC%水平，均測(cè)量>3次，保留3次最佳數(shù)值，取其平均值。

1.3.2 血樣采集:于接診當(dāng)日抽取所有受試者5 ml空腹靜脈血，置于EDTA抗凝管中，離心處理10 min(轉(zhuǎn)速：3 000 r/min，離心半徑12 cm)，分離上清，于-20℃下低溫保存。

1.3.3 CX3CL1/FKN、CC16含量測(cè)定:采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)受試者CX3CL1/FKN、CC16含量，檢測(cè)時(shí)酶標(biāo)板分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，每孔內(nèi)均加入50 μl稀釋液，空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔內(nèi)分別加入樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣片各 50 μl，輕晃均勻，酶標(biāo)板覆膜，室溫孵育2 h。孵育結(jié)束后棄孔內(nèi)液體，甩干，采用洗滌液反復(fù)清洗反應(yīng)板。每孔內(nèi)加入CX3CL1/FKN、CC16檢測(cè)液100 μl，重新覆膜，室溫孵育1 h，棄孔內(nèi)液體，甩干、洗滌反應(yīng)板，每孔內(nèi)加入100 μl底物溶液，室溫避光顯色30 min，加入50 μl終止液，輕彈酶標(biāo)板終止反應(yīng)。

1.3.4 GULP1表達(dá)測(cè)定:患者入院接受常規(guī)纖維支氣管鏡檢查時(shí)，首先根據(jù)病情選擇刷檢部位，操作時(shí)利用一次性無(wú)菌細(xì)胞刷輕輕刷取氣道上皮，將刷檢下來(lái)的細(xì)胞收集于培養(yǎng)液中，離心洗滌后，將其配置為細(xì)胞懸液，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，將細(xì)胞調(diào)制為所需濃度的細(xì)胞懸液用于檢測(cè)。采用免疫組化SP染色法對(duì)受試者GULP1表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，脫蠟、水化等處理后，將其在0.01 mol/L、95℃的枸櫞酸緩沖液中浸泡，并進(jìn)行熱修復(fù)，3% H2O2環(huán)境下培育10 min，滴入山羊血清，26℃環(huán)境中培養(yǎng)30 min，抽離封閉液、添加一抗(鼠抗單克隆抗體GULP1，1∶1 000)，4℃過(guò)夜培養(yǎng)，PBS洗滌，加入二抗(鼠抗單克隆抗體β-actin，1∶5 000)，37℃恒溫條件下孵育30 min，PBS洗滌，顯色，蘇木精復(fù)染后洗滌、脫水、透明、封片。采用雙盲法閱片將GULP1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞所占總細(xì)胞比例分為4等級(jí)，陰性：<5%；弱陽(yáng)性：5%～25%；中等陽(yáng)性：26%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性：>50%，分別記為0、1、2、3分。每樣本統(tǒng)計(jì)20個(gè)肺泡腔巨噬細(xì)胞數(shù)量，評(píng)價(jià)每個(gè)肺泡腔≥10個(gè)巨噬細(xì)胞為肺泡巨噬細(xì)胞高水平，<10個(gè)巨噬細(xì)胞為肺泡巨噬細(xì)胞低水平。

2 結(jié)果

2.1 2組患者肺功能指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，觀察組患者FVC、FEV1、FEV1/FVC水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且COPD合并肺氣腫患者FVC、FEV1、FEV1/FVC水平低于COPD患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組患者肺功能指標(biāo)比較

2.2 2組患者CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，觀察組患者CX3CL1/FKN、GULP1表達(dá)水平升高，CC16水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且COPD合并肺氣腫患者CX3CL1/FKN、GULP1表達(dá)高于COPD患者，CC16水平低于COPD患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組患者CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達(dá)比較

2.3 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達(dá)與COPD合并肺氣腫肺功能相關(guān)性分析 以CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CX3CL1/FKN、GULP1與COPD合并肺氣腫FVC、FEV1、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，CC16與COPD合并肺氣腫FVC、FEV1、FEV1/FVC呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達(dá)與COPD合并肺氣腫肺功能相關(guān)性分析

2.4 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達(dá)與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性分析 以CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，COPD合并肺氣腫患者CX3CL1/FKN、GULP1與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(P<0.05)，CC16與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達(dá)與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

2.5 COPD合并肺氣腫影響因素的多元Logistic回歸分析 將COPD合并肺氣腫發(fā)病(輕度=0，中重度=1)作為因變量，將 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1作為自變量，賦值升高設(shè)為1，正常設(shè)為0，納入二分類多因素Logistic回歸模型分析，結(jié)果顯示，CX3CL1/FKN、CC16、GULP1為影響COPD合并肺氣腫發(fā)病的因素(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 COPD合并肺氣腫影響因素的多元Logistic回歸分析

2.6 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1在COPD合并肺氣腫中的相關(guān)性分析 CX3CL1/FKN與CC16呈負(fù)相關(guān)(r=-0.597，P=0.001)；CX3CL1/FKN與GULP1呈正相關(guān)(r=0.712，P=0.001)；CC16與GULP1呈負(fù)相關(guān)(r=-0.702，P=0.001)。見(jiàn)表6。

表6 CX3CL1/FKN、CC16、GULP1在COPD合并肺氣腫中的相關(guān)性分析

3 討論

肺氣腫作為COPD重要表型，主要由細(xì)支氣管、肺泡壁彈性下降及過(guò)度膨脹破裂導(dǎo)致，可導(dǎo)致呼吸衰竭甚至死亡，嚴(yán)重威脅患者生命安全，故COPD診斷對(duì)預(yù)防COPD合并肺氣腫具有獨(dú)特意義[10]。

本研究指出，COPD合并肺氣腫患者CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達(dá)高于COPD患者、健康者，提示CX3CL1/FKN、CC16、GULP1可能參與COPD合并肺氣腫的發(fā)生發(fā)展。研究表明，炎性反應(yīng)可促進(jìn)COPD合并肺氣腫的發(fā)展過(guò)程。CX3CL1/FKN作為常見(jiàn)炎性因子，可趨化、激活白細(xì)胞參與炎性反應(yīng)的各個(gè)階段，促進(jìn)炎癥發(fā)生，與肺部疾病的發(fā)展存在緊密關(guān)聯(lián)[11,12]。相關(guān)研究表明，CX3CL1/FKN在COPD合并肺氣腫患者血清中水平明顯高于COPD患者，證實(shí)COPD合并肺氣腫患者存在慢性炎性反應(yīng)，導(dǎo)致大量炎性因子生產(chǎn)，對(duì)疾病進(jìn)展造成影響[13,14]。CC16主要由Clara細(xì)胞分泌，具有氣道保護(hù)、抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用，并參與肺部疾病發(fā)病的病理過(guò)程[15]。相關(guān)研究表明，在COPD小鼠氣道中CC16免疫染色減少，并與肺部炎癥、肺泡細(xì)胞凋亡、氣道重塑存在顯著關(guān)聯(lián)[16]。相關(guān)研究指出，CC16可能參與COPD合并肺氣腫的發(fā)生，對(duì)患者肺功能指標(biāo)造成影響[17,18]。本研究證實(shí)CX3CL1/FKN、CC16參與COPD合并肺氣腫發(fā)病的病理過(guò)程。GULP1已證實(shí)參與關(guān)節(jié)炎、精神分裂癥及癌癥等多種疾病發(fā)生發(fā)展，但臨床中有關(guān)GULP1與COPD疾病進(jìn)展的研究較少[19,20]。有學(xué)者指出，GULP1在COPD不同階段肺組織支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)存在差異，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[21]。本研究表明，COPD合并肺氣腫患者CX3CL1/FKN、GULP1高于COPD患者、健康者，CC16低于COPD患者、健康者，由此表明CX3CL1/FKN、CC16、GULP1參與COPD合并肺氣腫的生理病理過(guò)程。同時(shí)研究證實(shí)CX3CL1/FKN、CC16、GULP1與肺功能指標(biāo)變化及病情嚴(yán)重程度存在相關(guān)性，通過(guò)檢測(cè)上述指標(biāo)水平，可對(duì)COPD合并肺氣腫發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行早期預(yù)測(cè)，做好預(yù)防措施，從而改善COPD合并肺氣腫發(fā)病率及病死率。

綜上所述，CX3CL1/FKN、CC16、GULP1表達(dá)與肺功能指標(biāo)、病情嚴(yán)重程度存在明顯相關(guān)性，提示其表達(dá)變化能夠有效COPD合并肺氣腫的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)COPD合并肺氣腫的預(yù)防具有重要裨益，有望成為評(píng)估COPD疾病診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物，為COPD合并肺氣腫提供新的臨床途徑。