胥雅靜 王佳偉 趙巖秋 江 成 黃李超 安 軼 曾 為 張 進(jìn) 盧孟柱

(浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311300)

木材即次生木質(zhì)部，是維管形成層細(xì)胞增殖、分化的產(chǎn)物，包含木質(zhì)部細(xì)胞次生細(xì)胞壁加厚的過(guò)程(Chaffeyetal., 2002)。次生壁是木材的主要成分，主要由木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等構(gòu)成。其中木質(zhì)素是植物中含量?jī)H次于纖維素的第二大高聚物(Zhangetal., 2020)。

木質(zhì)素可提供植物機(jī)械支撐力，并可作為天然屏障抵御生物侵害，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用(Voelkeretal., 2010)。木質(zhì)素在木材產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用有利有弊：一方面木質(zhì)素存在會(huì)降低傳統(tǒng)造紙的出漿率和紙張質(zhì)量；另一方面木質(zhì)素可作為生物質(zhì)固碳并在新能源開(kāi)發(fā)上得到利用(Wengetal., 2008)。基于對(duì)木質(zhì)素的不同需求，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控木材中木質(zhì)素含量具有重要意義(李少鋒, 2019)。

木質(zhì)素由對(duì)香豆醇、松柏醇和芥子醇3種單體按照一定比例組合而成。木質(zhì)素生物合成過(guò)程中有很多酶參與催化反應(yīng)(Boerjanetal., 2003)，根據(jù)木質(zhì)素生物合成途徑中不同酶的作用部位，可通過(guò)調(diào)節(jié)酶活性實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)素生物合成的調(diào)控。肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、香豆酸-3-羥基化酶(C3′H)、阿魏酸-5-羥基化酶(F5H)是3種木質(zhì)素單體合成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位細(xì)胞色素P450單氧酶，分別催化3種單體前體的合成。C3′H、C4H、F5H是具有錨點(diǎn)或成核中心的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征的Ⅰ型膜蛋白，能與該途徑中其他酶結(jié)合調(diào)控木質(zhì)素代謝通路(Bassardetal., 2012; Scottetal., 2016)。在苜蓿(Medicagosativa)中降低C4H、C3′H表達(dá)能夠減少木質(zhì)素含量，而F5H表達(dá)的改變不影響木質(zhì)素的含量(Reddyetal., 2005)。在木本植物毛果楊(Populustrichocarpa)中有參與促進(jìn)P450單氧酶形成復(fù)合物的膜蛋白，可以確保酶活性以進(jìn)行高效催化(Chenetal., 2011)。

膜相關(guān)孕激素受體(MAPRs)是一類具有非共價(jià)細(xì)胞色素b5-like類固醇結(jié)合域(cytochrome b5-like haem/steroid-binding domain，Cyt-b5)的小分子蛋白質(zhì)，可以調(diào)節(jié)P450酶活性(Chenetal.，2011; Kimuraetal.，2012; Ryuetal., 2017; Mifsudetal., 2002)。膜類固醇結(jié)合蛋白(MSBP)AtMSBP1是植物中鑒定的第一個(gè)膜類固醇結(jié)合蛋白，屬Cyt-b5蛋白超家族(Kaoetal.，2005; Mifsud et al., 2002)，MSBP1是擬南芥(Arabidopsisthaliang)中響應(yīng)甾體信號(hào)的關(guān)鍵蛋白，在負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長(zhǎng)、響應(yīng)鹽脅迫和調(diào)控木質(zhì)素合成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Shietal., 2011; Witzeletal., 2018; Yangetal., 2008; Gouetal., 2018)。鑒于MSBP1對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的多重影響，該蛋白被進(jìn)一步認(rèn)為是質(zhì)膜衍生的內(nèi)吞小泡，可以通過(guò)參與生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN2的循環(huán)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的再分配(Yangetal., 2008)，以及通過(guò)介導(dǎo)BR信號(hào)受體BAK1的內(nèi)吞作用調(diào)節(jié)BR信號(hào)(Shietal., 2011; Songetal., 2009)。近期在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，MSBP1可與其同系物MSBP2形成復(fù)合體，并與3種木質(zhì)素單體合成P450單加氧酶相互作用，從而形成MSBP-P450酶蛋白復(fù)合物。MSBPs可以維持相互作用的P450酶的活性和穩(wěn)定性，對(duì)于可溶性酚酯和苯丙烷類單體生物合成十分重要 (Shietal., 2011; Gouetal., 2018)。

楊樹(shù)是研究木本植物生長(zhǎng)發(fā)育的模式物種，揭示楊樹(shù)木材形成機(jī)制可為林木育種提供重要理論支撐?；贛SBP調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要作用，研究其在楊樹(shù)木材形成，尤其是木質(zhì)素合成中的作用具有重要意義。鑒于此，本研究通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，從銀腺楊84K(PopulusalbaXP.glandulosa‘84K’)克隆得到擬南芥AtMSBP1同源基因PagMSBP1/2a，進(jìn)行理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位分析后，進(jìn)一步構(gòu)建PagMSBP1/2a基因過(guò)表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得過(guò)表達(dá)PagMSBP1/2a的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)，分析植株生長(zhǎng)發(fā)育和木質(zhì)素含量，為研究MSBP1對(duì)木本植物木質(zhì)素合成的調(diào)控作用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

試驗(yàn)材料為銀腺楊無(wú)性系84K，由浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室林木木材品質(zhì)研究團(tuán)隊(duì)保存。試驗(yàn)所用楊樹(shù)均由組培苗擴(kuò)繁而來(lái)，并由組培苗移栽至培養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。楊樹(shù)幼苗培養(yǎng)條件為16 h/8 h(光照/黑暗)，溫度25 ℃。取不同組織樣品用于基因表達(dá)組織特異性分析。

試驗(yàn)所使Gateway入門載體pDNOR207、帶GFP的過(guò)表達(dá)載體PMDC43、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101菌種均購(gòu)自維地生物?？俁NA提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit購(gòu)自TaKaRa公司，PCR高保真酶Prime STAR HS、DNA marker等購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，Gateway試劑盒購(gòu)于Life Technologies公司。

1.2 楊樹(shù)MSBP基因獲取及結(jié)構(gòu)分析

取擬南芥AtMSBP1序列在楊樹(shù)基因組中進(jìn)行Blast分析，獲取楊樹(shù)MSBP基因的氨基酸序列； 通過(guò)MEGA7軟件基于遺傳距離的鄰近法構(gòu)建擬南芥和楊樹(shù)的MSBP基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Kumaretal., 2016)。根據(jù)擬南芥和楊樹(shù)的MSBP基因序列信息，通過(guò)GSDS2.0在線分析擬南芥和楊樹(shù)MSBP基因的內(nèi)含子與外顯子結(jié)構(gòu)，并繪制基因結(jié)構(gòu)圖(Huetal., 2015)。

1.3 RNA提取、cDNA合成及組織特異性表達(dá)分析

將不同組織樣品在液氮中研磨成粉，頂芽、根、幼莖(1～3節(jié)間)、老莖(6～8節(jié)間)、葉的RNA提取與cDNA的合成分別采用RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN)和PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)完成，具體方法參見(jiàn)試劑盒使用說(shuō)明。qPCR使用CFX96 Real-time PCR Detection System(Bio-Rad, Hercules, CA)，反應(yīng)體系按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)說(shuō)明書，每個(gè)樣品4個(gè)重復(fù)。PCR程序： 95 ℃，30 s預(yù)變性； 95 ℃，5 s變性，55 ℃，30 s退火，72 ℃，30 s延伸，35次循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)镻tACTIN。楊樹(shù)MSBP1/2基因定量引物(表1)使用在線引物設(shè)計(jì)軟件BatchPrime(https:∥probes.pw.usda.gov/batchprimer3/index.html)設(shè)計(jì)得到。利用楊樹(shù)資源數(shù)據(jù)庫(kù)(AspWood, http:∥aspwood.popgenie.org)獲取MSBPs在木材形成過(guò)程中的表達(dá)情況 (Sundelletal., 2017)。

1.4 楊樹(shù)PagMSBP1/2a基因的克隆與結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)毛果楊中PtMSBP1/2a(Potri.015G139800)基因序列，在銀腺楊84K基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Qiuetal., 2019)中進(jìn)行Blast分析以得到其同源基因PagMSBP1/2a，使用Primer3設(shè)計(jì)特異引物PagMSBP1/2a-F和PagMSBP1/2a-R，以84K楊cDNA為模板，利用高保真聚合酶Prime STAR HS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的基因PagMSBP1/2a后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。使用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/interactive)和TMHMM網(wǎng)站(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)MSBP1/2a蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。通過(guò)NCBI Blast(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和植物基因組網(wǎng)站(https:∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)對(duì)不同物種中MSBP1氨基酸序列進(jìn)行查找獲取。利用DNAMAN軟件對(duì)多物種MSBP1蛋白氨基酸序列比對(duì)分析，獲得保守結(jié)構(gòu)域。

表1 84K楊PagMSBP1/2基因克隆和定量PCR引物Tab.1 Primer sequences for 84K poplar PagMSBP1/2 cloning and qPCR analysis

1.5 載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

使用特異引物gw-PagMSBP1/2a-F和gw-PagMSBP1/2a-R，利用Gateway技術(shù)將PagMSBP1/2a基因連接至入門載體pDNOR207上，后分別連接至帶GFP熒光蛋白標(biāo)簽的載體pMDC43和過(guò)表達(dá)載體pMDC32，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并測(cè)序驗(yàn)證。將構(gòu)建好的35S∷GFP-PagMSBP1/2a轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜Marker SPAtWAK2-CFP-HDEL (cyan) (Zengetal., 2016)共同在野生型本氏煙草葉片下表皮細(xì)胞中表達(dá)，過(guò)夜暗培養(yǎng)后室溫培養(yǎng)3天取樣共聚焦顯微鏡觀察。將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)載體35S∷pMDC32-PagMSBP1/2a利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化84K楊(Zhouetal., 2019)，將篩選的轉(zhuǎn)基因植株提取RNA進(jìn)行qPCR分析，選擇表達(dá)量較高的2個(gè)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行試驗(yàn)。

1.6 組織切片染色及木質(zhì)素含量測(cè)定

每個(gè)株系各選3株在營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)9周的楊樹(shù)苗，觀察植株生長(zhǎng)的表型變化。取其基部節(jié)間約1 cm長(zhǎng)，用振動(dòng)式切片機(jī)(LEICA VT1 200 S)進(jìn)行切片，厚度40 μm，分別用0.05%的甲苯胺藍(lán)O(TBO)染液和1%間苯三酚-HCL染液染色，鏡檢觀察，拍照記錄。

取生長(zhǎng)5個(gè)月的PagMSBP1/2a過(guò)表達(dá)和對(duì)照84K楊莖部作為材料，樣品80 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過(guò)40目篩，稱取約5 mg(記為W)，采用乙酰溴法測(cè)定總木質(zhì)素含量(Barnesetal., 2017; Fosteretal., 2010)，參照科銘生物的木質(zhì)素含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，按照以下公式計(jì)算木質(zhì)素含量:

木質(zhì)素(mg·g-1干質(zhì)量)=((ΔA-0.006 8)×Vt×

10- 3×T)/(0.069 4×W)。

式中： ΔA為測(cè)定管OD280讀值-空白管OD280讀值；Vt為反應(yīng)總體積2.04 mL；T為稀釋倍數(shù)；W為樣本質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)MSBP基因的序列分析

以擬南芥MSBP1蛋白序列在毛果楊和84K楊基因組中進(jìn)行同源序列比對(duì)，分別得到MSBP同源基因。利用MEGA7軟件構(gòu)建楊樹(shù)和擬南芥MSBP基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖1A)，楊樹(shù)中MSBP成員根據(jù)進(jìn)化樹(shù)中兩物種間的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行命名，其中與AtMSBP1、AtMSBP2同源關(guān)系較近的基因有3個(gè)，分別命名為PtMSBP1/2a、PtMSBP1/2b和PtMSBP1/2c； 與AtMSBP3同源的基因有2個(gè)，分別命名為PtMSBP3a和PtMSBP3b； 與AtMSBP4同源的基因有2個(gè)，分別命名為PtMSBP4a和PtMSBP4b。84K楊中MSBP命名同理。同時(shí)利用GSDS2.0進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，構(gòu)建結(jié)構(gòu)圖(圖1B)。楊樹(shù)中MSBP1同源基因PtMSBP1/2a與PtMSBP1/2b長(zhǎng)度均為2 kb左右，而PtMSBP1/2c長(zhǎng)度不到1 kb，在基因結(jié)構(gòu)上3個(gè)基因都各包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，與擬南芥MSBP1基因結(jié)構(gòu)相比具有保守性，表明進(jìn)化歷程中結(jié)構(gòu)相對(duì)保守。

圖1 擬南芥與楊樹(shù)中MSBP基因分析Fig. 1 Phylogenetic tree and gene structure of MSBP from Arabidopsis and PopulusA.楊樹(shù)MSBP與擬南芥同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 B.擬南芥與楊樹(shù)MSBP基因結(jié)構(gòu)分析。Pt:毛果楊； At： 擬南芥； Pag: 84K。A. Phylogenetic tree analysis of homologous proteins of Populus and Arabidopsis. B. Structural analysis of MSBP genes in Arabidopsis and Populus. Pt: Populus trichocarpa; At: Arabidopsis thaliana； Pag: 84K.

圖2 PtMSBP1/2基因表達(dá)分析Fig. 2 Tissue-specific expression analysis of PtMSBP1/2A. qPCR分析PagMSBP1/2a、PagMSBP1/2b和PagMSBP1/2c基因在84K楊樹(shù)頂芽、葉、幼莖、老莖和根中的表達(dá); B.楊樹(shù)PtMSBP1/2a、PtMSBP1/2b和PtMSBP1/2c基因在韌皮部、形成層及木質(zhì)部中的表達(dá)。A. qPCR analysis of the expression of PagMSBP1/2a, PagMSBP1/2b and PagMSBP1/2c genes in 84K poplar top buds, leaves, young stems, old stems, and roots; B. Analysis of PtMSBP1/2a, PtMSBP1/2b PtMSBP1/2c gene in phloem, cambium and xylem expression.

圖3 PagMSBP1/2a序列結(jié)構(gòu)分析Fig. 3 The sequence analysis of PagMSBP1/2aA. 6種植物同源MSBP1蛋白氨基酸序列比對(duì)，下劃線代表Cyt-b5保守結(jié)構(gòu)域； B.PagMSBP1/2a蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)； C. PagMSBP1/2a氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),峰值即代表跨膜結(jié)構(gòu)域。A. Alignment of the amino acid sequence of MSBP1 protein with homologous genes of other species, the underline represents the Cyt-b5 conserved domain; B. PagMSBP1/2a protein tertiary structure prediction; C. The transmembrane domain prediction of PagMSBP1/2a amino acid sequence, the peak value represents the transmembrane domain.

圖4 PagMSBP1/2a亞細(xì)胞定位分析Fig. 4 Subcellular localization of PagMSBP1/2aA. GFP-PagMSBP1/2a亞細(xì)胞定位載體圖; B.熒光共聚焦表明PagMSBP1/2a定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。A. PagMSBP1/2a subcellular localization vector map; B. GFP-PagMSBP1/2a localized on the endoplasmic reticulum by fluorescence confocal microscope tracking.

2.2 楊樹(shù)MSBP基因組織表達(dá)分析

取土培6個(gè)月的84K楊的頂芽、葉、嫩莖、老莖和根提取RNA，qPCR分析PagMSBP1/2a、PagMSBP1/2b和PagMSBP1/2c基因表達(dá)情況，結(jié)果表明，3個(gè)基因在頂芽、葉、莖和根中均有表達(dá)，其中PagMSBP1/2c在各組織的表達(dá)量相對(duì)較低。PagMSBP1/2a在老莖表達(dá)量最高，為表達(dá)量最低的幼莖中的6倍，另外，PagMSBP1/2a在莖中的表達(dá)顯著高于其他2個(gè)基因(圖2A)。參考AspWood數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥aspwood.popgenie.org)對(duì)3個(gè)基因在韌皮部、形成層及木質(zhì)部中的表達(dá)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)楊樹(shù)MSBP1的3個(gè)成員均在成熟木質(zhì)部表現(xiàn)出高表達(dá)，同時(shí)根據(jù)相對(duì)表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)PtMSBP1/2a在木質(zhì)部與韌皮部中的表達(dá)相對(duì)較高(圖2B)。為此，本研究選擇PagMSBP1/2a基因深入研究其在楊樹(shù)木材形成中的調(diào)控作用。

2.3 PagMSBP1/2a基因克隆及序列分析

對(duì)84K楊中克隆出的PagMSBP1/2a基因分析發(fā)現(xiàn)，PagMSBP1/2a包含一個(gè)全長(zhǎng)648 bp 的CDS，編碼215個(gè)氨基酸，由2個(gè)外顯子組成，分子量為2.33 kDa，理論等電點(diǎn)(PI)為4.53。利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)表明，PagMSBP1/2a蛋白序列與毛果楊、擬南芥、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和番茄(Solanumlycopersicum)5種植物的MSBP1蛋白序列相似度較高，一些區(qū)域存在明顯的保守序列。MSBP蛋白在單子葉和雙子葉植物中具有一定保守性，且都有Cyt-b5結(jié)構(gòu)域(圖3A)。應(yīng)用ExPAsy提供的SWISS-MODEL 對(duì)PagMSBP1/2a蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，以人類膜相關(guān)孕激素受體組分1(PGRMC1)蛋白(4x8y.1.A)為模板，同源建模PagMSBP1/2a蛋白的完整氨基酸序列，預(yù)測(cè)所得模型見(jiàn)圖3B，分析表明此蛋白具有類固醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)α+β混合結(jié)構(gòu)，2對(duì)α-螺旋在β-折疊的一側(cè)形成三明治口袋結(jié)構(gòu)。采用TMHMM網(wǎng)站對(duì)MSBP1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，PagMSBP1/2a在N端第22～44位氨基酸形成跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3C)。

2.4 亞細(xì)胞定位分析

將35S∷GFP-PagMSBP1/2a重組載體在煙草表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，分析其在細(xì)胞中的定位。結(jié)果表明，在注射含有35S∷GFP-PagMSBP1/2a過(guò)表達(dá)載體農(nóng)桿菌的本氏煙草葉片表皮細(xì)胞中，在488 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光下使用共聚焦熒光顯微鏡觀察到的GFP熒光信號(hào)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Marker重合，表明PagMSBP1/2a蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖4)。

2.5 PagMSBP1/2a過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

為深入研究PagMSBP1/2a基因?qū)顦?shù)生長(zhǎng)發(fā)育的作用，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了35 S∷35S∷PagMSBP1/2a表達(dá)載體(圖5A)，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化楊樹(shù)，獲得了過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系(PagMSBP1/2a-OE)。通過(guò)PCR鑒定和qPCR檢測(cè)表達(dá)情況后，獲得PagMSBP1/2a過(guò)量表達(dá)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗。選取2個(gè)表達(dá)量較高的株系#24、#33進(jìn)行試驗(yàn)(圖5C)。生長(zhǎng)9周的過(guò)表達(dá)PagMSBP1/2a楊樹(shù)株高生長(zhǎng)明顯低于對(duì)照(圖5B)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)PagMSBP1/2a楊樹(shù)2個(gè)株系株高分別比對(duì)照株高減少21%、5%。

圖5 PagMSBP1/2a過(guò)表達(dá)載體圖譜及轉(zhuǎn)基因植株Fig. 5 PagMSBP1/2a overexpressed vector and transgenic PopulusA.PagMSBP1/2a過(guò)表達(dá)載體圖 B. PagMSBP1/2a過(guò)表達(dá)植株表型C.選定的過(guò)表達(dá)植株P(guān)agMSBP1/2a基因的相對(duì)表達(dá)量。A. Vector of PagMSBP1/2a overexpression. B. Phenotype of PagMSBP1/2a overexpressed Populus C. Relative expression of PagMSBP1/2a gene in selected overexpressed plants.

2.6 過(guò)表達(dá)PagMSBP1/2a對(duì)木質(zhì)素合成的影響

MSBP1是調(diào)控木質(zhì)素合成過(guò)程的重要支架蛋白，為研究PagMSBP1/2a基因在木質(zhì)素合成中發(fā)揮的作用，對(duì)PagMSBP1/2a過(guò)表達(dá)株系#24和#33進(jìn)一步解剖分析。觀察莖橫切面染色情況，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PagMSBP1/2a楊樹(shù)比對(duì)照組間苯三酚-HCL染色淺，說(shuō)明其木質(zhì)素的含量有所降低。利用乙酰溴法測(cè)定木質(zhì)素含量，在過(guò)表達(dá)PagMSBP1/2a株系#24和#33中，木質(zhì)素含量與對(duì)照組相比分別減少34.6%、26.5%。

圖6 過(guò)表達(dá)PagMSBP1/2a 影響木質(zhì)素合成Fig. 6 PagMSBP1/2a affects lignin biosynthesis比例尺Scale bar in A-C is 200 μm; and in D-E is 80 μm.； C： 第7節(jié)間橫切片甲苯胺藍(lán)O染色(A： 對(duì)照植株，B-C： 轉(zhuǎn)基因株系#24、#33)； D-F： 第7節(jié)間橫切片間苯三酚-HCL染色(D： 對(duì)照植株，E-F： 轉(zhuǎn)基因株系#24、#33)； G.乙酰溴法測(cè)定木質(zhì)素含量。t檢驗(yàn)P值用星號(hào)表示，***表示差異極顯著(P<0.01)。A-C. 7th internode transverse section stained with TBO (A, control plants; B, C, transgenic plants #24, #33, respectively); D-F. 7th internode transverse section phloroglucinol-HCL staining (D, control plants; E, F, transgenic plants #24, #33, respectively); G. Acetyl bromide method to determine the content of lignin. The P value of t test is indicated by stars,*** indicate extremely significant difference (P<0.01).

3 討論

木材形成是一個(gè)極為精細(xì)的過(guò)程，對(duì)于次生壁的合成機(jī)制已進(jìn)行大量研究工作，目前木質(zhì)素的生物合成及調(diào)控通路解析取得較大進(jìn)展(Shietal., 2010)。最近表明，MSBP1作為動(dòng)物膜相關(guān)孕激素受體PGRMC1(Falkensteinetal., 1996)同源基因在木質(zhì)素合成中有重要作用(Shietal., 2011; Gouetal., 2018)。本研究對(duì)MSBP在楊樹(shù)中的7個(gè)成員進(jìn)行分析，包括進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)及其在楊樹(shù)組織中的表達(dá)等。分析發(fā)現(xiàn)，楊樹(shù)中MSBP蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，均具有Cyt-b5保守結(jié)構(gòu)域(Mifsudetal., 2002)，推測(cè)MSBP在功能上可能具有高度保守性。

結(jié)合組織定量分析以及AspWood在線分析表明，MSBP1/2a基因在成熟莖段的木質(zhì)部表達(dá)水平高(圖2)。擬南芥MSBP1以前被認(rèn)定為質(zhì)膜蛋白，可作為類固醇/BR激素信號(hào)成分負(fù)調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)(Yangetal., 2005)，后來(lái)熒光蛋白GFP介導(dǎo)的亞細(xì)胞定位研究表明，MSBP1主要是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白(Gouetal., 2018)，本研究的PagMSBP1/2a亞細(xì)胞定位也證實(shí)了這一觀點(diǎn)(圖4)。MSBP1/2a的表達(dá)模式和定位分析表明MSBP1可能對(duì)莖的生長(zhǎng)發(fā)育有影響，因此本文對(duì)84K楊中在木質(zhì)部組織高表達(dá)的PagMSBP1/2a進(jìn)行深入研究。

NST是NAC家族中參與調(diào)節(jié)次生壁加厚 (Mitsudaetal., 2007) 的重要轉(zhuǎn)錄因子，有研究證明在nst-1突變體中MSBP基因的表達(dá)降低了50%左右 (Gouetal., 2018)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在楊樹(shù)的發(fā)育木質(zhì)部中MSBP同源基因表達(dá)水平較高 (Baoetal., 2013)，這證明MSBP1和MSBP2與次生細(xì)胞壁合成和木質(zhì)素的形成相關(guān)。在擬南芥突變體msbp1進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，抑制MSBP2表達(dá)會(huì)致使C4H、C3′H和F5H蛋白水平的大幅下降以及C4H酶催化活性的降低，使植株呈現(xiàn)木質(zhì)化程度低的表型(Gouetal., 2018)。采用間苯三酚-HCL對(duì)6周大的擬南芥基莖測(cè)定維管束和束間纖維的染色強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，雙基因敲除系與野生型msbp2-1相比明顯較弱，表明雙基因敲除植株維管中木質(zhì)素總量降低(Gouetal., 2018)。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)楊樹(shù)PagMSBP1/2a基因，乙酰溴法測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株成熟莖段的木質(zhì)素含量，PagMSBP1/2a過(guò)表達(dá)植株中的木質(zhì)素含量明顯低于對(duì)照植株(圖6G)。本研究中過(guò)表達(dá)MSBP1導(dǎo)致木質(zhì)素含量降低的結(jié)論，與已報(bào)道的減少M(fèi)SBP1表達(dá)會(huì)降低木質(zhì)素含量相矛盾。原因可能是植物在調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成途徑中對(duì)MSBP1蛋白具有嚴(yán)苛的要求。MSBP1做為支架蛋白連接P450酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成蛋白復(fù)合體，維持酶的活性和穩(wěn)定性，MSBP1蛋白的增多極有可能打破了復(fù)合體的調(diào)控平衡，導(dǎo)致3個(gè)P450酶的排列及功能發(fā)生變化，從而直接影響復(fù)合體催化木質(zhì)素的形成。有研究稱在苜蓿中C3′H、C4H表達(dá)下降的植株中乙酰溴化木質(zhì)素含量降低，而F5H表達(dá)降低不影響總含量。C4H、F5H的降低都提高了木質(zhì)素G單體的比例，并且F5H的降低還增加了硫代酸解木質(zhì)素的含量(Reddyetal., 2005; Stewartetal., 2009)。說(shuō)明C3′H、C4H、F5H在木質(zhì)素合成途徑中存在精密的調(diào)控平衡中，MSBP作為木質(zhì)素合成的關(guān)鍵調(diào)控因子，與相關(guān)酶的互作關(guān)系直接影響其調(diào)控作用的發(fā)揮，且PagMSBP1/2a與其他成員之間是否存在相互作用也有待進(jìn)一步研究。本研究表明了該基因過(guò)量表達(dá)可以降低木質(zhì)素的含量，但植株生長(zhǎng)受到了較大影響。因此若采用該基因啟動(dòng)子進(jìn)行木質(zhì)部細(xì)胞特異表達(dá)，則可能實(shí)現(xiàn)PagMSBP1/2成員對(duì)木質(zhì)素合成過(guò)程的精準(zhǔn)調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究克隆了84K楊PagMSBP1/2a基因，預(yù)測(cè)其編碼膜蛋白，與其定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相一致。PagMSBP1/2a基因在成熟莖中表達(dá)量較高，尤其在木質(zhì)部發(fā)育中表達(dá)量最高。通過(guò)高表達(dá)PagMSBP1/2a證明了其參與木質(zhì)部發(fā)育過(guò)程，導(dǎo)致植株矮化，木質(zhì)素含量減少。PagMSBP1/2a在木材形成過(guò)程中的調(diào)控作用，可以作為靶基因進(jìn)行分子育種，調(diào)控木質(zhì)素的含量。