韓 偉，陳煉茹，鄭丹婷，卜原玲，姚澤遠(yuǎn)

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 a.制藥工程與過程化學(xué)教育部工程研究中心;b.上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

靈芝是一種具有很高營養(yǎng)和藥用價(jià)值的食用真菌.大量研究表明，靈芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharide，GLP)作為靈芝的主要有效成分，顯示了較強(qiáng)的抗氧化活性[1]，可用于預(yù)防和治療糖尿病、心臟病、癌癥、視網(wǎng)膜損傷、白內(nèi)障、帕金森氏病、阿爾茲海默氏病、免疫功能受損等疾病[2-4].其具有抗自由基的作用，可延緩衰老并應(yīng)用于化妝品中[5].相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，提取方法、多糖濃度、相對分子質(zhì)量等因素均可能影響靈芝多糖的抗氧化活性[6-8].

入藥的靈芝品種大多是赤芝，本文選取代表性的赤芝品種滬農(nóng)靈芝、龍芝2號為研究材料，采用水提、堿提及乙醇分級沉淀的方法得到了不同相對分子質(zhì)量的多糖組分.同時(shí)，利用普魯士藍(lán)法、羥自由基清除模型、DPPH自由基清除模型對各多糖進(jìn)行抗氧化活性評價(jià)，為靈芝多糖的深入研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

滬農(nóng)靈芝子實(shí)體、龍芝2號子實(shí)體，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌所提供.

體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、無水乙醇，上海沃化化工有限公司；氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、三氯乙酸、水楊酸、30%過氧化氫，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)、葡聚糖凝膠G-100，上海源葉生物科技有限公司；DEAE-纖維素52，上海笛柏生物科技有限公司.以上試劑均為分析純.

SB-2000水浴鍋、N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；ER-692型微波爐，中國電子器件工業(yè)總公司；H1650-W離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV1900PC紫外可見分光光度計(jì)，上海亞研電子科技有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2414示差折光檢測器，美國Waters公司；Wyatt HELEOS8激光光散射儀，美國Wyatt公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝水溶性多糖的制備

取靈芝子實(shí)體，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇脫脂3 h，抽濾，樣品干燥至質(zhì)量不變后加入去離子水進(jìn)行多糖的微波輔助提取，控制微波功率325 W，料液比1∶35(g/mL)，提取時(shí)間24 min.提取完成后抽濾，分別收集濾液和濾渣，濾液減壓濃縮，隨后加入4倍體積的95%乙醇，于4 ℃的冰箱中靜置過夜.離心，沉淀用少量水溶解，真空冷凍干燥，得到靈芝水溶性多糖.

取靈芝水溶性多糖，復(fù)溶后加體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇至體積分?jǐn)?shù)為30%，置于4 ℃的冰箱中沉淀過夜，離心5 min(10 000 r/min)，沉淀冷凍干燥，得GLPa.離心后的上清液旋蒸除去乙醇，加體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇至體積分?jǐn)?shù)為50%，置于4 ℃的冰箱中沉淀過夜，離心5 min(10 000 r/min)，沉淀冷凍干燥，得GLPb.同法，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)得到GLPc.

1.2.2 靈芝堿溶性多糖的制備

取微波提取后的濾渣，干燥至質(zhì)量不變后，料液比1∶35(g/mL)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.4%的NaOH溶液，40 ℃熱水浴浸提75 min.抽濾，濾液減壓濃縮，調(diào)節(jié)pH至7左右，隨后加入4倍體積95%乙醇，于4 ℃的冰箱中靜置過夜.離心，沉淀用少量水溶解，真空冷凍干燥，得到靈芝堿溶性粗多糖，分別上DEAE-纖維素柱、Sephadex G-100層析柱，進(jìn)一步分離后得到靈芝堿溶性多糖GLPj.

1.2.3 靈芝多糖的相對分子質(zhì)量測定

采用高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光散色儀-示差折光檢測儀聯(lián)用分析法[9-10](HPSEC-MALLS-RI System)進(jìn)行靈芝多糖的相對分子質(zhì)量測定.

靈芝多糖供試液的制備：稱取5.0 mg靈芝多糖，用流動相配制成質(zhì)量濃度5 mg/mL的靈芝多糖供試液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待用.

色譜條件：Waters 2695高效液相色譜儀及Waters 2414示差折光檢測器；OHpak系列SB-806 HQ和SB-804 HQ色譜柱(8.0 mm×300 mm，TOSOH)；進(jìn)樣量100 μL；流動相，去離子水；流速0.500 mL/min；柱溫35 ℃；激光散射儀波長663.1 nm；折光指數(shù)增量(dn/dc)0.146 mL/g.

數(shù)據(jù)采集分析：使用Astra(version 6.1.1，Wyatt Technology)數(shù)據(jù)分析軟件對光散射數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析.樣品的色譜峰數(shù)目和形狀可以反映其純度，在HPSEC圖譜中的保留時(shí)間與多糖樣品的相對分子質(zhì)量具有函數(shù)關(guān)系[11].

1.2.4 靈芝多糖的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

多糖樣品溶液配制：稱取0.050 g多糖樣品，溶于25 mL去離子水，得2 mg/mL多糖溶液.將2 mg/mL多糖溶液按3∶1加去離子水稀釋，得到1.5 mg/mL多糖溶液.同理，制得1、0.5、0.25 mg/mL多糖樣品溶液.

1)多糖總還原力

磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)配制：稱取3.12 g磷酸二氫鈉，加去離子水定容到100 mL，為A液.稱取7.16 g磷酸氫二鈉，加去離子水定容到100 mL，為B液.量取A液62.5 mL，B液37.5 mL，混合.

取5個(gè)質(zhì)量濃度的多糖樣品液各1.0 mL分別置于試管中，每管加入2.5 mL磷酸緩沖液和1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀，混勻.將各試管轉(zhuǎn)移至水浴鍋中，50 ℃反應(yīng)20 min.冷卻至室溫后，往各管中滴加2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液.混合液轉(zhuǎn)入離心管，于3 000 r/min離心10 min.分別取2.5 mL上清液置于新試管中，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氯化鐵溶液，搖勻，室溫下靜置10 min，在700 nm處測量吸光度.設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，取均值.

2)羥基自由基清除能力

取5個(gè)質(zhì)量濃度的多糖樣品液各1.0 mL分別置于試管中，每管中加入4 mmol/L硫酸亞鐵溶液、4 mmol/L H2O2溶液、4 mmol/L水楊酸無水乙醇溶液各1.0 mL，混勻，37 ℃避光反應(yīng)30 min.反應(yīng)完成后，轉(zhuǎn)入離心管，于8 000 r/min離心5 min.分別吸取上清液，測量并記錄510 nm處的吸光度值(Ai).按以上步驟，將水楊酸無水乙醇溶液換成同等體積的無水乙醇進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，將測得的吸光值記為Aj.用去離子水替換多糖溶液，測得的吸光值記為A0.設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，取均值.

羥自由基清除率=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100%.

(1)

3)DPPH自由基清除活性

取5個(gè)質(zhì)量濃度的多糖樣品液各2.0 mL分別置于試管中，每管中加入2.0 mL的 0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液，混勻.將各試管轉(zhuǎn)移至黑暗環(huán)境，反應(yīng)30 min.隨后測量517 nm處的吸光值(Ai).按以上步驟，將 DPPH無水乙醇溶液換成同等體積的無水乙醇進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，記錄吸光值(Aj).用去離子水替換多糖溶液，記錄相應(yīng)的吸光值(A0).設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，取均值.

DPPH自由基清除率=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100%.

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝多糖的純度

實(shí)驗(yàn)所得靈芝的水溶性多糖為淺黃色粉末，堿溶性多糖為黃棕色粉末，均可溶于水，不溶于乙醇，能產(chǎn)生苯酚-硫酸顯色反應(yīng).

2.1.1 多糖的高效液相色譜圖

各多糖組分經(jīng)高效液相色譜檢測，示差檢測器(RI)信號峰為單一強(qiáng)峰，臨近結(jié)束時(shí)出現(xiàn)一個(gè)弱峰，證明多糖純度較高.圖1顯示，經(jīng)不同方法提取、不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀得到的靈芝多糖的出峰位置和峰面積均存在差異，表明水溶性多糖GLPa和GLPb、GLPc和堿溶性多糖GLPj含有不同種類的組分，且含量各不相同，從GLPa到GLPb、GLPc、GLPj含量逐漸減小.

圖1 滬農(nóng)靈芝和龍芝2號多糖的高效液相色譜圖

2.1.2 多糖的紫外吸收譜圖

各靈芝多糖樣品的紫外吸收如圖2所示.由圖2可以看出，各靈芝多糖樣品均顯示單一對稱吸收峰，證明其中不含核酸和蛋白質(zhì)，或含量極低不足以形成特征峰.

圖2 靈芝多糖的紫外吸收譜圖

2.2 靈芝多糖的相對分子質(zhì)量

利用HPSEC-MALLS-RI技術(shù)對靈芝多糖的相對分子質(zhì)量進(jìn)行分析.以普魯蘭多糖(P-50，相對分子質(zhì)量4.88×104)為標(biāo)準(zhǔn)品，對各個(gè)角度的激光進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算多糖相對分子質(zhì)量[11].各多糖組分的平均分子相對質(zhì)量見表1.

表1 各組分多糖的相對分子質(zhì)量

由表1可知，低體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀法可得到大分子多糖，滬農(nóng)靈芝、龍芝2號的30%醇沉多糖的平均相對分子質(zhì)量均為百萬級.隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，沉淀得到的多糖相對分子質(zhì)量減小，滬農(nóng)靈芝、龍芝2號的50%、80%醇沉多糖的平均相對分子質(zhì)量均為1×105級.以稀NaOH為溶劑從靈芝水提殘?jiān)刑崛〉玫降膲A溶性多糖相對分子質(zhì)量最低，小于1×104級.

2.3 靈芝多糖的抗氧化活性

2.3.1 多糖總還原力

通常情況下，物質(zhì)的抗氧化活性與還原能力呈正相關(guān)關(guān)系[12].具有良好的還原能力的物質(zhì)往往能提供電子，與活性氧基團(tuán)反應(yīng)，從而起到清除自由基的效果.其還原產(chǎn)物能與三價(jià)鐵離子作用，生成普魯士藍(lán)絡(luò)合物，在700 nm處有最大吸收峰.利用此性質(zhì)，可根據(jù)反應(yīng)液在700 nm處的吸收值推斷原樣品還原能力的強(qiáng)弱.滬農(nóng)靈芝、龍芝2號各多糖組分的還原力見圖3.

圖3表明，各多糖樣品的還原能力隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增加，但龍芝2號GLPj在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)下無顯著差異，且其還原能力明顯較弱.在所有測試濃度，2種靈芝的30%醇沉水溶性多糖GLPa均具有較強(qiáng)的還原力.

圖3 靈芝多糖的還原力

提取方式、相對分子質(zhì)量等差異都可能對靈芝多糖的還原力強(qiáng)弱帶來影響.本實(shí)驗(yàn)中，對滬農(nóng)靈芝來說，多糖的還原力大小順序?yàn)椋篏LPa>GLPc>GLPb>GLPj，對龍芝2號來說，多糖的還原力大小順序?yàn)椋篏LPa≈GLPc>GLPb>GLPj.可見，水溶性多糖比堿溶性多糖具有更好的還原力，且低體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀得到的大分子多糖比小分子多糖有更好的還原力.

2.3.2 羥基自由基清除能力

羥基自由基是一種高活性的自由基，具有極大的生物毒性.清除羥基自由基對人體健康有著非常重要的作用[13].滬農(nóng)靈芝、龍芝2號各多糖組分對羥自由基的清除能力如圖4所示.由圖4可知，各靈芝多糖對羥基自由基均有一定的清除作用，且隨著質(zhì)量濃度的增大，清除率越來越大.30%、80%醇沉水溶性多糖的清除作用較好，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，30%和80%醇沉水溶性多糖的羥自由基清除率最高到達(dá)40%～50%.2種靈芝的50%醇沉水溶性多糖清除作用相當(dāng)，最大值在30%上下.堿溶性多糖清除羥基自由基的能力相對較弱，最大實(shí)驗(yàn)濃度下的清除率小于20%.

圖4 靈芝多糖清除羥自由基的能力

2.3.3 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的質(zhì)子自由基.良好的抗氧化劑能提供電子，與DPPH自由基配對，形成穩(wěn)定分子，使得溶液在517 nm處的吸光度降低[14-16].吸光值變化的程度與自由基清除程度呈正相關(guān).

滬農(nóng)靈芝、龍芝2號各多糖組分的DPPH自由基清除能力見圖5.由圖5可看出，2種靈芝的多糖GLPa、GLPb、GLPc、GLPj均對DPPH自由基具有一定的清除能力，且隨著多糖濃度的增加，清除能力亦增加.在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，靈芝水溶性多糖組分均具有較強(qiáng)的還原力，DPPH自由基清除率最高可達(dá)70%～80%左右，能夠?qū)⑷芤哼€原成黃色，表明清除能力顯著.而堿溶性多糖的DPPH自由基最大清除率約為30%，其還原能力明顯較弱.

圖5 靈芝多糖的DPPH自由基清除能力

3 結(jié)語

本研究以滬農(nóng)靈芝和龍芝2號的子實(shí)體為原材料，制得了不同質(zhì)量濃度的水溶性多糖和堿溶性多糖，并檢測了各多糖的體外抗氧化的能力.結(jié)果表明，各多糖均具有一定的還原力、羥基自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，各活性也有所增強(qiáng)，呈濃度依賴性，這說明2個(gè)赤芝品種的子實(shí)體具有一定的抗氧化活性.結(jié)合靈芝多糖的提取方法、相對分子質(zhì)量分析，微波輔助法得到的水溶性多糖具有較大相對分子質(zhì)量，GLPa的相對分子質(zhì)量達(dá)百萬級，GLPb和GLPc的相對分子質(zhì)量均在十萬級，而堿提法得到的堿溶性多糖GLPj相對分子質(zhì)量小于1萬，實(shí)驗(yàn)中各水溶性多糖普遍比堿溶性多糖表現(xiàn)出更好的抗氧化活性，可能與提取方法及順序有關(guān).其中，GLPa抗氧化活性較其他多糖為最強(qiáng)，推測抗氧化活性可能與相對分子質(zhì)量呈正相關(guān).

靈芝多糖一直是靈芝研究的重點(diǎn).除了提取方式、相對分子質(zhì)量之外，靈芝多糖的組成結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象等都可能是影響多糖抗氧化活性的因素，因此，有必要進(jìn)一步研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異及構(gòu)效關(guān)系，為靈芝中活性物質(zhì)的精確利用提供研究基礎(chǔ).