閆 艷，杜晨暉

（1.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心 太原 030006；2.山西大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室 太原 030006；3.地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點實驗室 太原 030006；4.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院 太原 030619）

中藥質(zhì)量控制和評價是制約中藥現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵問題之一，也是中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的難點和熱點[1]。中藥多成分、多靶點的復(fù)雜性特點，決定了以1-2種活性成分或指標成分進行質(zhì)量評價的模式已不能滿足中藥質(zhì)量控制的要求。隨著中藥分析技術(shù)的快速發(fā)展，中藥質(zhì)量控制和評價模式逐步由無指標、單指標、向多指標成分過渡。然而，現(xiàn)有技術(shù)條件下無法獲得足夠量的高純度中藥化學(xué)成分對照品，已經(jīng)成為制約中藥多成分質(zhì)量控制模式發(fā)展的重要瓶頸。

基于中藥有效成分多為一類或幾類同系物組成，同類成分間可能存在內(nèi)在關(guān)系和規(guī)律性。2006年王智民課題組首次提出將“一測多評”（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）法用于中藥多成分質(zhì)量評價，解決了由于對照品缺乏而限制多指標質(zhì)控技術(shù)推廣的問題[2-3]。2010年版《中國藥典》首次收錄QAMS法用于黃連的質(zhì)量評價[4]，代表該方法正式用于中藥質(zhì)量控制國家標準。2015年版《中國藥典》新增了丹參、生姜和銀杏等8個中藥的QAMS法質(zhì)量標準[5]。2020年版《中國藥典》中應(yīng)用QAMS法進行質(zhì)量控制的中藥達到15個[6]。此外，QAMS法也受到國際天然藥物質(zhì)控研究領(lǐng)域的不斷關(guān)注，如《美國藥典》38版中共收錄90個植物藥的質(zhì)量標準應(yīng)用了QAMS法；《歐洲藥典》8.0版由9個植物藥標準增加至23個應(yīng)用QAMS法[3]。毋容置疑，QAMS法為構(gòu)建與完善中藥多成分含量測定標準體系提供了新的方法與策略。

近年來，已有多名學(xué)者對QAMS法在中藥質(zhì)量控制中應(yīng)用情況進行了總結(jié)，如王智民等對QAMS法在中藥材、中藥飲片和中成藥質(zhì)量評價中的應(yīng)用情況進行了總結(jié)[7]；蔡寶昌等總結(jié)了QAMS法中色譜峰定位和校正因子的計算方法[8]；李萍等重點總結(jié)了QAMS法在皂苷、醌類和黃酮類等不同類型中藥化學(xué)成分中的應(yīng)用情況[9]。本文將從影響一測多評法的關(guān)鍵因素、相對校正因子的分類，及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜（gas chromatography，GC）和HPLC串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS）等不同分析技術(shù)在中藥QAMS質(zhì)量控制研究領(lǐng)域中的應(yīng)用和特點進行總結(jié)與展望。

1 一測多評法概述

1.1 一測多評法的概念

QAMS是指在多指標質(zhì)量評價時，以藥材中某一成分（有對照品供應(yīng)者）為內(nèi)標，建立該成分與其它成分之間的相對校正因子（Relative correction factor,RCF），也叫轉(zhuǎn)換因子（conversion factor）[10]。通過該校正因子計算其它成分的含量。在一定范圍（線性范圍）內(nèi)成分的量（質(zhì)量或濃度）與檢測器響應(yīng)成正比，即W=fA可得響應(yīng)因子f=W/A。在多指標成分質(zhì)量評價時，以藥材中某一典型組分（有對照品供應(yīng)者）為內(nèi)標，建立該組分與其它組分之間的RCF，通過校正因子計算其他組分含量。

（s為內(nèi)參物，i為其他組分）fsi為內(nèi)參物s對待測成分i的RCF。

式中Ai為供試品中待測成分i的峰面積，Ci為供試品中待測成分i的濃度，As為供試品中內(nèi)參物s的峰面積，Cs為供試品中內(nèi)參物s的濃度。

1.2 RCF的分類

RCF是QAMS的關(guān)鍵參數(shù)，直接影響到QAMS法的定量準確度?；谧贤鈾z測器為一定線性范圍內(nèi)成分的量（質(zhì)量或濃度）與響應(yīng)值成正比的原理。通常將RCF分為兩種類型：第一種類型為將RCF的值設(shè)為1，第二種類型為將內(nèi)標物和待測物的響應(yīng)值比值的平均值或者斜率比值作為RCF。

1.2.1 第一種類型

當(dāng)將RCF的值設(shè)為1時，此法僅適用于被分析物質(zhì)具有高度相近的摩爾吸收系數(shù)或者分子質(zhì)量。由于測定的結(jié)果均為近似值，與真實值存在偏差，該方法的應(yīng)用受到限制。美國藥典（USP）33卷中貓爪草的質(zhì)量評價即采用了將RCF設(shè)為1的方法。

1.2.2 第二種類型

在同一吸收波長下，結(jié)構(gòu)相近且具有不同發(fā)色團被分析物的摩爾吸收系數(shù)（ε）不同。斜率比值法是以內(nèi)參物標準曲線與待測物標準曲線斜率的比值作為RCF，也稱初始轉(zhuǎn)換因子（original conversion factors，OCFs）[11]。此法要求標準曲線截距盡可能小的情況下才能保證計算的準確性。屠鵬飛教授課題組采用斜率比值法以大黃素為內(nèi)參物，在280 nm波長下，分別計算了大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、番瀉苷A和番瀉苷B的RCF為0.9518、0.8543、0.7545、0.0759、0.1536和0.1659。其中大黃素和蘆薈大黃素的RCF比值可達為1:0.0759[12]。平均值法是通過計算不同濃度或不同進樣體積下內(nèi)標物和待測物的響應(yīng)比值的平均值作為RCF。此法中RCF容易受到待測物濃度波動的影響。為此，蔡少青教授課題組在平均法計算RCF的基礎(chǔ)上，提出了線性回歸方法計算RCF，并已成功應(yīng)用于三七中皂苷類成分的測定[13]。

1.3 一測多評法的關(guān)鍵影響因素

在QAMS的質(zhì)量評價中，RCF常受到不同的色譜儀器系統(tǒng)、填料和色譜柱類型、吸收波長、流動相和柱溫等因素的影響。

1.3.1 色譜柱和檢測器對RCF的影響

色譜柱的選擇是影響RCF值的重要因素。屠鵬飛教授課題組建立了以小檗堿為參照物，同時測定功勞木中非洲防己堿、藥根堿、巴馬汀和小檗堿含量的方法。比較了6種色譜柱對RCF的影響，結(jié)果表明Agilent Zorbax SB-Aq C18（250 mm×4.6 mm I.D.,5μm）效果最佳[14]。李萍教授課題組[15]建立了虎杖中的幾種蒽醌類成分的QAMS法，考察了紫外可見光檢測器（ultraviolet visible detector,UV）、可變波長檢測器（Variable Wavelength detector，VWD）和光電二級管陣列檢測器（diode-array detector，DAD；Photo-Diode Array，PDA）三種檢測器在相同吸收波長對RCF的影響，結(jié)果表明選用VWD檢測器確定各波長對RCF的影響最小，且穩(wěn)定性好。

1.3.2 檢測波長、柱溫及流動相對RCF的影響

流動相中酸的濃度、流速、柱溫和進樣體積等因素均會導(dǎo)致RCF偏差。Dong等[16]采用QAMS法同時測定肉蓯蓉和管花肉蓯蓉7種糖苷類成分時，與290 nm和219 nm相比，333 nm檢測波長下，7種糖苷類成分相應(yīng)高，且受干擾小。李清課題組[14]采用QAMS法測定魚腥草中咖啡酸和蘆丁等8種成分時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)柱溫保持在20℃，流速設(shè)定為1.0 min·mL-1，進樣體積為10 μL時，對RCF的影響最小。屠鵬飛教授課題組[11]建立了同時測定功勞木中4種生物堿含量的QAMS法，當(dāng)選用0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液的水（A）和乙腈（B）為流動相時對RCF的影響最小。

2 現(xiàn)代分析技術(shù)在QAMS中的應(yīng)用

以“一測多評”或“QAMS”為關(guān)鍵詞，在中國知網(wǎng)（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）和PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行檢索，統(tǒng)計了2015年至2020年 發(fā)表 的應(yīng)用HPLC、GC和HPLC-MS技術(shù)在中藥材、中成藥及中藥提取物QAMS質(zhì)量評價中的應(yīng)用情況。如圖1所示，QAMS法結(jié)合不同技術(shù)的應(yīng)用基本保持在每年40-60篇的平穩(wěn)發(fā)展趨勢，獲得了中醫(yī)藥行業(yè)的認可。

圖1 QAMS法結(jié)合現(xiàn)代分析技術(shù)的應(yīng)用

2.1 高效液相色譜-紫外檢測器聯(lián)用技術(shù)

HPLC法具有適用性廣、兼具分離、分析功能，且快速、高效及靈敏的優(yōu)點。近年來，在中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域，HPLC已成為中藥材、中藥提取物及中成藥含量測定的首選手段。其中紫外檢測器如DAD或PDA、UV和VWD等均在中藥多成分含量測定中廣泛應(yīng)用。

由表1可知，HPLC-DAD法已廣泛應(yīng)用于中藥材、中藥提取物以及中藥制劑中同種類型多組分含量的同時測定。內(nèi)標物的選擇上，有三種方式。第一種為選擇1種內(nèi)標測定同類型化合物，如表1中以丹參酮IIA為內(nèi)標同時測定丹參中蒽醌類成分的含量，計算二氫丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮I的RCF值分別為1.55、1.12和1.28。第二種為選擇2種不同類型的內(nèi)標測定不同類型化合物，如表1中以綠原酸和羌活醇分別測定羌活中有機酸類成分和香豆素類成分，RCF值從0.5-2.234變化較大。第三種為選擇1種內(nèi)標測定不同類型的化合物，如表1中選擇綠原酸測定忍冬中咖啡?？鼘幩犷惓煞趾铜h(huán)烯醚萜苷類成分，咖啡?？鼘幩犷惓煞諶CF接近0.77，環(huán)烯醚萜苷類成分RCF接近1.2。綜上，相同類型成分的RCF值是比較接近，而不同類型成分采用同一內(nèi)標時，RCF值相差懸殊。

表1 HPLC在以QAMS法進行中藥質(zhì)量控制的應(yīng)用

平均值法在中藥QAMS的計算方法應(yīng)用占主導(dǎo)地位。果德安教授課題組采用QAMS法測定了附子中5個生物堿的含量，比較了將RCF值設(shè)為1和斜率比值法所測結(jié)果的差異，結(jié)果顯示，5種生物堿斜率比值法RCF值的變化范圍為0.95-1.10。兩種不同類型RCF值對5種生物堿含量測定結(jié)果無顯著影響[26]。由此可見，當(dāng)化合物極性相似、紫外吸收特征和色譜行為相似的情況下，RCF設(shè)為1可以簡化整個分析過程。

此外，Sun等[37]以防腐劑苯甲酸鈉作為內(nèi)標，分別計算不同濃度下松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷的平均RCF分別為2.3113、1.5703、1.3707，建立同時測定蓉蛾益腎口服液中防腐劑苯甲酸鈉、松果菊苷、毛蕊花糖苷和淫羊藿苷含量的方法，將測定結(jié)果與外標法結(jié)果相比比率接近于1，并且經(jīng)t檢驗，P＞0.05，以防腐劑作為內(nèi)標的中藥制劑QAMS多成分定量具有可行性。

超高效液相色譜（Ultra high performance liquid chromatography，UHPLC），具有超高效、超高分離度和超高靈敏度等優(yōu)點，可用于解決中藥復(fù)雜組分分離困難等問題。UHPLC的問世對中藥質(zhì)量控制研究領(lǐng)域的發(fā)展是一個極大的促進[42]。近年來，基于UHPLC的QAMS方法已被廣泛應(yīng)用于中藥材、中藥提取物及中成藥制劑中多組分的快速同時定量（表2）。相較于HPLC而 言，采 用UHPLC-UV或UHPLC-DAD進 行QAMS質(zhì)量評價的相關(guān)研究較少。截止2020版《中國藥典》中尚未收載UHPLC與QAMS結(jié)合用于中藥多成分定量分析的方法。

表2 UPLC在以QAMS法進行中藥質(zhì)量控制的應(yīng)用

續(xù)表

2.2 高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器聯(lián)用技術(shù)

蒸發(fā)光檢測器（evaporative light-scattering detector，ELSD）為質(zhì)量通用型檢測器，受試樣品不需含有發(fā)色基團，即有物質(zhì)就有響應(yīng)[49]。該檢測器是紫外檢測器的有力補充，適合于沒有紫外吸收或紫外吸收弱的化合物，如皂苷類和三萜類等。對于ELSD而言，當(dāng)檢測的線性范圍較窄，樣品量與峰面積有時不呈線性關(guān)系，定量時需采用對數(shù)關(guān)系進行線性回歸的計算[49]。

郭玉巖等[50]以HPLC-ELSD技術(shù)建立同時測定類葉牡丹中6種皂苷類成分的QAMS方法，以cauloside G為內(nèi)參，分別計算leonticin D和cauloside H、D、B、C相對于內(nèi)參的RCF分別為0.972、1.104、1.060、0.947和0.964，與外標法比較沒有顯著差異，該方法穩(wěn)定可靠。蔣齡周等[51]利用HPLC-ELSD技術(shù)建立同時測定桔梗中3種桔梗皂苷含量的方法，以桔梗皂苷D為內(nèi)標，計算其與桔梗皂苷D3、桔梗皂苷E的相對校正因子為1.044和1.031，并與外標法測定結(jié)果相比較，無顯著差異，該方法可用于同時測定桔梗中多種皂苷的含量。羅雨等[52]基于HPLC-UV-ELSD技術(shù)建立了同時測定黃芪水提、醇提液中4種黃酮和2種皂苷類成分的QAMS法，分別以毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷作為黃酮類成分和皂苷類成分的內(nèi)標，計算芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、2′-羥基-3′，4′-二甲氧基異黃烷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和黃芪皂苷Ⅱ相對于各自內(nèi)標的RCF，進行了在不同檢測器上針對不同類型成分建立QAMS法的探索，結(jié)果表明以HPLC-UV技術(shù)為基礎(chǔ)建立的黃芪水提、醇提液中黃酮類成分的QAMS方法可行，而以HPLCELSD技術(shù)建立的QAMS方法測定皂苷類成分的重復(fù)性測定結(jié)果偏差較大，難以實現(xiàn)準確定量。

2.3 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

質(zhì)譜檢測器既是分離器，也是探測器[53]。質(zhì)譜技術(shù)近年來發(fā)展迅速，特別是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用為中藥復(fù)雜化學(xué)成分的定性、定量分析提供了有效手段。目前，在中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域應(yīng)用較多的質(zhì)譜檢測器主要為三重四級桿（triple quadrupole，TQ）質(zhì)譜、飛行時間（Time of Flight，TOF）質(zhì) 譜 和 靜 電 軌 道 離 子 阱（Orbitrap）。

TQ質(zhì)譜在多反應(yīng)監(jiān)測（multiple-reactionmonitoring，MRM）模式下展現(xiàn)出極高的靈敏度，可實現(xiàn)已知化合物的定量分析。MRM模式是中藥定量分析中的“金標準”[54]。Lu等[55]基于RRLC-QqQ-MS/MS法，以人參皂苷Rg1為內(nèi)參，建立了人參屬5種藥用植物中的17種三萜皂苷類化合物定量分析的方法，結(jié)果表明使用RRLC-QqQ-MS/MS新方法進行QAMS質(zhì)量評價，在選擇性、靈敏度、可重復(fù)性和分析時間方面表現(xiàn)出良好的性能，滿足了中藥多成分定量中含量差異懸殊的特點，是在缺少對照品的情況下實現(xiàn)中藥多成分同時定量的一種新方法。

TOF質(zhì)譜和Orbitrap質(zhì)譜具有質(zhì)量范圍寬、高靈敏度和高精確度的優(yōu)勢，可提供大范圍的定性和定量分 析[56-57]。Tang等[58]基 于UPLC-Q-TOF-MS法，以 連翹苷A為內(nèi)參，計算綠原酸、甘草苷、蘆丁、異綠原酸A、連翹苷和甘草酸的平均RCF分為0.4866、1.1744、0.4862、0.4876、5.2068和0.8531，并同時測定6種化合物的含量，與外標法結(jié)果比較沒有顯著差異，并以此為基礎(chǔ)建立四季-抗病毒合劑質(zhì)量控制的新方法。Huang等[59]基于UPLC-ESI-TOF-MS技術(shù)，以黃芪甲苷I為內(nèi)參物，分別計算了毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡糖苷、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷、黃芪甲IV、芒柄花苷和黃芪甲苷II的平均RCF，并測定了21批黃芪中7種成分的含量，與常規(guī)外標法測定結(jié)果比較，無顯著差異。Su等[60]建 立 了 基 于UHPLC-Q-Orbitrap-MS法 進 行QAMS核桃葉中13種成分的定量方法，通過對4批不同產(chǎn)地核桃葉中13個黃酮類和酚酸類成分的定量分析結(jié)果與常規(guī)外標法結(jié)果相比，QAMS準確可靠。

2.4 氣相色譜

目前，GC法常用的檢測器有氫焰離子化檢測器（Flame Ionization Detector，F(xiàn)ID）、電子捕獲探測器（Electron Capture Detector，ECD）、火焰光度檢測器（Flame Photometric Detector，F(xiàn)PD）及質(zhì)譜檢測器，適用于分析各種氣體和易揮發(fā)的有機物質(zhì)。目前主要應(yīng)用于中藥揮發(fā)性化學(xué)成分的QAMS質(zhì)量控制研究中[61-62]。陳文婷等[63]基于GC-FID技術(shù)，以β-桉葉醇為內(nèi)標，同時測定蒼術(shù)中3種倍半萜成分的含量，計算蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的平均RCF分別為0.823、0.690和0.766，并與外標法結(jié)果經(jīng)t檢驗，P＞0.05，無顯著性差異。吳婷等[65]采用GC-FID技術(shù)，以檸檬烯為內(nèi)參物，計算連翹揮發(fā)油中α-蒎烯、β-蒎烯、α-松油醇的平均RCF值分別為0.91、0.86、1.11，以QAMS方法同時測定上述3種成分的含量，與外標法結(jié)果經(jīng)t檢驗比較，P＞0.05，無顯著性差異。游正琴等[64]基于GC-FID技術(shù)，以龍腦為內(nèi)參，計算薄荷酮、樟腦和薄荷腦的平均RCF值分別為1.0241、1.0185和1.0130，同時測定咽立爽口含滴丸中上述3種成分的含量，結(jié)果與內(nèi)標法結(jié)果比較無顯著性差異，該法可靠穩(wěn)定。唐志康等[65]基于GC-MS/MS技術(shù)，以聯(lián)苯菊酯為內(nèi)參，建立了測定蓮子中甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯3種農(nóng)藥殘留量的QAMS方法，結(jié)果顯示該方法適用于分析蓮子中聯(lián)苯菊酯等農(nóng)藥殘留情況。

3 總結(jié)與展望

中藥具有多成分、多靶點整合作用特點。中藥的多指標質(zhì)量評價方法已成為本行業(yè)的共識。QAMS法已廣泛應(yīng)用于中藥材、中藥飲片、中藥提取物、中成藥等多種中藥領(lǐng)域，具有檢測成本低、分析效率快等優(yōu)點。目前已經(jīng)實現(xiàn)了中藥復(fù)雜體系中黃酮類、皂苷類、蒽醌類、生物堿、有機酸等多種成分的同時定量分析。多指標成分定量在方法構(gòu)建和標準執(zhí)行階段均需要對照品，與其相比QAMS的最大優(yōu)勢體現(xiàn)在僅在方法構(gòu)建階段需要對照品。

RCF是QAMS的關(guān)鍵參數(shù)，其直接決定QAMS法的定量準確度。QAMS應(yīng)用過程中，RCF值設(shè)為1適合于具有高度相近的摩爾吸收系數(shù)或者分子質(zhì)量的被分析物質(zhì)。在同一吸收波長下，結(jié)構(gòu)相近摩爾吸收系數(shù)（ε）的被分析物，多采用斜率比較法和平均值法進行計算，其中平均值法在中藥QAMS質(zhì)量評價中應(yīng)用最為廣泛。此外，不同的色譜儀器系統(tǒng)、色譜柱填料、色譜柱類型、吸收波長、流動相和柱溫等因素均會顯著影響RCF值的計算。

目前，HPLC-UV仍是在QAMS方法中應(yīng)用較為成熟和廣泛的主流技術(shù)，適用于分析具有紫外吸收的化合物，如黃酮、生物堿、蒽醌和酚類等成分。該技術(shù)定量結(jié)果準確、穩(wěn)定、普適性強。而基于HPLC-ELSD技術(shù)的QAMS測定準確性和適用性仍然需進一步探索和驗證。LC-MS/MS技術(shù)雖然具有靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點，可實現(xiàn)同時對低含量和高含量成分定量，但由于其價格昂貴，普適性相對較差。LC-QOrbitrap-MS/MS技術(shù)具有定性高準確度的優(yōu)勢，但針對復(fù)雜基質(zhì)多成分定量時，仍存在無法克服基質(zhì)效應(yīng)及共流出物對待測成分的干擾而導(dǎo)致定量準確性的問題。GC技術(shù)在中藥QAMS質(zhì)量控制研究工作中仍處于起步階段，同時使用的化學(xué)成分類型相對有限，有待進一步的挖掘和拓展。

當(dāng)利用同一內(nèi)參物進行同類化學(xué)成分測定時，QAMS法具有準確度高、重復(fù)性好的特點；而利用同一內(nèi)參物測定不同類型化學(xué)成分時，RCF值差異較大，嚴重影響QAMS方法定量的準確性。由此可見，解決QAMS法在中藥不同類型化學(xué)成分同時定量過程中RCF值偏差較大的問題，是今后中藥質(zhì)量研究中需要關(guān)注的重點。此外，盡管QAMS法在中藥材及中藥提取物的多成分定量中得到了廣泛的推廣和應(yīng)用。然而，中成藥制劑的QAMS多成分質(zhì)量評價方法仍處于研究探索階段，尚未收錄于《中國藥典》。綜上所述，發(fā)展基于HPLC聯(lián)用紫外檢測器技術(shù)的QAMS方法在中成藥制劑質(zhì)量評價中的應(yīng)用，是中藥質(zhì)量控制與評價領(lǐng)域值得關(guān)注的研究方向；繼續(xù)完善LC-MS和GC技術(shù)在中藥QAMS質(zhì)量評價中的定量準確定、穩(wěn)定性和普適性，將進一步拓展QAMS方法在中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域的應(yīng)用。