路瑤 歐永玉 李欽 劉小清 鄭悅 賈毓寧 豐杰

高血壓是一種常見和多發(fā)的慢性心血管疾病，主要表現(xiàn)為體循環(huán)動(dòng)脈血壓升高，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓，長(zhǎng)期血壓水平過高會(huì)出現(xiàn)靶向器官嚴(yán)重受損，威脅患者生命安全[1-2]。近年來，隨著醫(yī)學(xué)水平提高，原發(fā)性高血壓病死率明顯降低，但仍有部分患者靶向器官受損，發(fā)生不良心血管事件[3]。原發(fā)性高血壓治療過程中，最為關(guān)鍵的是藥物的選擇和使用，厄貝沙坦（Irbesartan）是一種長(zhǎng)效高選擇性血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）受體拮抗劑，能特異性地拮抗血管緊張素Ⅱ受體（AT1），屬于二苯咪唑類化合物，口服后能迅速吸收，生物利用度為60%～80%，消除半衰期為11～15 h，是治療高血壓的一線藥物之一，近年來在臨床上廣泛應(yīng)用[4-7]。厄貝沙坦片為白色或類白色薄膜衣片，含有薄膜衣時(shí)，薄膜衣碎片通常很難研細(xì)，特別是腸溶衣（丙烯酸7 樹脂），延展性較強(qiáng)，不易溶解和研磨，影響粉末的均勻性，從而影響厄貝沙坦含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。去掉包衣或薄膜衣會(huì)損失部分主藥，導(dǎo)致含量下降。故應(yīng)結(jié)合實(shí)際檢測(cè)需要并綜合考慮操作各方面因素，確定采用何種操作來檢驗(yàn)厄貝沙坦的含量，達(dá)到不去除薄膜衣又不影響測(cè)定結(jié)果[8-9]。本文就研磨時(shí)間、有無預(yù)研磨操作及研缽材質(zhì)進(jìn)行研究，考察厄貝沙坦片中厄貝沙坦的含量情況，摸索確定最佳的厄貝沙坦含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent1260 型高效液相色譜儀、XPE105 型電子天平、KH-1000E 型超聲儀。

試藥：乙腈、甲醇使用色譜級(jí)，磷酸、三乙胺使用分析級(jí)，純化水自制，厄貝沙坦對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：100608-201804），科蘇（厄貝沙坦片）（一致性評(píng)價(jià)）（0.075 g）由揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司提供，移液管、容量瓶等準(zhǔn)確度等級(jí)為A 級(jí)。

2 相關(guān)材料

2.1 色譜條件

色譜柱：APLLO-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相：磷酸溶液：乙腈（62∶38），檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm，柱溫：30℃，流速：1.0mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 系統(tǒng)適用性溶液

分別取105℃干燥至恒重的厄貝沙坦對(duì)照品與雜質(zhì)I對(duì)照品各適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 毫升中各約含0.1 mg 的混合溶液，搖勻即得，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 對(duì)照品溶液

精密稱取105℃干燥至恒重厄貝沙坦對(duì)照品約40 mg，置200 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 毫升中含0.2 mg 的溶液，搖勻即得，作為對(duì)照品溶液。

2.4 待測(cè)樣品溶液

取厄貝沙坦片20 片，精密稱定計(jì)算平均片重，將厄貝沙坦片研磨，取研磨后的樣品細(xì)粉（約相當(dāng)于厄貝沙坦20 mg），置100 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲10 min 使厄貝沙坦溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為待測(cè)樣品溶液。

3 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

按照Chp2015 版四部藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則開展實(shí)驗(yàn)。

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在高效液相色譜法中，色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復(fù)性等五個(gè)關(guān)鍵參數(shù)[10-12]。其中理論塔板數(shù)是柱效的具體體現(xiàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生直接影響。故用規(guī)定的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，出峰順序依次為雜質(zhì)I 峰與厄貝沙坦峰，雜質(zhì)I 峰與厄貝沙坦峰的分離度應(yīng)大于2.0，理論板數(shù)按厄貝沙坦峰計(jì)算不低于2 000。以雜質(zhì)I 峰與厄貝沙坦峰的分離度及厄貝沙坦峰的理論塔板數(shù)為指標(biāo)，考察系統(tǒng)的適用性[13-14]。

按要求對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，出峰順序、分離度、理論板數(shù)均符合國(guó)家藥品監(jiān)督管理局YBH07772019 含量測(cè)定項(xiàng)下要求。

3.2 專屬性試驗(yàn)

取空白溶液、對(duì)照品溶液和待測(cè)樣品溶液，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，樣品溶液主峰的保留時(shí)間與對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致，空白溶液在主峰位置應(yīng)無干擾色譜峰。

樣品溶液與對(duì)照品溶液兩者主峰保留時(shí)間一致，空白溶液在主峰位置均無干擾色譜峰。

3.3 線性

精密稱取105℃干燥至恒重厄貝沙坦對(duì)照品約40 mg，置200 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 毫升中含0.2 mg 的溶液，分別量取1.0、4.0、5.0、6.0、10.0 mL，置10 mL 的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度制成各濃度線性溶液。取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在（0.04～0.40）mg/mL 濃度范圍內(nèi)，主峰濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

3.4 檢測(cè)限和定量限試驗(yàn)

檢測(cè)限：取105℃干燥至恒重厄貝沙坦對(duì)照品加甲醇溶解并不斷稀釋成主峰與噪音峰信號(hào)的強(qiáng)度比約為3 時(shí)，得到被檢測(cè)出的最低濃度即為檢測(cè)限濃度[15-16]，取檢測(cè)限溶液分別進(jìn)樣3 針注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

連續(xù)進(jìn)樣3 針主峰峰面積及保留時(shí)間的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于2.0%，檢測(cè)限的濃度為0.038 μg/mL。

定量限：取105℃干燥至恒重厄貝沙坦對(duì)照品加甲醇溶解并不斷稀釋成主峰與噪音峰信號(hào)的強(qiáng)度比約為10 時(shí)，得到定量檢測(cè)出的濃度即為定量限濃度[15-16]，取定量限濃度分別進(jìn)樣6 針注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

連續(xù)進(jìn)樣6 針主峰峰面積及保留時(shí)間的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于2.0%，檢測(cè)限的濃度為0.13 μg/mL。

3.5 精密度試驗(yàn)

取厄貝沙坦片20 片，精密稱定計(jì)算平均片重，將厄貝沙坦片研磨，取研磨后的樣品細(xì)粉（約相當(dāng)于厄貝沙坦20 mg），置100 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲10 min 使厄貝沙坦溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液制成6 份，由一個(gè)檢測(cè)人員分別取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

所得6 份樣品溶液中，主峰峰面積及保留時(shí)間的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于2.0%，說明該方法重復(fù)性及儀器精密度良好。

3.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取105℃干燥至恒重厄貝沙坦對(duì)照品約40 mg，置200 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 中含0.2 mg 的溶液，分別在室溫下放置0、4、8、12、18、24、36、42、48 h 后取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

取厄貝沙坦片20 片，精密稱定計(jì)算平均片重，將厄貝沙坦片研磨，取研磨后的樣品細(xì)粉（約相當(dāng)于厄貝沙坦20 mg），置100 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲10 min使厄貝沙坦溶解，并用甲醇稀釋至刻度搖勻即得，分別在室溫下放置0、4、8、12、18、24、36、42、48 h 后取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

對(duì)照品溶液在室溫放置0、4、8、12、18、24、36、42、48 h 后，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)主峰峰面積與0 h 的峰面積比值均在98.0%～102.0%范圍內(nèi)。

樣品溶液中，在室溫放置0、4、8、12、18、24、36、42、48 h 后，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)主峰峰面積和0 h 的峰面積RSD%小于2.0%。

表明對(duì)照品溶液和樣品溶液在室溫條件下放置48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 加樣回收試驗(yàn)

稱取不含主成分的陰性空白制劑約20 mg，分別加入主成分16、20、24 mg 各3 份，分別置100 mL 容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度搖勻即得，制得濃度分別為80%、100%和120%的樣品溶液，共9 份。取空白溶劑、對(duì)照品溶液及不同濃度的回收率樣品溶液各10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。

按外標(biāo)法計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。平均回收率（n=9）為98.37%。

表1 厄貝沙坦加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

4 含量測(cè)定

精密量取2.2 項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液、2.3 項(xiàng)下對(duì)照品溶液和2.4 項(xiàng)下樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀。進(jìn)行不同研磨時(shí)間，有無預(yù)研磨操作，不同材質(zhì)研缽對(duì)厄貝沙坦含量測(cè)定結(jié)果的影響試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)1：取3 批厄貝沙坦片（批次分別是20071651、20090951、20101051）各20 片，每批樣品在陶瓷研缽中分別研磨2、3、5 min，按照2.4.樣品溶液的制備方法進(jìn)行制備，測(cè)定厄貝沙坦片中厄貝沙坦的含量。從表2 及圖1 中可以看出，研磨時(shí)間由2 min 到3 min，厄貝沙坦片的含量依次降低，說明研磨時(shí)間的延長(zhǎng)，導(dǎo)致陶瓷研缽吸附繼而會(huì)導(dǎo)致厄貝沙坦含量結(jié)果的降低。3 min 到5 min 結(jié)果基本一致，趨于平緩，說明研磨吸附飽和后，不會(huì)再影響厄貝沙坦片的含量測(cè)定結(jié)果。

圖1 不同研磨時(shí)間對(duì)厄貝沙坦片含量測(cè)定結(jié)果的影響

表2 不同研磨時(shí)間對(duì)厄貝沙坦片含量測(cè)定結(jié)果的影響（%）

實(shí)驗(yàn)2：針對(duì)陶瓷研缽吸附問題，采用預(yù)研磨和不預(yù)研磨開展實(shí)驗(yàn)，按下述方法進(jìn)行測(cè)定。（1）預(yù)研磨操作：取批號(hào)為21032251 的厄貝沙坦片10 片，在陶瓷研缽中研磨5 min，棄去內(nèi)容物，另取該批厄貝沙坦片20 片，在上述陶瓷研缽中研磨3 min，混勻后按照2.4 樣品溶液的制備方法進(jìn)行制備，測(cè)定厄貝沙坦片中厄貝沙坦的含量；（2）不預(yù)研磨操作：取批號(hào)為21032251 的厄貝沙坦片20 片，在陶瓷研缽中研磨3 min，混勻后按照2.4 樣品溶液的制備方法進(jìn)行制備，測(cè)定厄貝沙坦片中厄貝沙坦的含量。從表3可以看出，陶瓷研缽預(yù)研磨的厄貝沙坦片含量結(jié)果要高于未經(jīng)過預(yù)研磨的陶瓷研缽測(cè)定出的含量。這也驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)1中的結(jié)論，陶瓷研缽吸附會(huì)影響含量測(cè)定結(jié)果。

表3 預(yù)研磨與不預(yù)研磨操作對(duì)厄貝沙坦片中厄貝沙坦含量的影響對(duì)比（%）

實(shí)驗(yàn)3：不同研缽材質(zhì)、研磨操作對(duì)厄貝沙坦片含量測(cè)定結(jié)果的影響。（1）取批號(hào)為21032251 的厄貝沙坦片10片，在陶瓷研缽中研磨5 min，棄去內(nèi)容物，另取厄貝沙坦片20 片，在陶瓷研缽中研磨3 min，混勻后稱取三份平行樣品，按照2.4 樣品溶液的制備方法進(jìn)行制備，測(cè)定厄貝沙坦片中厄貝沙坦的含量。（2）取批號(hào)為21032251 的厄貝沙坦片20 片，在瑪瑙研缽研磨3 min，混勻后稱取三份平行樣品，按照2.4 樣品溶液的制備方法進(jìn)行制備，測(cè)定厄貝沙坦片中厄貝沙坦的含量。從表4 數(shù)據(jù)來看，更換不同材質(zhì)研缽，瑪瑙研缽研磨與使用陶瓷研缽預(yù)研磨進(jìn)行測(cè)定，對(duì)厄貝沙坦片含量測(cè)定結(jié)果幾乎相差不大，更加證明研缽材質(zhì)不同，對(duì)厄貝沙坦吸附影響不同，導(dǎo)致厄貝沙坦含量測(cè)定結(jié)果不同。

表4 同一批樣品采用陶瓷研缽預(yù)研磨與瑪瑙研缽不預(yù)研磨的測(cè)定結(jié)果（%）

5 討論

在厄貝沙坦片含量測(cè)定過程中，決定研磨效果的主要因素有：被研磨物的料性，研磨的材質(zhì)，研磨壓力及研磨的速度等[17]。本文針對(duì)不同的研磨時(shí)間，考察陶瓷研缽對(duì)厄貝沙坦的吸附影響。針對(duì)吸附問題，對(duì)比有無預(yù)研磨操作對(duì)厄貝沙坦含量測(cè)定結(jié)果的影響。此外，對(duì)比陶瓷、瑪瑙不同材質(zhì)的研缽對(duì)厄貝沙坦含量測(cè)定結(jié)果的影響，找出影響厄貝沙坦含量測(cè)定結(jié)果的影響因素。綜上所述，選擇合適的研磨時(shí)間，及研磨操作方式、研缽材質(zhì)，能夠較真實(shí)的反映出厄貝沙坦片中厄貝沙坦的實(shí)際含量。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，為減少陶瓷內(nèi)表面粗糙導(dǎo)致的吸附，可使用瑪瑙研缽直接研磨樣品進(jìn)行厄貝沙坦的含量測(cè)定。若無瑪瑙研缽，可使用陶瓷研缽進(jìn)行樣品預(yù)研磨，使研缽吸附飽和樣品后，再進(jìn)行厄貝沙坦的含量測(cè)定。