潘蓉蓉，鐘秋蔚，張 露，馬際凱，程強(qiáng)強(qiáng)，袁生貴，孫榮喜

(江西省森林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江西特色林木資源培育與利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心；江西農(nóng)業(yè)大學(xué)·林學(xué)院，江西 南昌 330045)

毛紅椿(Toona ciliata var.pubescens)是楝科(Meliaceae)香椿屬(Toona)落葉高大喬木，主干通直圓滿，材性優(yōu)良，是我國珍貴速生用材樹種，為國家二級保護(hù)植物。由于毛紅椿天然更新緩慢，人為干擾嚴(yán)重，導(dǎo)致毛紅椿分布區(qū)不斷縮小，呈間斷分布，目前極難見到成片分布的林分[1]。前人對毛紅椿苗期性狀[2]、人工造林[3]、家系選擇[4]、藥用價(jià)值[5]等開展過大量研究，在遺傳機(jī)理方面研究相對較少。毛紅椿現(xiàn)有種群多以無性繁殖為主，遺傳多樣性較低，現(xiàn)已開發(fā)的SSR引物難以揭示小種群內(nèi)可能存在的遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)[6-7]，且已知毛紅椿基因組序列信息有限，開發(fā)SSR引物存在一定困難。

目前一些多態(tài)性低或特定品種的遺傳研究，比如連鎖圖譜的構(gòu)建[8]，近緣物種的劃分[9]，山白樹(Sinowilsonia fienryi)[10]、羽葉丁香(Syringa pinnatifolia)[11]、青檀(Pteroceltis tatarinowii)[12]、鳳凰單叢古茶樹(Camellia sinensis)[13]和珙桐(Davidia involucrata)[14]等珍稀瀕危植物均以AFLP(amplified fragment length polymorphism)開展親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究，并且利用AFLP對非模式生物基因組捕獲，創(chuàng)建一種通用的系統(tǒng)發(fā)育分析方法[15]。該研究擬對毛紅椿AFLP所需模板的制備、產(chǎn)物稀釋倍數(shù)及引物的篩選進(jìn)行探索，優(yōu)化毛紅椿AFLP體系，篩選出多態(tài)性引物，為該物種保護(hù)和遺傳多樣性研究提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選自江西九連山國家級自然保護(hù)區(qū)(24°36′N，114°30′E)天然林內(nèi)的毛紅椿植株，共采集41株健康樹的幼嫩葉片，硅膠干燥帶回實(shí)驗(yàn)室提取DNA。其中37株毛紅椿的葉片來自潤洞毛紅椿居群(R1-R37)，其他4株分別采自二級站毛紅椿居群(R110)、橫坑水毛紅椿居群(H14)、蝦公塘毛紅椿居群(R319)和大丘田毛紅椿居群(D62)。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。EcoR I、Mse I內(nèi)切酶購于NEB公司，T4連接酶購于生工生物工程(上海)股份有限公司，Taq酶購于南京諾唯贊生物股份有限公司，DNA提取試劑盒DP305購于天根生化科技(北京)公司。

表1 AFLP所用接頭和引物Tab.1 Adapters and primers of AFLP

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 毛紅椿基因組DNA提取和檢測

采用改良的CTAB[16]法和試劑盒法提取DNA，探索不同提取方法對DNA質(zhì)量的影響。用紫外分光光度計(jì)和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和純度，將檢測質(zhì)量合格的DNA統(tǒng)一稀釋成50 ng·μL-1，-20℃保存。

1.2.2 AFLP反應(yīng)體系

（1）酶切與連接

酶切與連接采用一步法和兩步法。一步法參照李雪萍[17]方法，將酶切與連接液混合，加入樣品DNA后，放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，充分酶切與連接。反應(yīng)總體積20 μL，含樣品DNA 3 μl(50 ng·μL-1)，10×T4 Buffer 2 μL，EcoR I(5 pmol·μL-1)/Mse I(50 pmol·μL-1)接頭各1 μL，EcoR I(20 U·μL-1)0.15 μL，Mse I(10 U·μL-1)0.3 μL，T4 DNA Ligase(4 U·μL-1)0.3 μL，加dd H2O補(bǔ)足總體積至20 μL。

兩步法參照劉曉瑩[18]方法，將DNA在37℃培養(yǎng)箱中酶切3 h，酶切結(jié)束后65℃滅活20 min，隨后進(jìn)行連接(酶切與連接間隔時(shí)間不宜太久)，取10 μL的酶切原液與接頭和T4連接酶在16℃金屬浴中連接12 h，結(jié)束后65℃滅活20 min，-20℃保存?zhèn)溆?。反?yīng)總體積及各類試劑量參照一步法。

（2）預(yù)擴(kuò)增

探索酶切與連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)對預(yù)擴(kuò)增的影響。設(shè)置不同稀釋倍數(shù)分別為2、3、5、8和10倍。反應(yīng)總體積20 μL，其中稀釋后酶切與連接產(chǎn)物取3 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2 μL，dNTPs(10 mmol·μL-1)0.8 μL，E-0(10 μmol·L-1)/M-0(10 μmol·L-1)引物各0.6 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL，用ddH2O補(bǔ)足總體積至20 μL；PCR反應(yīng)程序：94℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。

（3）選擇性擴(kuò)增

將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物分別稀釋10倍、20倍、30倍、40倍和50倍作為選擇性擴(kuò)增模板。反應(yīng)總體積20 μL，其中稀釋后預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)2 μL，dNTPs(10 mmol·μL-1)0.8 μL，Mse I(10 μmol·L-1)/EcoR I(10 μmol·L-1)選擇性引物各0.6 μL，Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL，用ddH2O補(bǔ)足總體積至20 μL。PCR擴(kuò)增采用“touch-down”程序：94℃3 min，94℃30 s，65℃(每個(gè)循環(huán)下降0.7℃)30 s，72℃1 min，13個(gè)循環(huán)；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，25個(gè)循環(huán)；72℃5 min，4℃保存。

1.3 AFLP反應(yīng)體系測定

選用大丘田毛紅椿單株(D62)DNA作為模板，引物為E2/M2(E-ACC/M-CAG)組合，2%瓊脂糖凝膠檢測酶切與連接產(chǎn)物、預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物和選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物，用量為2 μL產(chǎn)物+2 μL 6倍DNA上樣緩沖液。

1.4 引物篩選

選用R110、H14、R319、D62等4個(gè)毛紅椿DNA樣本，對8個(gè)EcoR I引物和8個(gè)Mse I引物組成的64對引物組合進(jìn)行初篩，在2%瓊脂糖凝膠中篩選出能夠擴(kuò)增出條帶的引物；再進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳檢測。電泳前將選擇擴(kuò)增產(chǎn)物在PCR儀中95℃變性5 min，迅速放置在96孔低溫配液模塊中防止復(fù)性，取4 μL選擇擴(kuò)增產(chǎn)物在1 mm 40孔內(nèi)點(diǎn)樣，300 V，電泳3 h。參照張峰[19]方法進(jìn)行銀染，拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 引物多樣性檢測

將篩選出的多樣性引物對潤洞毛紅椿居群37個(gè)單株(R1-R37)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測，計(jì)算100~500 bp之間的電泳譜帶，根據(jù)條帶的有無進(jìn)行1、0記數(shù)，在相同遷移位置上有條帶記為1、無條帶記為0，形成0/1矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)，進(jìn)行引物多態(tài)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對DNA質(zhì)量的影響

對不同植物或同一植物不同組織器官，DNA提取方法不同，DNA質(zhì)量也有很大差別。該研究采用的CTAB法和試劑盒法提取的DNA質(zhì)量不同，CTAB提取的DNA含有多糖、酚、色素等雜質(zhì)，對AFLP預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增PCR過程有抑制作用，PCR擴(kuò)增后檢測不到DNA條帶，而試劑盒(天根DP305)提取的DNA質(zhì)量較高(圖1)，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 試劑盒提取毛紅椿DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 The agarose gel electrophoresis results of T.ciliata var.pubescens DNA extracted by kit

2.2 毛紅椿AFLP體系的建立

通過酶切與連接兩種方法比較，結(jié)果表明兩種方法無明顯差異。因兩步法操作復(fù)雜，耗時(shí)較長，因此本實(shí)驗(yàn)選擇一步法開展。AFLP預(yù)擴(kuò)增選取不含選擇堿基的引物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著酶切與連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)的增加，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物量呈逐漸減少的狀態(tài)，當(dāng)酶切與連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)為3倍時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物最清楚?？蔀楹罄m(xù)選擇性擴(kuò)增提供較理想的反應(yīng)模板。當(dāng)進(jìn)行選擇性擴(kuò)增時(shí)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物不同稀釋倍數(shù)對選擇性擴(kuò)增結(jié)果有明顯影響，當(dāng)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍時(shí)，能夠擴(kuò)增出清晰條帶，影子帶較少。

2.3 引物篩選

用64對引物組合進(jìn)行初篩，在2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測，獲得能夠清晰穩(wěn)定擴(kuò)增出條帶的引物24對，圖2為部分初篩選擇性擴(kuò)增引物；隨后將24對引物組合在6%聚丙烯酰胺凝膠中電泳進(jìn)行復(fù)篩，篩選出4對多態(tài)性引物，擴(kuò)增出的條帶數(shù)和多態(tài)性較高(圖3)。在4個(gè)毛紅椿單株DNA中擴(kuò)增出147個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)122個(gè)，不同引物組合擴(kuò)增效果不同，E-AAC/M-CAA引物擴(kuò)增位點(diǎn)最多(51個(gè))，但多態(tài)性位點(diǎn)較少，多態(tài)位點(diǎn)百分率為78.43%；多態(tài)性較高的引物為E-ACG/M-CTT，多態(tài)位點(diǎn)百分率為96.15%，4對引物平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為84.36%，可用于毛紅椿AFLP分子標(biāo)記分析(表2)。

圖2 部分引物選擇性擴(kuò)增初篩圖Fig.2 Part of preliminary screen diagram of selective amplication primers

圖3 多態(tài)性引物聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.3 Polyacrylamide gel electrophoresis results of polymorphic primers

表2 AFLP多態(tài)性引物Tab.2 Polymorphic primers of AFLP

2.4 AFLP體系的穩(wěn)定性檢測

引物E4/M7對潤洞毛紅椿居群內(nèi)37個(gè)單株DNA樣品(R1-R37)進(jìn)行擴(kuò)增(圖4)，能夠擴(kuò)增出清晰條帶，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，背景清晰，無彌散現(xiàn)象，擴(kuò)增條帶大多分布在100~500 bp，說明基因組酶切完全，AFLP反應(yīng)體系適用于毛紅椿遺傳多樣性研究。

圖4 引物組合E4/M7對37個(gè)樣品選擇性擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Selective amplification results of E4/M7 primer on 37 samples

3 結(jié)論與討論

該研究通過對模板DNA質(zhì)量、連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)、預(yù)擴(kuò)增稀釋倍數(shù)以及Taq酶反復(fù)摸索調(diào)整得到較穩(wěn)定體系，20 μLAFLP體系中，DNA含量為150 ng，3U EcoR I和Mse I雙內(nèi)切酶，1.2U T4 DNA連接酶在37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)5 h，連接產(chǎn)物稀釋3倍進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測，可獲得清晰的條帶；從64對引物組合中共篩選出4對多態(tài)性較高的引物組合，平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率84.36%，可為毛紅椿遺傳多樣性和種質(zhì)資源研究提供支持。

前人研究AFLP分子標(biāo)記對模板DNA濃度不敏感[17,20]，但是DNA質(zhì)量是試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。不同提取方法，DNA提取質(zhì)量不同。改良CTAB法是通過氯仿異戊醇等有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚等雜質(zhì)，加入乙醇進(jìn)行沉淀，經(jīng)離心去除上清液得到DNA[21]。經(jīng)1%凝膠電泳檢測CTAB法提取的DNA溶液含有RNA、多糖、色素或酚等雜質(zhì)，這可能與有機(jī)溶劑抽提次數(shù)較少(2次)，雜質(zhì)沒有去除干凈有關(guān)；另外可能乙醇對DNA沉淀時(shí)，隨著沉淀時(shí)間延長，色素、多糖、酚附著在DNA表面，經(jīng)離心后，明顯看出DNA呈褐色而不是白色沉淀物。DNA提取試劑盒采用離心柱法，利用特異性膜與DNA結(jié)合達(dá)到分離、回收的目的，操作簡單、高效，DNA質(zhì)量較高，雜質(zhì)少，但是存在提取DNA含量低，所得樣品溶液較少(含量一般在30~100 ng·μL-1之間，所得溶液為80~100 μL)，易降解，需-20℃保存。AFLP分子標(biāo)記對DNA濃度不敏感且用量少，但對DNA質(zhì)量要求高，因此試劑盒提取的DNA較適用于后續(xù)研究。

AFLP酶切與連接一般采用一步法或兩步法，如對珙桐[17]、梅花(Prunus mume)[22]、風(fēng)信子(Hyacinth orientalis)[23]研究的過程中采用一步法，對榧樹(Torreya grandis)[24]、廣藿香(Pogostemon cablin)[18]采用兩步法，不同的研究對象，采用的操作步驟有所差異，該研究發(fā)現(xiàn)毛紅椿AFLP酶切與連接一步法和兩步法無差別，因此選擇一步法作為實(shí)驗(yàn)步驟。對PCR擴(kuò)增所需模板稀釋倍數(shù)進(jìn)行研究，尤其對預(yù)擴(kuò)增稀釋倍數(shù)研究，直接影響著選擇性擴(kuò)增的結(jié)果。預(yù)擴(kuò)增作為選擇性擴(kuò)增的模板，不稀釋或稀釋倍數(shù)較小，模板濃度過高，導(dǎo)致選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物聚集，聚丙烯酰胺凝膠難以區(qū)分。稀釋倍數(shù)過大，導(dǎo)致擴(kuò)增條帶發(fā)虛，不整齊，對數(shù)據(jù)的記錄造成困難，因此摸索出合理的稀釋倍數(shù)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。

AFLP引物中，3′末端選擇性核苷酸數(shù)目對AFLP擴(kuò)增譜帶有很大影響，理論上，每增加1個(gè)選擇性堿基，將只擴(kuò)增限制性片段的1/4，而在兩個(gè)引物上都有3個(gè)選擇性堿基的情況下，則獲得1/4096的片段，一般情況下，選擇性堿基數(shù)不超過3個(gè)。另外，選擇性堿基數(shù)目還與基因組大小有關(guān)，大于106 bp的基因組可選用3個(gè)選擇性堿基，105~106bp的基因組可用2個(gè)選擇性堿基[25]。姜志艷[26]對蒙古黃芪(Astragali membranaceus)AFLP分子標(biāo)記研究，從36對引物組合(“2+2”“2+3”“3+3”)篩選出5對“2+3”多態(tài)性引物。本研究從64對引物組合中篩選獲得4對多態(tài)性引物，在群體中多態(tài)性較高，但是獲得的多態(tài)性引物較少，因此今后對于毛紅椿AFLP引物的篩選中，可以考慮“2+2”“2+3”引物組合，進(jìn)一步篩選更多的、多態(tài)性高的引物組合，用于毛紅椿遺傳分析。

PCR過程中所用到的Taq酶對實(shí)驗(yàn)成敗至關(guān)重要，實(shí)驗(yàn)前期從同一廠家購買的普通Taq酶，所得到的圖譜條帶模糊，難以辨認(rèn)，因此需要采用較高質(zhì)量的Taq酶。這一研究結(jié)果與明軍[22]、吳昊[24]、李雪萍[17]的研究結(jié)果一致，不同廠家的酶甚至不同批次的Taq酶對AFLP指紋式樣都會有影響。

AFLP在珍稀瀕危植物中廣泛應(yīng)用，能較好地?cái)U(kuò)增出多態(tài)性條帶，如對瀕危物種海菜花(Ottelia acuminate)[27]和珙桐[14]的遺傳多樣性分析中，分別使用了6對和7對AFLP引物，擴(kuò)增得到的多態(tài)性性位點(diǎn)百分率都較高，證明AFLP分子標(biāo)記在遺傳多樣性、親緣關(guān)系和輔助育種方面具有巨大的研究潛力。該研究從64對引物組合中篩選出4條多態(tài)性引物組合，共擴(kuò)增出147個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)122個(gè)，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率84.36%，可用于后續(xù)毛紅椿AFLP分子標(biāo)記遺傳多樣性分析。AFLP分子標(biāo)記還可以作為挖掘特異性識別位點(diǎn)的分子標(biāo)記，如楊丹[28]利用AFLP對紅三葉(Trifolium pratense)雜交F1代群體的抗、感白粉病單株進(jìn)行鑒定，辨別真假雜種，為分子輔助育種提供依據(jù)，因此利用AFLP開發(fā)特異性標(biāo)記可作為未來研究發(fā)展趨勢[29]。