宋其巖，陳友吾，李元春，葉碧歡，沈建軍，胡傳久，楊希宏，李海波

(1 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，杭州，310023；2 玉環(huán)市自然資源和規(guī)劃局，浙江玉環(huán)，317606；3玉環(huán)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村和水利局，浙江玉環(huán)，317606)

中國(guó)是柚類Citrusgrandis(C.maxima)起源中心之一，栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，形成了包括福建、浙江、臺(tái)灣的東南沿海柚產(chǎn)區(qū)，以廣西及廣東為主的華南柚產(chǎn)區(qū)，以四川、重慶、湖南、貴州為主的西南柚產(chǎn)區(qū)[1]。我國(guó)柚類的遺傳資源高度多樣化，大致分為沙田柚、文旦柚和雜種柚3個(gè)品種群，同時(shí)具有特早熟、早熟、中熟和晚熟配套的柚類資源結(jié)構(gòu)[2]。特早熟玉環(huán)柚“早玉文旦”是從普通玉環(huán)柚“玉環(huán)文旦”芽變中選育出的優(yōu)良新品種[3]。與普通玉環(huán)柚相比，“早玉文旦”可以提早一個(gè)半月上市，含糖高，化渣性好，酸甜適中，豐產(chǎn)性，適應(yīng)性強(qiáng)。柚類品種的鑒別手段包括葉片(果實(shí))的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方法[4]以及高光譜成像技術(shù)[5-6]，這些方法存在準(zhǔn)確度不高、成本較高且耗時(shí)耗力、計(jì)算工作量繁瑣且穩(wěn)定性較低的缺陷。基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD和ISSR[7]、SNP基因分型[8]、SRAP[9-11]和SSR(微衛(wèi)星)[12]也相繼用于柚類品種的親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析，但RAPD、ISSR和SRAP引物的特異性不高，重復(fù)性較差；盡管目前的技術(shù)獲得SNP位點(diǎn)較易，但單個(gè)SNP位點(diǎn)最多只有4種變異，多態(tài)信息含量也不高。因此這些分子生物學(xué)技術(shù)也并非柚類品種鑒別的理想選擇。生產(chǎn)上，“早玉文旦”和“玉環(huán)文旦”需等到掛果后才可以鑒別。近幾年，隨著“早玉文旦”種苗需求的增加，市場(chǎng)上與“玉環(huán)文旦”混雜或直接用“玉環(huán)文旦”冒充的現(xiàn)象屢見不鮮，因此迫切需要開發(fā)“早玉文旦”的早期鑒別技術(shù)。

SSR(Microsatellite，微衛(wèi)星)為共顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性豐富、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在DNA指紋圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析、基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等方面得到廣泛應(yīng)用[13]。熒光SSR標(biāo)記是基于DNA測(cè)序平臺(tái)的毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法，是以不同顏色的熒光基團(tuán)(如FAM、HEX、TAMRA等)來標(biāo)記一對(duì)SSR引物中的一個(gè)引物末端，利用熒光檢測(cè)器對(duì)產(chǎn)物檢測(cè)，自動(dòng)識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，具有快速、高效、精確、靈敏等技術(shù)優(yōu)勢(shì)。因此，本研究擬利用熒光SSR標(biāo)記技術(shù)揭示“早玉文旦”和“玉環(huán)文旦”的基因型差異，對(duì)于“早玉文旦”品種鑒別與知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料特早熟玉環(huán)柚“早玉文旦”和普通玉環(huán)柚“玉環(huán)文旦”無性系來自浙江省玉環(huán)市苔山塘文旦柚基地，采集時(shí)間為2021年4月。每個(gè)品種均采集3株，每株取2片幼嫩葉，混合后放置于密封袋，硅膠干燥保存，至完全干燥后提取基因組DNA。

1.2 主要試劑與儀器植物基因組DNA提取試劑盒(BioTeke，北京)、2×T5 Super PCR Mix(PAGE)(TSINGKE，北京)、pMD-18T載體(TAKARA，大連)等。在SSR正向引物上加注的熒光染料是FAM(藍(lán))和HEX(綠)，SSR引物由TSINGKE公司合成。毛細(xì)管電泳檢測(cè)內(nèi)標(biāo)試劑是Hi-DiTMFormamide(Applied Biosystems)、GeneScanTM-500 LIZ Size Standard(Applied Biosystems)。PCR儀(Life ECO，Bioer，杭州；Veriti 9902，ABI，USA)、DNA分析儀(ABI 3730 XL Genetic Analyzer，Applied Biosystems，USA)、NanoDrop 2000(Thermo Scientific，USA)等。

1.3 基因組DNA提取將各品種的幼嫩葉片混合粉碎，取混合樣提取基因組DNA。DNA提取方法參照植物基因組DNA提取試劑盒的操作說明。提取后的DNA測(cè)定濃度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SSR-PCR分析SSR標(biāo)記Cg_U110來源于對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中柚類C.maxima的轉(zhuǎn)錄組unigenes篩選，CT02來源于Barkley等[14]的報(bào)道(見表1)。

表1 用于柚類品種“早玉文旦”和“玉環(huán)文旦”鑒別的SSR標(biāo)記引物

Cg_U110獨(dú)立標(biāo)記的20 μL SSR-PCR擴(kuò)增體系為：2×T5 Super PCR Mix(PAGE)10 μL，熒光標(biāo)記(FAM)的正向引物Cg_U110F和反向引物Cg_U110R(均為10 μmol·L-1)各為1.5 μL，DNA模板(20 ng·μL-1)3 μL，加ddH2O補(bǔ)齊到20 μL；PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min后；98 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共30個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃補(bǔ)平2 min，終止溫度為4 ℃。

CT02獨(dú)立標(biāo)記的SSR-PCR擴(kuò)增體系同上，其中熒光標(biāo)記(FAM)的正向引物CT02F和反向引物CT02R(均為10 μmol·L-1)各為1.5 μL，退火溫度為55.5 ℃。

Cg_U110和CT02組合標(biāo)記的25 μL多重SSR-PCR擴(kuò)增體系為：2×T5 Super PCR Mix(PAGE)12.5 μL，熒光標(biāo)記(FAM)的正向引物Cg_U110F和反向引物Cg_U110R(均為10 μmol·L-1)分別為0.65 μL和0.4 μL，熒光標(biāo)記(HEX)的正向引物CT02F和反向引物CT02R(均為10 μmol·L-1)分別為0.45 μL和0.5 μL，DNA模板(30 ng·μL-1)3 μL，加ddH2O補(bǔ)齊到25 μL。優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性2 min后；98 ℃變性10 s，56.3 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共35個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃補(bǔ)平2 min，終止溫度為4 ℃。

1.5 毛細(xì)管電泳檢測(cè)內(nèi)標(biāo)配制：參照油茶品種SSR鑒別報(bào)道的方法[15-16]和多花黃精SSR分子標(biāo)記報(bào)道的方法[17]。具體為：取10 mL Hi-Di 和80 μL GeneScanTM-500 LIZ Size Standard混勻，離心，以每孔10 μL分裝于96孔內(nèi)標(biāo)板，離心。將SSR-PCR產(chǎn)物電泳，根據(jù)電泳膠圖做一定稀釋(最低可檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為0.1 ng/μL)，離心。取稀釋產(chǎn)物0.5 μL加入到分配好的內(nèi)標(biāo)板中，混勻，離心，放入PCR儀，于96 ℃變性5 min。20 ℃下迅速冷凍2 min，離心。置入DNA分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。用Data Collection 3.0軟件收集數(shù)據(jù)。

1.6 Cg_U110標(biāo)記的單克隆測(cè)序采用DNA凝膠回收試劑盒從1.5%瓊脂糖凝膠中回收2個(gè)柚類品種Cg_U110標(biāo)記的PCR擴(kuò)增片段，回收產(chǎn)物用pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后，每個(gè)樣品均隨機(jī)挑選16個(gè)陽(yáng)性單克隆交付杭州有康生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。

1.7 數(shù)據(jù)分析用GeneMapper 4.1軟件對(duì)Data Collection 3.0軟件收集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。軟件系統(tǒng)將根據(jù)目標(biāo)峰的位置與同一泳道中的內(nèi)標(biāo)GeneScanTM-500 LIZ Size Standard進(jìn)行比較，直接給出目標(biāo)SSR片段大小的準(zhǔn)確數(shù)值(bp)。純合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X為該等位變異的數(shù)值大?。浑s合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y為該位點(diǎn)2個(gè)不同等位變異的數(shù)值大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cg_U110和CT02獨(dú)立標(biāo)記鑒別基于柚類物種C.maxima的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，識(shí)別unigenes中的SSR位點(diǎn)，并進(jìn)一步設(shè)計(jì)SSR引物，以篩選出可用于柚類品種鑒別的SSR標(biāo)記。通過對(duì)40對(duì)SSR熒光引物的PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，29對(duì)引物可以擴(kuò)增出清晰明亮、穩(wěn)定的SSR條帶。收集SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，其中的24對(duì)引物能夠擴(kuò)增出目標(biāo)重復(fù)序列。對(duì)24對(duì)SSR熒光引物的PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，僅Cg_U110標(biāo)記在“玉環(huán)文旦”和“早玉文旦”二個(gè)品種間擴(kuò)增出了差異性的基因型，即“玉環(huán)文旦”為253/259，而“早玉文旦”為259/262。為進(jìn)一步篩選可鑒別“玉環(huán)文旦”與“早玉文旦”的多態(tài)性SSR標(biāo)記，對(duì)Barkley等[14]報(bào)道的18對(duì)SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，結(jié)果顯示僅CT02標(biāo)記在“玉環(huán)文旦”與“早玉文旦”品種間擴(kuò)增出了不同的基因型，即“玉環(huán)文旦”為136/136，而“早玉文旦”為136/140。這表明，SSR標(biāo)記Cg_U110和CT02皆可作為分子特異性SSR指紋來鑒別“玉環(huán)文旦”與“早玉文旦”。

2.2 Cg_U110標(biāo)記的測(cè)序驗(yàn)證對(duì)2個(gè)品種Cg_U110標(biāo)記單克隆測(cè)序結(jié)果顯示，“玉環(huán)文旦”的CCA重復(fù)基序有二種，分別為(CCA)7和(CCA)4；TCC重復(fù)基序也有二種，分別為(TCC)6和(TCC)7?！霸缬裎牡钡腃CA重復(fù)基序有一種，為(CCA)7；TCC重復(fù)基序有二種，分別為(TCC)7和(TCC)6(見圖1)。“玉環(huán)文旦”的基因型為255/261，“早玉文旦”的的基因型為261/264。這一結(jié)果與毛細(xì)管電泳檢測(cè)出的結(jié)果(253/259和259/262)基本一致，僅有2個(gè)堿基的誤差。

圖1 Cg_U110標(biāo)記在2個(gè)柚類品種的DNA序列及基因型

2.3 Cg_U110和CT02組合標(biāo)記鑒別為提高“玉環(huán)文旦”和“早玉文旦”的鑒別效率，進(jìn)一步建立了Cg_U110和CT02標(biāo)記的多重SSR-PCR擴(kuò)增體系。通過對(duì)反應(yīng)體系和退火溫度的優(yōu)化，確定了在25 μL的多重PCR反應(yīng)體系中，Cg_U110F/Cg_U110R(10 mol·L-1)的體積配比為0.65 μL/0.4 μL，CT02F/CT02R(10 mol·L-1)的體積配比為0.45 μL/0.55 μL；最適退火溫度為56.3 ℃。擴(kuò)增結(jié)果顯示，2個(gè)柚類品種在SSR位點(diǎn)CT02和Cg_U110可擴(kuò)增出2種不同的基因型組合，即“玉環(huán)文旦”為136/136和255/261，而“早玉文旦”為136/140和261/264(見圖2)。為保證多重PCR結(jié)果的可靠性，在56.3 ℃的退火溫度下，分別使用了來自不同公司的PCR反應(yīng)酶(TSINGKE，北京和TAKARA，大連)和PCR擴(kuò)增儀(Life ECO，Bioer，杭州和Veriti 9902，ABI，USA)，均顯示擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、可重復(fù)?？梢?，Cg_U110和CT02標(biāo)記可作為分子特異性SSR指紋組合通過上述多重SSR-PCR擴(kuò)增體系來鑒別“玉環(huán)文旦”與“早玉文旦”。

圖2 Cg_U110和CT02引物組合擴(kuò)增的2個(gè)柚類品種基因型

3 討論

良種是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，優(yōu)良品種的選育工作對(duì)于高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。柚類植物為木本果樹，新品種的選育不僅需財(cái)力支持，更需要投入大量的時(shí)間和精力。有效保護(hù)好選育的新品種，才會(huì)調(diào)動(dòng)育種者的積極性，有利于育種技術(shù)的持續(xù)創(chuàng)新和優(yōu)良新品種的不斷選育[18]。

“早玉文旦”是從“玉環(huán)文旦”芽變中選育出的新品種。果樹芽變的實(shí)質(zhì)是體細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，包括染色體結(jié)構(gòu)數(shù)目的變異和基因突變。由于芽變品種與芽變母本的遺傳背景幾乎一致，常規(guī)的分子標(biāo)記并不一定能覆蓋到變異位點(diǎn)，芽變品種鑒別的難易程度與變異類型和變異程度有很大關(guān)系。利用RAPD和SSR分子標(biāo)記，“沙田柚”(C.maxima)的芽變品種“真龍柚”被成功鑒定[19]。利用ISSR和SRAP分子標(biāo)記，皮球桃(Prunuspersica)的黃肉微小芽變品種被成功鑒定[20]。本研究對(duì)柚類轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行大量篩選，僅獲得1個(gè)可用于“早玉文旦”和“玉環(huán)文旦”鑒別的核心SSR標(biāo)記Cg_U110，表明“早玉文旦”與芽變母本“玉環(huán)文旦”具有幾乎一致的遺傳背景，遺傳差異很小，也證明了“早玉文旦”確實(shí)為“玉環(huán)文旦”的自然突變體，而非環(huán)境引起的飾變。果樹芽變品種鑒別的工作量和難度均較大，隨著越來越多的物種被基因組測(cè)序，以及測(cè)序技術(shù)的不斷更新，除了通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得SSR位點(diǎn)外，也可通過SNP位點(diǎn)或基因組重測(cè)序，從全基因組范圍內(nèi)挖掘變異位點(diǎn)，用于果樹芽變品種的鑒別[21]。

與普通PCR法相比，多重?zé)晒釶CR技術(shù)的應(yīng)用不僅可提高工作效率，也減少了各種試劑和模板DNA的用量。在多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系中的引物可以用不同顏色的基團(tuán)(FAM、HEX、NED、PET等)進(jìn)行修飾，只要擴(kuò)增片段的大小不重疊，在同一毛細(xì)管電泳的泳道中可檢測(cè)多達(dá)20對(duì)以上的擴(kuò)增片段，從而大幅度提高檢測(cè)效率[22]。本研究利用多重?zé)晒釶CR技術(shù)整合了核心SSR標(biāo)記Cg_U110和CT02的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了柚類良種“早玉文旦”的高效鑒別。

SSR標(biāo)記已被用于許多植物的DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建[23-30]，SSR標(biāo)記也是UPOV(國(guó)際植物新品種保護(hù)公約)推薦的DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建標(biāo)記。植物品種DUS(Distinctness，Uniformity，Stability，簡(jiǎn)稱DUS)測(cè)試指南是植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，是指導(dǎo)DUS測(cè)試開展工作的行動(dòng)指南[31]。在本研究基礎(chǔ)上，可以基于NCBI的轉(zhuǎn)錄組或基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，進(jìn)一步發(fā)掘更多的多態(tài)性SSR標(biāo)記，應(yīng)用于更多柚類品種的鑒別，并拓展到柚類品種分子標(biāo)記DUS測(cè)試指南研制和柚類品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建，為柚類新品種申請(qǐng)、測(cè)試與鑒定提供補(bǔ)充依據(jù)。

4 結(jié)論

基于柚類物種C.maxima的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)篩選出了多態(tài)性SSR標(biāo)記Cg_U110和CT02，利用多重?zé)晒釶CR技術(shù)將Cg_U110和CT02整合應(yīng)用，母本品種“玉環(huán)文旦”及其芽變品種“早玉文旦”在這2個(gè)SSR位點(diǎn)(Cg_U110和CT02)分別擴(kuò)增出2種不同的基因型組合，即255/261//136/136和261/264//136/140，可一次性鑒別2個(gè)柚類品種。本研究為“早玉文旦”優(yōu)良柚類品種的早期鑒別與知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供了高效便捷的分子手段。