張 銘，寧少華，高 茜，謝 憲，程 元，梁 軍*

(1. 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護研究所，國家林業(yè)和草原局森林保護學重點實驗室，北京 100091；2. 北京市西山試驗林場，北京 100093)

松枯梢?。ㄓ置缮铱莶?shoot blight of pine）是世界范圍內針葉樹種上分布最廣最常見的重要林木枝干病害之一[1]。自從我國自20世紀70年代末報道以來，松枯梢病已蔓延至黑龍江、吉林、遼寧、陜西、江蘇、湖北、福建、安徽、江西、廣東和廣西等10余個省份[2]，嚴重危害松屬（Pinus）、冷杉屬（Abies）、落葉松屬（Larix）、崖柏屬（Thuja）、雪松屬（Cedrus）、刺柏屬（Juniperus）、云杉屬（Picea）和黃杉屬（Pseudotsuga）約8屬60多種針葉樹種[3]。前期研究發(fā)現的森吉木霉（Trichoderma songyi）M75菌株的無菌發(fā)酵濾液對赤松枯梢病病原菌松球殼孢菌（Sphaeropsis sapinea）具有較好的抑菌活性[4]，如果能繼續(xù)優(yōu)化提高森吉木霉M75的抑菌活性，這一菌株在病害防治領域的應用將大有前景。但目前還未見有關森吉木霉M75的發(fā)酵優(yōu)化研究。響應面優(yōu)化（Response Surface method）是最常見的應用于真菌發(fā)酵領域的研究方法[5]。這種方法比單因素試驗和正交分析試驗更全面，利用擬合因素和相應值之間的多元二次函數關系[6]，通過3D曲面圖和2D等高線圖直觀的展示出各因子之間的交互作用，而非簡單的線性關系[7]，其最大的優(yōu)勢是大大減少了試驗次數，利用合理的理論范圍內較少的試驗數據得到最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)條件，減輕了發(fā)酵優(yōu)化的工作量[8]，也提高了優(yōu)化的準確性和合理性[9]，是目前發(fā)酵領域應用最多的一種實驗設計和統(tǒng)計分析方法[10]。本研究通過Plackett-Burman試驗從眾多因素中篩選得到顯著影響抑菌活性的關鍵因子[11]，根據最陡爬坡試驗使關鍵因子的取值逐步逼近響應面的中心點[12]，最后利用響應面分析法中的中心復合設計（CCD法）確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配比[13]，最大程度的提高森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對松球殼孢菌的抑菌活性。本研究通過PB試驗、最陡爬坡以及響應面分析等多種試驗方法，更全面準確的尋求最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的配比及培養(yǎng)條件，進一步提高森吉木霉M75的抑菌效能，使生防菌株在松枯梢病的防治過程中得到更高效的利用，同時為今后大量獲取抑菌活性物質提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

松球殼孢菌（S. sapinea）由中國林業(yè)科學研究院菌種保藏中心提供。森吉木霉（T. songyi）M75由本實驗室分離篩選獲得，現保藏于中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號：CFCC54490。

1.2 試驗方法

1.2.1 森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液制備 將保藏的M75菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃活化5 d，用打孔器選取直徑5 mm菌餅，接入裝有250 mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r·min-1、28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d，10000 r·min-14 ℃離心10 min，棄沉淀，取上清液經0.45 μm無菌微孔濾膜過濾，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對松球殼孢菌的抑菌試驗方法 取1.5 mL1.2.1中得到的M75無菌發(fā)酵濾液，與加熱并冷卻至45～50 ℃的PDA培養(yǎng)基混合均勻并傾倒平板。待平板凝固后，在平板中央點接活化后的直徑5 mm的松球殼孢菌菌餅，以添加無菌水制備的平板作為對照。于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測量松球殼孢菌的菌落直徑。所有處理重復3次，抑菌率計算公式如下：

1.2.3 Plackett-Burman試驗確定顯著因素 利用Plackett-Burman設計[14]對影響森吉木霉M75菌株抑菌活性的8個因素進行顯著性篩選，包括葡萄糖（A）、胰蛋白胨（B）、硫酸鋅（C）、溫度（D）、轉速（E）、接種量（F）、裝液量（G）和培養(yǎng)時間（H）。各因素分別設置兩個水平，即高水平（+1）和低水平（-1），各因素水平值見表1。以森吉木霉M75發(fā)酵培養(yǎng)后的無菌發(fā)酵濾液對松球殼孢菌的抑菌率作為響應值（Y），設計12組試驗，每組試驗重復處理3次，抑菌率取3次平均值。

表1 Plackett-Burman 試驗設計中各因素的水平值Table 1 Levels of the variables of Plackett-Burman design

1.2.4 最陡爬坡試驗設計 在PB試驗的基礎上，對森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液抑菌活性有顯著影響的3個關鍵因素進行最陡爬坡試驗，使各因素響應值進一步逼近最優(yōu)區(qū)域并確定CCD設計的中心點[15]。對所得試驗數據進行統(tǒng)計分析確定出擬合方程后，依據系數的正負和大小確定3個顯著因素的最陡爬坡，其中3個關鍵因素對無菌發(fā)酵濾液抑菌活性的正負值決定了爬坡方向，3個關鍵因素在方程中的相應系數的大小決定爬坡步長值[16]。賦響應值（Y）為森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對松球殼孢菌的抑菌率（%）。共設計7組爬坡試驗，各組重復檢測3次，對所得結果取平均值計算抑菌率。

1.2.5 中心復合設計（Central Composite Design，CCD） 根據PB試驗確定影響抑菌率的關鍵因素、最陡爬坡試驗確定了關鍵因素取值的中心試驗點之后，利用中心復合設計法（Central Composite Design，CCD）建立3因素5水平的響應面模型[17]，賦響應值Y為森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對松球殼孢菌的抑菌率，共設計20組試驗，每組試驗重復處理3次，抑菌率取3次平均值。利用Design Expert 11.0對試驗結果進行擬合回歸分析，建立二次回歸方程，通過響應面分析方法擬合出抑菌率的最大響應值，從而得到使森吉木霉M75的無菌發(fā)酵濾液達到最大抑菌活性的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件。

1.3 模型驗證與數據統(tǒng)計分析

將森吉木霉M75分別置于利用響應面模型擬合出的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，每組試驗重復處理3次，測定優(yōu)化培養(yǎng)基下的無菌發(fā)酵濾液對松球殼孢菌的抑菌率，驗證試驗值與模型的理論值是否相一致，對模型的可靠性和有效性進行分析和驗證[18]，從而得出最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配比，并對優(yōu)化前后森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液的抑菌率進行比較。采用Design Expert 11.0、SPSS 26.0和Excel 2010軟件對實驗數據進行統(tǒng)計和分析。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗篩選顯著影響因子

通過PB試驗設計（N=12），對葡萄糖（A）、胰蛋白胨（B）、硫酸鋅（C）、溫度（D）、轉速（E）、接種量（F）、裝液量（G）和培養(yǎng)時間（H）8個因素進行二水平試驗，試驗設計組合及結果見表2，PB試驗效應評價及顯著性分析見表3。

由結果可知，在第11組試驗中，森吉木霉M75發(fā)酵濾液對松球殼孢菌的抑菌效果最好，抑菌率達到77.33%（表2）。8個因子的顯著性排序為溫度>葡萄糖>轉速>裝液量>硫酸鋅>胰蛋白胨>接種量>培養(yǎng)時間，其中溫度、葡萄糖、轉速的顯著性位于前三位，即溫度（D）>葡萄糖（A）>轉速（E），且P值均小于0.05，說明這3個因素為關鍵因素，能顯著影響森吉木霉M75的無菌發(fā)酵濾液的抑菌活性，表明其是構建響應面模型的主要影響因子，將這3個因素作為主要考慮因素進行下一步試驗。其中，在選擇的二水平范圍內，溫度（D）對抑菌活性具有負效應，葡萄糖（A）和轉速（E）具有正效應（表3）。

表2 Plackett-Burman試驗組合及結果Table 2 Design and corresponding results of Plackett-Burman experiment

表3 Placket-Burman試驗效應評價Table 3 Evaluation of placket-Burman test effect

標準化效應的帕累托圖（圖1）顯示從最大效應到最小效應的標準化效應的絕對值。在Pareto圖中，溫度（D）、葡萄糖（A）轉速（E）跨越了t= 3.182的參考線，表示這3個因素在a=0.05水平上具有顯著性，Pareto圖結果與PB試驗效應評價中的顯著性結果相一致。對PB試驗結果進行擬合方程回歸分析，得到多元一次方程：Y=64.686 + 2.884 A - 0.417 B + 0.743 C - 5.811 D+ 2.136 E - 0.071 F - 0.862 G + 0.056 H。該方程的決定系數（R2）= 0.9913，表明該方程擬合良好。由方程可知，溫度（D）的系數為負，提示溫度的取值對抑菌率的影響效應為負，應逐步降低溫度的取值；而葡萄糖（A）和轉速（E）的系數皆為正值，說明增大這兩個關鍵變量的取值對抑菌率的影響效應為正，應逐步提高葡萄糖的添加量，并相應的提高轉速。

圖1 標準化效應的帕累托圖Fig. 1 Pareto plot of standarized effects

2.2 最陡爬坡試驗結果

根據PB試驗中得到多元一次方程，其系數值決定了最陡爬坡試驗中的爬坡方向和爬坡變化的步長值。其中葡糖糖（A）和轉速（E）系數為正，說明增大這兩個關鍵變量的取值時對響應值抑菌率的影響為正效應，應增大這兩個關鍵變量的取值，而溫度（D）的系數為負，提示溫度的取值對響應值抑菌率的影響效應為負，應逐步降低溫度。其他非顯著性因素的取值保持不變。共設計7組最陡爬坡試驗（表4），第4組中森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對松球殼孢菌的抑菌率最高，即當葡糖糖（A）為2.75%，溫度（D）為31 ℃，轉速（E）為195 r·min-1時，抑菌活性達到最優(yōu)，即在中心試驗點附近，以上述條件作為CCD中心點進行響應面試驗。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Table 4 Design and corresponding results of the steepest ascent experiment

2.3 中心組合CCD設計

以PB試驗中篩選出的3個關鍵因素和最陡爬坡試驗確定的最優(yōu)中心點進行森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液的中心復合試驗設計（Central Composite Design，CCD）。其中，將3個關鍵因素設置為5個水平梯度（-1.68、-1、0、1、1.68），試驗因素及水平如表5所示，試驗設計及結果如表6所示。對表6中的試驗結果進行二次回歸，得到的擬合方程如下：

表5 中心組合（CCD）試驗變量及水平Table 5 Variables and levels for central composite design

表6 中心組合（CCD）試驗設計及結果Table 6 Design and results of central composite design（CCD）

Y= 82.02 + 3.12A + 2.23D - 2.09E - 1.59AD+ 2.56 AE + 1.95DE - 3.76 A2- 8.33 D2- 2.95 E2，其中Y為森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對松枯梢病原菌的抑菌率，A為葡萄糖，D為溫度，E為轉速。

對擬合的回歸方程進行方差分析，結果如表7所示，該回歸方程模型的F值為32.93，P<0.0001，表明模型極顯著，而失擬項Lack of Fit反映試驗數據與模型不相符的情況，失擬項F值為2.97，P值為0.1284>0.05，表示失擬項是不顯著的，這表示方程擬合較好，模型穩(wěn)定且選擇正確。模型決定系數R2= 0.9674，說明整體情況的96.74%可以用此模型來解釋，調整后的相關性決定系數AdjR2= 0.9380，預測R2= 0.8005，進一步表明所擬合的模型具有較高的穩(wěn)定性，對實際情況擬合程度良好，可以對森吉木霉無菌發(fā)酵濾液的抑菌活性的變化提供一個合適的模型，也說明各試驗因素對抑菌率的影響并不是呈現簡單的線性規(guī)律，而是二次函數關系。

表7 中心組合試驗設計擬合模型的方差分析Table 7 Analysis of variance (ANOVA) for the quadratic model of central composite experimental design

2.4 中心組合CCD結果分析

對擬合的回歸模型，使用Design Expert 11.0軟件繪制響應的3D響應面分析圖及對應的2D等高線圖，來探究葡萄糖、溫度與轉速之間的相互關系對抑菌活性的影響及在得到最高響應值（即最大抑菌率時），3個因素的取值（圖2～4）。2D等高線圖是回歸方程的圖形表達形式，即用圖形語言對各因素的交互關系及最優(yōu)化條件下的變量進行相關解釋，可直觀的展示出兩因素之間的相互作用及最大響應值對應的各因素的最佳水平。一般情況下3D曲面越明顯彎曲，2D等高線圖越陡，則說明兩因素之間關系越顯著，反之，若3D曲面不明顯，2D等高線圖越接近于圓形，則說明兩因素之間關系不顯著。

2.4.1 葡萄糖與溫度的交互作用 如圖2所示，在轉速（E）處于零水平時，葡萄糖（A）與溫度（D）交互的2D等高線圖曲度較緩，呈近似圓形的橢圓形，表示葡萄糖與溫度交互作用不顯著。這與方差分析表7中的結果相一致（PA*D= 0.0763>0.05）。

圖2 葡萄糖和溫度交互作用效應影響森吉木霉M75抑菌活性的3D響應曲面圖和2D等高線Fig. 23D response surface plot and 2D contour plot of the interaction effect of glucose and temperature on the antibacterial activity of T. songyi M75

2.4.2 葡萄糖與轉速的交互作用 如圖3所示，在溫度（D）處于零水平時，葡萄糖（A）與轉速（E）交互的2D等高線圖曲度較陡，呈明顯的橢圓形，表示葡萄糖與溫度交互作用顯著，與方差分析表7中的結果相一致（PA*E= 0.0099<0.05）。

圖3 葡萄糖和轉速交互作用效應影響森吉木霉M75抑菌活性的3D響應曲面圖和2D等高線Fig. 33D response surface plot and 2D contour plot of the interaction effect of glucose and rotating speed on the antibacterial activity of T. songyi M75

2.4.3 溫度與轉速的交互作用 如圖4所示，在葡萄糖（A）處于零水平時，溫度（D）與轉速（E）交互的2D等高線圖曲度較陡，呈明顯的橢圓形，表示溫度與轉速二者之間的存在顯著的交互作用效果，與表7中的方差檢驗結果一致（PD*E=0.0360<0.05）。

圖4 溫度和轉速交互作用效應影響森吉木霉M75抑菌活性的3D響應曲面圖和2D等高線Fig. 43D response surface plot and 2D contour plot of the interaction effect of temperature and rotating speed on the antibacterial activity of T. songyi M75

2.5 模型驗證分析

對響應面優(yōu)化模型及結果可靠性進行3次重復試驗驗證，抑制率均值為81.50%，與模型預測的理論值十分接近，說明該模型的設計具有可靠性。而優(yōu)化前的抑菌率只有74.47%，優(yōu)化后森吉木霉M75的無菌發(fā)酵濾液的抑菌率提高了9.44%，松球殼孢菌在帶菌平板上的菌落直徑只有1.45 cm，比優(yōu)化前縮減了27.5%，菌落的生長受到更明顯的抑制（圖5）。這也證明了利用中心復合設計法所得到的二次回歸方程模型的有效性，證明了利用響應面法優(yōu)化森吉木霉M75的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件是準確、有效且可行的。

圖5 森吉木霉M75無菌發(fā)酵濾液對松枯梢病原菌的抑菌效果Fig. 5 Ihibition activities of sterile culture filtrates produced by T. songyi M75 against S. sapinea

3 討論

培養(yǎng)條件的優(yōu)化是微生物實現大批量工業(yè)化生產必不可少的環(huán)節(jié)之一，而不同的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配比對微生物代謝產物的產量密切相關[19]。利用響應面分析法這種優(yōu)化試驗條件的科學統(tǒng)計方法，可以準確的利用較少的試驗數據模擬出使目標對象達到最優(yōu)值時的各因素的條件[20]，可以有效提高優(yōu)化效率與試驗進程[21]。通過改善和優(yōu)化森吉木霉M75的初始培養(yǎng)基配比及培養(yǎng)條件等，使它的無菌發(fā)酵濾液對松球殼孢菌的抑菌率達到了81.50%，大大提高了抑菌活性，說明利用響應面分析法優(yōu)化森吉木霉產抑菌活性物質的發(fā)酵條件是有效可行的。本研究利用PB試驗篩選出關鍵組分，使關鍵因素的取值逐步逼近中心點，最后利用CCD中心復合設計找到最優(yōu)點，這些因素之間并不是相互獨立影響抑菌活性，他們之間的交互作用可能會使抑菌活性有所增減[22]。中心復合設計結果表明，在葡萄糖、溫度與轉速3個關鍵因素之間，葡萄糖與溫度之間的交互作用不顯著，說明單純增加葡萄糖的含量，提高溫度，不提升轉速，液體培養(yǎng)基中的充足的糖分和氧氣得不到有效利用，就限制了森吉木霉M75產抑菌物質的產量，影響了抑菌活性。而葡萄糖與轉速兩關鍵因子之間的交互作用顯著，溫度與轉速兩關鍵因子之間的交互作用也是顯著的，表明在合適的轉速水平上，液體培養(yǎng)基中的糖分和氧氣能被森吉木霉M75菌株得到充分的分解和利用，提高了抑菌物質的產量，從而使此時的無菌發(fā)酵濾液對松球殼孢菌的抑制效果達到最優(yōu)水平。本研究尋求到的適合森吉木霉M75發(fā)酵優(yōu)化的培養(yǎng)基配比及培養(yǎng)條件，為森吉木霉M75菌株作為生防菌株，進行后續(xù)的開發(fā)利用提供了理論基礎，為其生防菌劑的開發(fā)提供了理論支撐。

4 結論

在實驗室條件下獲得一株對赤松枯梢病病原菌松球殼孢菌具有顯著拮抗作用的森吉木霉菌株M75，通過響應面法明確其最優(yōu)抑菌活性的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：葡萄糖2.75%，胰蛋白胨1.2%，硫酸鋅0.2%，馬鈴薯浸汁1000 mL，溫度31.0 ℃、轉速195 r·min-1，接種量5%，裝液量180 mL，發(fā)酵培養(yǎng)5 d。優(yōu)化后無菌濾液對赤松枯梢病病原菌的抑制率達到81.50%，比優(yōu)化前提高了約10%，病原菌菌落擴展直徑從優(yōu)化前的2.0 cm縮減至為1.45 cm，比優(yōu)化前降低了27.5%，抑菌效果得到了大幅提高。