段達(dá)榮，蔡莎莎，林芯伊

（臺州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 臺州 318020）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見的惡性腫瘤，是危害人類健康的主要惡性腫瘤之一[1]，在西方發(fā)達(dá)國家中高發(fā)。隨著我國人們生活水平提高，結(jié)直腸癌發(fā)病率亦逐年上升，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，普遍認(rèn)為結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與遺傳和環(huán)境等多種因素導(dǎo)致基因改變有關(guān)[2-4]。結(jié)直腸癌患者5 年生存率為50%～60%，早期準(zhǔn)確診斷對提高患者的生存率至關(guān)重要。但是目前對結(jié)直腸癌尚缺乏較好的早期診斷和療效判斷指標(biāo)。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-Seq）分析假基因POU5F1B（POU domain class 5 transcription factor 1B，POU5F1B）與結(jié)直腸癌的發(fā)生的關(guān)系，旨在為臨床診斷和治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017 年1 月-2021 年10 月臺州市第一人民醫(yī)院收治的進(jìn)行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的143 例結(jié)直癌患者臨床病理資料及術(shù)后標(biāo)本。其中男90 例，女53 例；年齡55～81 歲。所有直腸癌標(biāo)本經(jīng)病理檢查證實(shí)為原發(fā)性直腸癌，癌旁組織標(biāo)本為距離腫瘤2 cm 外的結(jié)直腸組織，病理組織學(xué)檢查均證實(shí)為無癌變。本研究經(jīng)本院倫理委員會通過，患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)直腸癌診斷符合《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2017 年版）》標(biāo)準(zhǔn)[5]。②所有的患者均為初診，且按標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)直癌手術(shù)治療；③術(shù)后的病理診斷證實(shí)為結(jié)直腸癌，同時根據(jù)AJCC 第7 版TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型；④采集樣本前患者未接受任何靶向抗腫瘤、新輔助放化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者有血液病、其它部位的腫瘤或者其它部位轉(zhuǎn)移引起的結(jié)直腸癌等疾病不在本研究范圍。

1.3 儀器與方法

1.3.1 儀器 4 ℃、-20 ℃冰箱（青島海爾公司）；-80 ℃冰箱（日本三洋公司）；全自動圖像分析系統(tǒng)/凝膠成像儀RED（美國Proteinsimple 公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）。

1.3.1 RNA-Seq 檢測 收集原發(fā)性結(jié)直腸癌組織標(biāo)本、相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本送至北京諾禾致源科技股份有限公司應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-Seq）進(jìn)行檢測，使用cBioPortal for Cancer Genoics 軟件進(jìn)行分析。

1.2.2 免疫組化染色 將結(jié)直腸癌組織及癌旁組織切片常規(guī)脫蠟入水后進(jìn)行免疫組化染色，檢測POU5F1B 細(xì)胞的表達(dá)情況。免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟按二步法組化檢測試劑盒說明書進(jìn)行。一抗稀釋比例均為1∶100 以PBS 代替一抗為陰性對照。免疫組化染色具體步驟：組織及時適當(dāng)取材、充分固定，石蠟包埋、完整切片（厚度4～6 μm），載玻片需經(jīng)清洗和防脫片處理。放入70 ℃電熱恒溫干燥箱烤片1 h。石蠟切片脫蠟、水化。脫蠟要徹底，室溫較低時在37 ℃溫箱中進(jìn)行脫蠟或適當(dāng)延長時間。用PBS（pH7.4）沖洗3 次，5 min/次。EDTA 抗原修復(fù)液直接煮沸抗原修復(fù)法對組織進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。PBS 沖洗3 次，5 min/次。加入過氧化酶阻斷溶液，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS 沖洗3 次，5 min/次。加1～2 滴POU5F1B 抗體，放入專用孵育盒內(nèi)，在32 ℃水浴箱內(nèi)孵育1 h。PBS 沖洗3 次，5 min/次。加聚合物增強(qiáng)劑（第二抗體），放入專用孵育盒內(nèi)，在32 ℃水浴箱內(nèi)孵育30 min。PBS 沖洗3 次，5 min/次。加2 滴新鮮配制的DAB 溶液，在顯微鏡掌握顯色時間。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判定 在光鏡下結(jié)合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比判斷POU5F1B 蛋白陽性表達(dá)率。以腫瘤細(xì)胞胞漿上出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性表達(dá)，染色愈濃代表陽性表達(dá)愈強(qiáng)。選取背景清晰的視野，在100 倍顯微鏡下觀察，按組織染色深淺分為：未染色記作0分；淺黃色記作1 分；棕黃色記作2 分；棕褐色記作3 分。選取染色均勻的區(qū)域于400 倍顯微鏡下觀察，記錄5 個視野中陽性細(xì)胞的百分比，計算其平均值。按染色細(xì)胞的比例分為4 分：0～25%記作0 分；25%～50%記作1 分；50%～75%記作2 分；＞75%記作3 分。組織染色強(qiáng)度與染色細(xì)胞百分比級別之乘積：＜3 分為陰性，3～6 分為陽性，＞6 分為強(qiáng)陽性。應(yīng)用Imagepro-Plus6.0 圖像分析軟件對所有免疫組化指標(biāo)的染色強(qiáng)度及面積進(jìn)行計算分析。隨機(jī)選取3 個視野通過圖像分析軟件提取免疫組化指標(biāo)的積分光密度值（IOD），取其平均值代表POU5F1B 指標(biāo)的陽性表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料使用（n）表示。計量資料使用（）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 假基因POU5F1B 在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織中表達(dá)的比較 用RNA-Seq 檢測發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織有1520 個差異基因（上調(diào)基因有989 個，下調(diào)基因有531 個），同時發(fā)現(xiàn)POU5F1B 基因位于染色體8q24 上，在直腸癌組織、癌旁組織這兩組倍數(shù)變化（log2FoldChange）為4.544，兩組中表達(dá)差異的顯著性水平（-log10padj）為12.569，POU5F1B 基因?yàn)樯险{(diào)基因，并且顯著高于其它基因，結(jié)直腸癌組織與癌旁組織有顯著性差異（P＜0.05），見圖1。

圖1 RNA-Seq 檢測結(jié)直腸癌組織與癌旁組織不同基因表達(dá)火焰圖

2.2 結(jié)直腸癌及癌旁組織中假基因POU5F1B 表達(dá)情況 對143 例結(jié)直腸癌及癌旁組織進(jìn)行組化染色，根據(jù)免疫組化指標(biāo)的染色強(qiáng)度及面積進(jìn)行計算，結(jié)果癌組織中假基因POU5F1B 表達(dá)為（1.51±0.68），癌旁組織為（0.34±0.54），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），如圖2。

圖2 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中假基因POU5F1B表達(dá)情況

2.3 結(jié)直腸癌及癌旁組織假基因POU5F1B 組化染色情況 對癌旁組織及癌組織進(jìn)行組化染色，癌旁組織細(xì)胞胞漿不著色或淺黃色，為不表達(dá)或低表達(dá)，癌組織細(xì)胞胞漿呈棕黃色，占比約80%，為高表達(dá)，見圖3。

圖3 結(jié)直腸癌及癌旁組織POU5F1B 組化染色情況

3 討論

根據(jù)國際癌研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）2018 年公布數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌作為一種常見的癌癥在男女發(fā)病率分別排第3 名和第2 名[6]，死亡率占所有腫瘤死亡的8%。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，飲食的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，結(jié)直腸癌發(fā)病率在逐漸上升[7-9]。目前，結(jié)直腸癌治療方法主要有主要以手術(shù)和化療為主，但不可避免出現(xiàn)術(shù)后及化療后的復(fù)發(fā)，導(dǎo)致治療失敗，甚至患者死亡。研究顯示[10-12]，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可以導(dǎo)致結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)并對預(yù)后及生存產(chǎn)生影響。因此，如何預(yù)防治療過程中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對延長患者的生存時間意義重大。本研究顯示，假基因POU5F1B 在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存時間有關(guān)，其對預(yù)后有重要的臨床意義。

假基因POU5F1B 位于染色體8q24 上，具有促進(jìn)細(xì)胞生長和編碼功能蛋白的能力，與癌基因的激活、抑癌基因的失活、堿基錯配修復(fù)及修飾基因的突變等在細(xì)胞癌變過程中發(fā)揮重要作用，最終引起組織病理學(xué)的變化及相關(guān)基因、蛋白質(zhì)的改變[13-15]。假基因POU5F1B 是細(xì)胞多能性的主要調(diào)節(jié)劑，不僅在胚胎發(fā)生過程中而且在腫瘤發(fā)生過程中都發(fā)揮重要作用[16，17]。有研究表明假基因POU5F1B 的表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，只有在睪丸生殖細(xì)胞腫瘤中表現(xiàn)為正相關(guān)[18]，也有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)假基因POU5F1B 表達(dá)水平與胰腺癌和肝臟細(xì)胞癌的惡性程度均呈正相關(guān)[19]。Pan Y 等[20]也發(fā)現(xiàn)假基因POU5F1B 在肝癌細(xì)胞株中高表達(dá)，并且POU5F1B 表達(dá)水平與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)。本研究在結(jié)直腸癌患者中也發(fā)現(xiàn)假基因POU5F1B 在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高，表達(dá)高低與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)性，也與病情的轉(zhuǎn)歸呈相關(guān)性，說明POU5F1B 在結(jié)直腸癌表達(dá)機(jī)制與其它消化道腫瘤相似。在134 例患者中，無圍術(shù)期死亡發(fā)生，術(shù)后隨訪期間8 例發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，對這8 例患者結(jié)直腸癌組織進(jìn)行免疫組化染色，并應(yīng)用Imagepro-Plus6.0 圖像分析軟件對所有免疫組化指標(biāo)的染色強(qiáng)度及面積進(jìn)行計算分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織異常高于其它未發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移者，說明假基因POU5F1B 與病情的轉(zhuǎn)歸、預(yù)后、生存時間呈相關(guān)性，可以有效評估患者生存時間及手術(shù)治療方案。然而，假基因POU5F1B 表達(dá)高低是否還與其它因素（如腫瘤細(xì)胞的AKT 磷酸化）有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，假基因POU5F1B 在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中為上調(diào)基因，表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，臨床可用假基因POU5F1B 表達(dá)水平評估患者結(jié)直腸癌腫瘤的惡性種度。