孫夢(mèng)雯，莫曉峰，陳 櫻，王亞娟, ，仇 丹,

（1.寧波工程學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，浙江寧波 315211；2.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022）

淀粉是食品中主要的能量供應(yīng)物質(zhì)，也是極其重要的工業(yè)原料。天然淀粉往往通過改性來獲得一系列用于各種用途的功能特性，如溶解性、耐熱性、乳化性等。自從Caldwell 等首次申請(qǐng)淀粉與二羧酸酸酐反應(yīng)的專利以來，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者就開始了辛烯基琥珀酸淀粉酯（OSS）的相關(guān)研究。OSS 因具有更高的粘度、更好的糊狀透明度、凍融穩(wěn)定性和優(yōu)異的乳化性能，已廣泛被應(yīng)用于肉制品、飲料、制藥和微膠囊等領(lǐng)域。

芋頭是一類具有保健價(jià)值的根莖類食物，主要產(chǎn)于熱帶亞熱帶地區(qū)，被認(rèn)為是世界上第五大根作物。芋頭中淀粉含量豐富，約占干基重的70%～80%；芋頭淀粉顆粒小，粒徑只有1～5 μm，淀粉粒徑越小，經(jīng)辛烯基琥珀酸酐（OSA）酯化后的乳化性越強(qiáng)，穩(wěn)定油滴的能力也更強(qiáng)。另外，芋頭淀粉中直鏈淀粉含量低，膨脹性強(qiáng)，因此被廣泛應(yīng)用在食品和制藥工業(yè)。然而，芋頭產(chǎn)地是影響其中淀粉性能的因素之一。奉化芋頭為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，長(zhǎng)期以來備受矚目，項(xiàng)目組之前的研究表明，奉化芋頭淀粉的顆粒較其他品種及產(chǎn)地的小，大部分介于0.5～2 μm，且其中快消化淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，可達(dá)71.1%，而同為浙江產(chǎn)地的溫嶺芋頭快消化淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為64.8%。

目前關(guān)于芋頭淀粉的研究多集中在其提取、理化性質(zhì)等方面，而其OSA 酯化工藝的研究相對(duì)較少。由于奉化芋頭淀粉中較低的直鏈淀粉含量、極小的粒徑及微觀結(jié)構(gòu)有別于常規(guī)芋頭淀粉，因此其辛烯基琥珀酸酯的反應(yīng)工藝及理化性質(zhì)有待進(jìn)一步深入研究。此外，現(xiàn)有關(guān)于辛烯基琥珀酸芋頭淀粉酯（OSTS）的研究，均以滴定法測(cè)定取代度（degree of substitution，DS），而該方法忽略了淀粉酯中游離的辛烯基琥珀酸的含量，從而降低了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

奉化芋頭作為當(dāng)?shù)氐囊环N豐富的經(jīng)濟(jì)作物，研究奉化芋頭淀粉的辛烯基琥珀酸酯化工藝，有利于促進(jìn)其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，本研究以奉化芋頭為原料，采用水磨堿提法提取其中的淀粉，以O(shè)SA 為酯化劑制備辛烯基琥珀酸芋頭淀粉酯（OSTS），使用高效液相法為檢測(cè)手段，以芋頭淀粉酯的DS 為響應(yīng)值，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定所選因素的影響規(guī)律，然后采用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳酯化工藝。最后，對(duì)比了奉化芋頭淀粉及其酯化產(chǎn)物的部分理化性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

奉化芋頭 寧波當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)；辛烯基琥珀酸酐（OSA） 上海麥克林生化科技有限公司；二甲亞砜DMSO 色譜純，霍尼韋爾有限公司；乙腈 色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司；三氟乙酸 色譜純，南京國(guó)晨化工有限公司；其他化學(xué)試劑 均為分析純。

Agilent 1260 高效液相色譜儀、ZORBAX-SBC（5 μm，4.6×150 mm）色譜柱 安捷倫科技有限公司；D8 AdvanceX 射線衍射儀 德國(guó)Bruker；S4800掃描電鏡 日本日立公司；OAC 15 水接觸角測(cè)試儀德國(guó)Dataphysics 儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芋頭淀粉（TS）提取工藝實(shí)驗(yàn)方法 參考Jiang等并稍作修改。具體操作如下：芋頭洗凈去皮切塊，置于燒杯中，于4 ℃冰箱中用2.5 g/L 的氫氧化鈉溶液浸泡12 h。使用攪拌機(jī)打漿，依次過篩3 次（網(wǎng)篩為70、270、400 目），收集濾液靜置沉淀后，于3000 r/min 下離心10 min。去除液體及沉淀上層黃色的蛋白質(zhì)，加入蒸餾水，攪拌形成懸濁液，再次于3000 r/min 下離心10 min，重復(fù)此步驟到上層無黃色蛋白層為止，用0.1 mol/L HCl 調(diào)至中性，再重復(fù)離心步驟3 次。將沉淀放入40 ℃烘箱中烘烤48 h，烘干后用研缽磨成粉，過70 目篩，裝袋備用。

1.2.2 辛烯基琥珀酸芋頭淀粉酯（OSTS）制備工藝實(shí)驗(yàn)方法 參考Bai 等并做適量修改。稱取4.0 g芋頭淀粉于四口燒瓶中，加適量的水配制成一定濃度的淀粉乳液，攪拌10 min 后用3% NaOH 溶液調(diào)節(jié)淀粉乳pH 至一定值，繼續(xù)攪拌20 min，使用滴液漏斗將淀粉干基質(zhì)量3%的辛烯基琥珀酸酐（OSA）（使用5 倍的無水乙醇稀釋）逐滴滴加到淀粉乳中，特定溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，期間使用自動(dòng)電位滴定儀檢測(cè)反應(yīng)pH，使之維持在特定值，而后使用0.1 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 至6.0。將混合物過濾，使用去離子水及無水乙醇，各洗滌3 次，然后凍干得到OSTS。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 參照徐瓊等關(guān)于馬鈴薯淀粉酯化的條件，以取代度DS 為響應(yīng)值，依次考察淀粉乳濃度、反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間對(duì)DS 的影響。固定淀粉乳濃度35%、pH8.5、反應(yīng)溫度35 ℃、時(shí)間3 h 中的三個(gè)因素水平值，對(duì)第四個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素條件為反應(yīng)溫度20、30、40、50 ℃，反應(yīng)時(shí)間1、2、3、4 h，淀粉乳濃度30%、35%、40%、45%，反應(yīng)pH 為7.5、8.0、8.5、9.0。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上明確芋頭淀粉的最佳提取因素范圍，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面，其因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.2.5 高效液相色譜法測(cè)定OSTS 的取代度 使用本課題組之前的高效液相方法測(cè)定。液相色譜參數(shù)：Agilent1260 高效液相色譜（HPLC），色譜柱為ZORBAX-SB-C柱；流動(dòng)相：乙腈和水（0.1% 三氟乙酸（TFA））的混合物（45:55，v/v）；檢測(cè)波長(zhǎng)為200 nm；流速1 mL/min；檢測(cè)溫度為30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

總OS 含量測(cè)定：取0.5000 g OSTS（干重），加入20 mL 4 mol/L 氫氧化鈉，攪拌過夜，取4 mL 堿液到50 mL 容量瓶中，加入20 mL 1 mol/L 鹽酸，用乙醇定容，過濾后用HPLC 檢測(cè)。

游離OS 含量測(cè)定：取0.2500 g OSTS 樣品（干重），加入10 mL 甲醇，磁力攪拌1 h，然后4000 r/min離心10 min，取上清液1 mL 于取樣瓶，與1 mL 水（預(yù)先調(diào)到pH3）混合，過濾后進(jìn)行HPLC 分析。

游離OS（%OS），總OS（%OS），取代OS（%OS），計(jì)算公式如下：

式中：W和W分別是游離的OSA 和總的OSA 的質(zhì)量，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0009x-0.3848計(jì)算（其中Y 為OSA 含量，μg；x 為峰面積）；W 為檢測(cè)的OS 淀粉的質(zhì)量；210 和162 分別是OSA 和葡萄糖單元的分子量；1000 和12500 分別是稀釋倍數(shù)。

1.2.6 X-射線衍射分析（XRD） 取適量樣品平鋪于樣品盤的凹槽中，將樣品表面平整使其與樣品盤外表面相平，而后將樣品盤置于儀器中，測(cè)試波長(zhǎng)為1.5 ?的單色Cu-Ka 射線，測(cè)試條件為管壓50 kV、管流27 mA，掃描區(qū)域?yàn)?°～60°。

1.2.7 掃描電鏡分析（SEM） 芋頭淀粉酯化前后的顆粒形態(tài)使用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)：取微量淀粉粉末樣品，使用導(dǎo)電膠將其均勻分散于載物臺(tái)上，洗耳球吹去未粘牢的樣品。該樣品臺(tái)置于離子濺射噴鍍儀中鍍金，處理好后的樣品放入掃描電鏡樣品室觀察并拍照。

1.2.8 接觸角的測(cè)定測(cè)試方法 參照Chi 等，并做適量修改。稱取0.05 g 樣品加入5 mL 二甲亞砜DMSO，75 ℃水浴中攪拌使之完全溶解。然后滴管滴到玻片上，在80 ℃烘箱中干燥2 h 后，測(cè)接觸角。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均為三次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用軟件Design-Expert（Version 10.0.5，State-Ease Inc.,Minneapolis,Minnesota,USA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對(duì)OSTS 取代度的影響 酯化反應(yīng)溫度對(duì)OSTS 的取代度影響見圖1。由圖1 可看出，溫度從20 到40 ℃，DS 逐漸增加，溫度上升到50 ℃時(shí)DS 下降。主要原因是酯化反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，溫度較低時(shí)，不利于酯化反應(yīng)的發(fā)生，隨著溫度的升高，OSA 在溶液中的擴(kuò)散增強(qiáng)，其與淀粉分子的接觸及反應(yīng)效率均會(huì)提高，但溫度過高時(shí)，OSA 易發(fā)生水解，不利于反應(yīng)的進(jìn)行。因此反應(yīng)溫度優(yōu)選40 ℃。

圖1 溫度對(duì)OSTS 取代度的影響Fig.1 Effect of the temperature on the degree of substitution of OSTS

2.1.2 時(shí)間對(duì)OSTS 取代度的影響 酯化反應(yīng)時(shí)間對(duì)OSTS 的取代度影響見圖2。圖2 結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，DS 也呈先增大后減小的趨勢(shì)，這是因?yàn)镺SA 在水相體系中除了發(fā)生酯化反應(yīng)外，也會(huì)發(fā)生自身水解反應(yīng)。3 h 后，可能是OSA 被消耗掉，因此不再發(fā)生酯化反應(yīng)。在Lan 等關(guān)于美人蕉淀粉的OSA 酯化研究中也觀察到類似的結(jié)果。

圖2 時(shí)間對(duì)OSTS 取代度的影響Fig.2 Effect of the time on the degree of substitution of OSTS

2.1.3 淀粉乳濃度對(duì)OSTS 取代度的影響 圖3 為不同淀粉乳濃度時(shí)制備的OSTS 中的取代度，由圖3可知，隨著淀粉濃度的增加，DS 呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。這是由于淀粉濃度的增加提高了反應(yīng)體系中OSA 與淀粉顆粒接觸及反應(yīng)的概率，使酯化反應(yīng)朝著有利的方向進(jìn)行。當(dāng)TS 濃度高于40%時(shí)，淀粉濃度的增加使得溶液粘度高，限制了淀粉的非晶態(tài)區(qū)與OSA 的接觸。

圖3 淀粉乳濃度對(duì)OSTS 取代度的影響Fig.3 Effect of the starch concentration on the degree of substitution of OSTS

2.1.4 pH 對(duì)OSTS 取代度的影響 由圖4 可知，隨著pH 的增大，取代度也先增大后減小，當(dāng)溶液pH為8.0 時(shí)，DS 達(dá)到最大值，當(dāng)pH 進(jìn)一步增加到8.5時(shí)，DS 下降，說明高pH 對(duì)酯化反應(yīng)有一定的不利影響。此外，淀粉與OSA 的酯化反應(yīng)是可逆親核取代反應(yīng)，pH 大于8 時(shí)，OSA 偏向水解趨勢(shì)，當(dāng)pH 小于8 時(shí)，溶液的堿性不能有效激活淀粉中羥基的反應(yīng)活性，即不能形成親核基團(tuán)，取代度較低。

圖4 反應(yīng)pH 對(duì)OSTS 取代度的影響Fig.4 Effect of pH value on the degree of substitution of OSTS

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇pH（A）、時(shí)間（B）、溫度（C）和淀粉濃度（D）四個(gè)因素為自變量，相應(yīng)OSTS 的DS 為響應(yīng)值（Y），采用響應(yīng)面方法探究芋頭淀粉在不同條件下的取代度，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

根據(jù)表2 中的結(jié)果，采用Design-Expert 10.0 分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸，得到取代度（Y）與pH（A）、時(shí)間（B）、溫度（C）和淀粉濃度（D）之間的二次多元回歸方程為：

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

通過軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

決定系數(shù)R表示方程的擬合性，R越接近1，表明該方程擬合的越好。由表3 可知，R=0.9871，說明該模型可以解釋98.71%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，即影響DS 的因素98.71%來自淀粉濃度、pH、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度這四個(gè)因素。模型的=76.24，＜0.0001，極顯著，說明模型良好可用。經(jīng)過方差分析，四個(gè)因素對(duì)DS 的影響的主次順序是：D＞A＞C＞B，即淀粉乳濃度的影響最大，其次是反應(yīng)的pH，再次為反應(yīng)時(shí)間，其中反應(yīng)溫度對(duì)取代度的影響不明顯。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 10.0 軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，得到芋頭淀粉酯化的最佳工藝條件為：反應(yīng)pH8.26、反應(yīng)時(shí)間2.51 h、溫度40.97 ℃、淀粉乳濃度38.68%，此時(shí)OSTS 的取代度為0.02072。為了驗(yàn)證模型的有效性，考慮到實(shí)際情況將最佳提取條件定為：反應(yīng)pH8.5、反應(yīng)時(shí)間2.5 h、溫度41℃、淀粉乳濃度40%，在此工藝下，OSTS 的DS 為0.02069，此時(shí)的取代效率為68.97%，而Yu 等使用萊陽(yáng)芋頭淀粉做OSA 酯化時(shí)，當(dāng)OSA 用量為3%時(shí)，其DS 為0.018，相應(yīng)的取代效率為60%，低于采用本實(shí)驗(yàn)所確定的最優(yōu)條件制備的產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)所得DS與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.14%，兩者相比無顯著差異，說明該模型合理。

2.3 淀粉酯化前后性質(zhì)

2.3.1 XRD 分析 圖5 為芋頭淀粉酯化前后的XRD圖，其中數(shù)字表示樣品的相對(duì)結(jié)晶度。從圖5 可以看出，奉化芋頭淀粉的晶型為典型的A 型結(jié)晶，即其單峰出現(xiàn)在衍射角2為15°和24°左右，雙峰出現(xiàn)在17°～19°左右。而樣品OSTS 的衍射峰位并未發(fā)生明顯偏移，即證明酯化并沒有改變芋頭淀粉的晶型，與Song 等關(guān)于大米、藜麥淀粉的酯化結(jié)果相似，即淀粉顆粒的酯化不會(huì)改變其原有的晶型。Liu 等研究發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒有層狀結(jié)構(gòu)，即生長(zhǎng)環(huán)，表層向內(nèi)為結(jié)晶區(qū)-非結(jié)晶區(qū)-結(jié)晶區(qū)-非晶區(qū)交替存在。而在酯化反應(yīng)時(shí)，少量的OSA 可滲透到結(jié)晶區(qū)，因此導(dǎo)致經(jīng)酯化后淀粉結(jié)晶度的降低，如本實(shí)驗(yàn)中芋頭淀粉的相對(duì)結(jié)晶度為19.04%，酯化后降至15.20%。這與Bajaj 等的結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)高DS 的OSA 酯化蕓豆淀粉相對(duì)結(jié)晶度從38.3%降為18.74%，原因是OSA 反應(yīng)過程破壞了淀粉的晶體結(jié)構(gòu)。

圖5 芋頭淀粉及其酯化淀粉XRD 圖Fig.5 XRD patterns of TS and OSTS

2.3.2 微觀形貌分析 芋頭淀粉酯化前后的掃描電鏡圖見圖6，A 為原芋頭淀粉，B 為酯化芋頭淀粉。比較該圖可發(fā)現(xiàn)，芋頭淀粉的粒徑較?。?.5～4 μm），存在團(tuán)簇現(xiàn)象，顆粒較光滑但向內(nèi)凹。酯化后的OSTS 仍有團(tuán)聚體，向內(nèi)凹程度更明顯，顆粒表面粗糙程度增加。這與Yu 等研究相似，即酯化過程中NaOH 對(duì)淀粉顆粒表面有一定的腐蝕作用。在酯化反應(yīng)過程中，OSA 與淀粉顆粒接觸，主要與非結(jié)晶區(qū)反應(yīng)，使OSA 分布在每一層的非結(jié)晶區(qū)、通道、顆粒中心空腔中。

圖6 芋頭淀粉酯化前后不同放大倍率的電鏡圖Fig.6 SEM images of TS and OSTS with different magnification

2.3.3 接觸角分析 接觸角θ 可以體現(xiàn)樣品的親水程度，θ 越大代表顆粒疏水性越好。圖7 列出了芋頭淀粉酯化前后的水接觸角，由圖可發(fā)現(xiàn)TS 為86.2°，與Shao 等測(cè)的82°相近；而OSTS 的接觸角為120.9°，這與Yu 等的結(jié)論相符，芋頭淀粉經(jīng)OSA酯化后其水接觸角由25.4°增加到70.1°。的具體值相差較大的原因是測(cè)試方法的不同，Yu 等均是直接將淀粉壓片，淀粉的結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，測(cè)定的是其表面的疏水性，而本實(shí)驗(yàn)中是先將淀粉溶于DMSO中后干燥成膜，在溶解的過程中淀粉的鏈狀分子結(jié)構(gòu)會(huì)舒展開，原本在其內(nèi)部的疏水性基團(tuán)更多的暴露出來，使得其水接觸角更大，但是酯化前后變化趨勢(shì)相似，即隨著OSA 與淀粉反應(yīng)的發(fā)生，淀粉分子中部分羥基被取代，疏水性增強(qiáng)，接觸角變大。

圖7 芋頭淀粉及其酯化淀粉接觸角Fig.7 Contact angle of TS and OSTS

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化了辛烯基琥珀酸酐酯化芋頭淀粉的工藝參數(shù)，具體為：淀粉濃度40%，反應(yīng)溫度41℃，反應(yīng)時(shí)間2.5 h，pH8.5，在此條件下酯化得到的實(shí)際取代度為0.02069，樣品取代效率為68.97%；X 射線衍射及掃描電鏡結(jié)果表明：芋頭淀粉經(jīng)OSA 酯化后，相對(duì)結(jié)晶度會(huì)降低，但晶型及顆粒表面不會(huì)受到明顯影響；OSA 酯化后的芋頭淀粉疏水性增加。結(jié)合芋頭淀粉粒徑較小的特點(diǎn)，其有望用作Pickering 乳化劑，在食品乳化劑、增稠劑、生物醫(yī)藥和緩釋包裝等方面具有廣闊的應(yīng)用潛力。