夏雨晴，張于，吳則東，邳植

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

植物核質(zhì)互作型雄性不育（CMS）由線粒體基因組和核基因組共同決定，與花粉不育表型相關(guān)，花粉不育表型可被稱為育性恢復(fù)基因的核基因（Rf）抑制[1]。CMS是植物的一個(gè)重要性狀，目前在150多種植物中均有發(fā)現(xiàn)[2]。甜菜是利用CMS雜交種子生產(chǎn)的代表作物[3]。

1945 年，OWEN 提出甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）是由一個(gè)不育型細(xì)胞質(zhì)（S）和兩個(gè)Rf隱性基因（X 和Z）控制的，其中X 在育性恢復(fù)力上強(qiáng)于Z[4]。但他注意到甜菜CMS的表達(dá)有時(shí)過(guò)于復(fù)雜，不能用這個(gè)簡(jiǎn)單的遺傳模型來(lái)解釋?zhuān)驗(yàn)樵陔s交試驗(yàn)的后代中出現(xiàn)了半雄性不育類(lèi)型。根據(jù)OWEN 的遺傳模型，細(xì)胞質(zhì)雄性不育甜菜具有S（xxzz）基因型。為了繁殖不育系，選育了不含恢復(fù)等位基因，但細(xì)胞質(zhì)正常可育以保證花粉產(chǎn)生的保持系，即細(xì)胞質(zhì)為N（可育型）細(xì)胞核基因?yàn)閤xzz的類(lèi)型。在這種雜交育種方法中，最重要的是保持系基因型的鑒定，因?yàn)椴挥凳怯杀３窒蹬c不育系祖先系反復(fù)回交而培育的。目前，甜菜雜交育種的一個(gè)主要問(wèn)題就是保持系基因型的稀缺，使得保持系選擇十分困難[5]。常見(jiàn)的甜菜保持系選育方法通常是鑒定法，通過(guò)不育株與擬鑒定株成對(duì)套袋育種，再根據(jù)其F1后代不育株的育性推測(cè)擬鑒定株是否具有保持能力。這通常需要4～6 年才能正確判斷，耗時(shí)長(zhǎng)且效率低。后來(lái)程大友等[6]利用以多胚一年生基因型不育系甜菜鑒定選育二年生單胚或多胚基因型保持系，僅需13～16 個(gè)月。盡管如此，甜菜不育系和保持系的鑒定與選育依然耗時(shí)較長(zhǎng)。加快育種周期，早已成為各國(guó)育種家共同關(guān)注的問(wèn)題[7]。

隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，NISHIZAWA 等[8]發(fā)現(xiàn)了在甜菜線粒體基因組中的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）具有多態(tài)性和4 個(gè)不相關(guān)的串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)（TR1、TR2、TR3 和TR4），而其中TR1 串聯(lián)重復(fù)序列的多態(tài)性最高，串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)量為2～13 個(gè)不等。可以利用作用于甜菜線粒體VNTR 位點(diǎn)進(jìn)行甜菜細(xì)胞質(zhì)的育性鑒定。CHENG 等[9]通過(guò)對(duì)中國(guó)甜菜種質(zhì)資源的研究發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)胞質(zhì)育性類(lèi)型的小衛(wèi)星序列的拷貝數(shù)具有多態(tài)性，其中細(xì)胞質(zhì)為OWEN 不育型的TR1 片段有4 個(gè)拷貝，細(xì)胞質(zhì)為保持系型的拷貝數(shù)為13 個(gè)。王有昭[10]也用此方法對(duì)甜菜主要品系進(jìn)行VNTR分子檢測(cè)時(shí)，在葉用甜菜中首次發(fā)現(xiàn)了一株特異類(lèi)型細(xì)胞質(zhì)，其TR1片段拷貝數(shù)為10個(gè)。其余試驗(yàn)結(jié)果與程大友的結(jié)果一致，經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其TR1不育系擴(kuò)增條帶大小在500 bp 以下，保持系擴(kuò)增條帶大小在750 bp 左右。以這兩個(gè)作為對(duì)照材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，可以通過(guò)對(duì)比條帶帶型大小的方式來(lái)判斷甜菜細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型。

中國(guó)并非甜菜的起源國(guó)，雖然甜菜作為糖料作物栽培在我國(guó)已有100多年的歷史，甜菜育種事業(yè)也在不斷發(fā)展[11]，但仍然不及歐洲發(fā)達(dá)國(guó)家。目前世界各主要國(guó)家使用的甜菜品種大多為單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育雜交的三交種[12]。在中國(guó)培育的甜菜品種，幾乎都是與少數(shù)國(guó)內(nèi)部分地區(qū)種植的自由授粉品種進(jìn)行雜交而得來(lái)的。雜交種子的生產(chǎn)依賴于單一的不育系，即所謂的OWEN 型細(xì)胞質(zhì)，它是由OWEN 在品種‘US-1’中發(fā)現(xiàn)的[9]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)也育成了一些以甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本的單胚品種，但由于我國(guó)的單胚不育系和保持系的數(shù)量較少，限制了三交種母本的數(shù)量，也使得我國(guó)每年配制的雜交組合數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于國(guó)外的育種公司，所以我國(guó)主要投入生產(chǎn)的甜菜品種多數(shù)引自于國(guó)外，而這些品種的育性組成情況我們并不清楚。

目前國(guó)外甜菜種業(yè)公司在我國(guó)占據(jù)大部分市場(chǎng)，國(guó)產(chǎn)甜菜種子受到國(guó)外甜菜種子的沖擊較大[13-14]。隨著單胚雄性不育丸?；贩N的需求量逐年擴(kuò)大，市場(chǎng)上出現(xiàn)質(zhì)量下降、假冒、掉包種子等現(xiàn)象；且國(guó)外品種的進(jìn)入也造成我國(guó)甜菜褐斑病、叢根病、根腐病等病害加重，導(dǎo)致甜菜含糖率下降，影響了農(nóng)業(yè)綠色生產(chǎn)發(fā)展進(jìn)程，也使國(guó)內(nèi)愈發(fā)依賴國(guó)外優(yōu)良抗病品種[15]。為了更好地了解國(guó)內(nèi)外甜菜品種的細(xì)胞質(zhì)組成情況，基于甜菜細(xì)胞質(zhì)線粒體基因組的變異，本試驗(yàn)以現(xiàn)有的109 個(gè)國(guó)內(nèi)外甜菜登記品種的基因組DNA 為模板，利用已開(kāi)發(fā)的作用于甜菜線粒體VNTR 位點(diǎn)的小衛(wèi)星分子標(biāo)記TR1 引物[7]，研究目前國(guó)內(nèi)外甜菜品種的細(xì)胞質(zhì)育性基因型，以提高甜菜育種效率，為我國(guó)甜菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為109 個(gè)國(guó)內(nèi)外甜菜登記品種，及1 對(duì)自主培育的甜菜OWEN 型不育系和保持系作為對(duì)照組，共計(jì)110 份單株（表2）。所有甜菜品種的種子均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心提供。品種種植于黑龍江大學(xué)哈爾濱市呼蘭校區(qū)試驗(yàn)田中。有部分發(fā)芽率較低的品種，則在黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院的恒溫光培室內(nèi)補(bǔ)種，待長(zhǎng)至1對(duì)真葉時(shí)即可采集其嫩葉用于DNA提取。

1.1.2 引物

試驗(yàn)所用引物為鑒定細(xì)胞質(zhì)育性的TR1 引物[7]。引物序列如表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 試驗(yàn)中使用的DNA 標(biāo)記Table1 DNAmarkers used in the experiment

1.1.3 試驗(yàn)試劑

1×CTAB 緩沖液、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、TE 緩沖液、超光速M(fèi)ix、瓊脂糖粉、1×TAE 溶液、G-Red熒光核酸染料。

1.1.4 試驗(yàn)儀器

震蕩研磨機(jī)、金屬浴鍋、微量分光光度計(jì)、PCR儀、低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、凝膠成像儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CTAB法提取DNA

采用改良的CTAB法[16]提取109 個(gè)甜菜品種及保持系（O 型）和不育系（CMS 型）的DNA，每個(gè)品種取10株葉片的嫩葉單獨(dú)提取DNA。

1.2.2 DNA濃度檢測(cè)與稀釋

提取完DNA 后，吸取1 μL DNA 原液，使用微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度和OD260/OD280比值。保證OD260/OD280值≥1.8，濃度≥20 ng/μL。將所得的DNA 原液濃度用ddH2O 稀釋為100 ng/μL，將原液放于-20 ℃冰箱中長(zhǎng)期保存，再將稀釋液放于4 ℃冰箱中保存，便于隨時(shí)取用試驗(yàn)。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

10μL 的PCR 擴(kuò)增體系含5μL超光速M(fèi)ix，0.4μL引物，3.6μL的ddH2O，1μL的甜菜基因組DNA。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性25 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)28 次；72 ℃延伸5 min，16 ℃保存。

1.2.4 1%瓊脂糖凝膠電泳及檢測(cè)

PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，制備1%的瓊脂糖凝膠，每100μL 的瓊脂糖凝膠中加入5μL 的G-Red 熒光核酸染料。在每組樣品中加入保持系（O 型）與不育系（CMS 型）DNA 的PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，吸取5μL 的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行點(diǎn)樣，而后在130 V電壓下電泳30 min左右。電泳結(jié)束后放入凝膠成像儀觀察條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜登記品種的細(xì)胞質(zhì)育性鑒定

利用作用于甜菜線粒體VNTR 位點(diǎn)的細(xì)胞質(zhì)鑒定引物TR1 對(duì)甜菜品種的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其育性結(jié)果。通過(guò)對(duì)109 個(gè)甜菜登記品種的細(xì)胞質(zhì)基因型進(jìn)行鑒定，可得知TR1 引物擴(kuò)增出來(lái)的條帶類(lèi)型主要有500 bp 和750 bp 兩種，即S 型細(xì)胞質(zhì)（細(xì)胞質(zhì)不可育型）和N 型細(xì)胞質(zhì)（細(xì)胞質(zhì)可育型）。對(duì)照組中自主培育的‘WZD-5CMS’不育系擴(kuò)增出的條帶為500 bp，‘WZD-5O’保持系的條帶為750 bp左右。所鑒定的甜菜登記品種的擴(kuò)增條帶大多是500 bp，如表2所示。只有品種‘新甜15號(hào)’、‘ZT6’和‘甜研312’這3 個(gè)品種的擴(kuò)增條帶類(lèi)型是雜合的，條帶為500 bp 或750 bp。而這3 個(gè)品種都是我國(guó)自主培育的多胚種。

109個(gè)甜菜品種中的部分品種PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。在每個(gè)品種前用標(biāo)準(zhǔn)的成對(duì)不育系（‘WZD-5CMS’自交系）和保持系（‘WZD-5O’自交系）作為對(duì)照組，依據(jù)對(duì)照組的條帶大小可以看出品種‘KUHN814’的1～10 號(hào)擴(kuò)增出的條帶為500 bp，與不育系的條帶一致，則可以認(rèn)為該品種的細(xì)胞質(zhì)都是S型。品種‘新甜15 號(hào)’的1～10 號(hào)擴(kuò)增出的條帶既有500 bp 也有750 bp，則該品種內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)育性類(lèi)型是雜合的，既有S型也有N型。

圖1 部分甜菜品種的細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型鑒定結(jié)果Fig.1 The cytoplasmic type identification results of some sugar beet varieties

所鑒定的109 個(gè)供試品種中，106個(gè)為S 型細(xì)胞質(zhì)（不育型細(xì)胞質(zhì)），占比97.2%，3 個(gè)為既有N 型（可育型細(xì)胞質(zhì)）又有S型細(xì)胞質(zhì)（不育型細(xì)胞質(zhì)），占比2.8%。只有品種‘新甜15號(hào)’、‘ZT6’和‘甜研312’這3個(gè)品種內(nèi)部的細(xì)胞質(zhì)育性類(lèi)型是混雜的，這3個(gè)品種都是我國(guó)自主培育的多胚種子（見(jiàn)表2）。

表2 供試材料的分子鑒定情況Table 2 Molecular identification of the test material

2.2 國(guó)內(nèi)外甜菜登記品種多樣性以及細(xì)胞質(zhì)育性組成情況分析

如圖2 所示，本次試驗(yàn)所使用的109個(gè)國(guó)內(nèi)外甜菜登記品種中主要都是國(guó)外育種公司培育的品種，共有95個(gè)，占比為87%。其中自主培育甜菜種子最多的國(guó)家是荷蘭，占比高達(dá)41%，其次是占比為14%的德國(guó)和13%的丹麥。國(guó)外的甜菜登記品種都是純合的S型細(xì)胞質(zhì)。

圖2 供試材料的地區(qū)分布Fig.2 Regional distribution of test materials

在供試材料中，來(lái)自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所、黑龍江大學(xué)等國(guó)內(nèi)自育的地方品種有14 個(gè)，占比約為13%，其中的5個(gè)品種為單胚，9個(gè)品種是多胚，多胚種子中3個(gè)品種的細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型既有S型也有N型。

3 討論與結(jié)論

生產(chǎn)具有優(yōu)良雜種優(yōu)勢(shì)效應(yīng)的甜菜，需要具有高配合力的基因型進(jìn)行雜交，配合力往往與基因型的遺傳分化程度有關(guān)[17]。隨著時(shí)代的發(fā)展，甜菜育種工作者們已不再通過(guò)挑選表型性狀來(lái)進(jìn)行這種選擇，而是使用分子標(biāo)記技術(shù)[18]。利用分子標(biāo)記技術(shù)，還可以進(jìn)行相應(yīng)基因型品種的鑒定[19]。將多個(gè)抗性基因聚合到一起，實(shí)現(xiàn)聚合育種[20]。用分子標(biāo)記輔助育種（MAS）的這種方法鑒定出甜菜細(xì)胞質(zhì)基因是N 型還是S型是非常實(shí)用有效的方式，代替了常規(guī)育種鑒定法，即通過(guò)多代的套袋育種，觀察其后代分離情況來(lái)判斷擬選的保持系是否具有保持能力。分子標(biāo)記輔助育種（MAS）為將來(lái)利用國(guó)外的優(yōu)良甜菜品種育成能為我們所用的不育系、保持系以及授粉系服務(wù)，顯著提高育種選擇工作的準(zhǔn)確性和研究效率。

本試驗(yàn)對(duì)現(xiàn)有的大部分甜菜登記品種的細(xì)胞質(zhì)育性進(jìn)行了鑒定，對(duì)照組中的‘WZD-5CMS’自交系為500 bp，即S型細(xì)胞質(zhì)；‘WZD-5O’自交系為750 bp，即N 型細(xì)胞質(zhì)。所鑒定的供試材料中S 型細(xì)胞質(zhì)的比例為97.2%，品種中既有N 型又有S型細(xì)胞質(zhì)比例為2.8%。由此可得，所使用的甜菜登記品種中大部分品種的細(xì)胞質(zhì)是純合的S型細(xì)胞質(zhì)。只有品種‘新甜15號(hào)’、‘ZT6’和‘甜研312’這3個(gè)品種的細(xì)胞質(zhì)育性類(lèi)型是雜合的。而這3 個(gè)品種都是我國(guó)國(guó)內(nèi)自主培育登記的多胚種子。由此可見(jiàn)，國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家使用的基本都是單胚細(xì)胞質(zhì)不育型種子，而我國(guó)自主培育使用的仍有多胚種，細(xì)胞質(zhì)育性存在不一致的現(xiàn)象，也說(shuō)明了種子的一致性較差。從試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，目前國(guó)內(nèi)外甜菜育種所用的親本細(xì)胞質(zhì)育性比較單一，鑒定結(jié)果均為OWEN 不育型，一旦產(chǎn)生對(duì)OWEN型雄性不育的病害，就會(huì)對(duì)甜菜產(chǎn)業(yè)造成致命的打擊。

今后甜菜育種工作者應(yīng)以豐產(chǎn)、高糖、抗病為目標(biāo)，拓寬遺傳基礎(chǔ)[21-22]，注重選育多樣化細(xì)胞質(zhì)不育型的優(yōu)良單粒種，豐富甜菜種質(zhì)資源。同時(shí)提高品種的純合性水平，母本細(xì)胞質(zhì)需是純合的不育型。建立對(duì)應(yīng)的優(yōu)質(zhì)高效的分子標(biāo)記輔助選育（MAS）體系[23]，加強(qiáng)甜菜抗病基因工程研究，加快甜菜抗病育種進(jìn)程。本試驗(yàn)中僅對(duì)甜菜登記品種的細(xì)胞質(zhì)育性進(jìn)行了鑒定，而其核基因是哪種類(lèi)型還需進(jìn)一步的驗(yàn)證，因此，今后還需對(duì)甜菜登記品種的細(xì)胞核基因類(lèi)型進(jìn)行鑒定及研究。