羊雪芹，霍蘇曼，王 敏，房郁坤，朱曉靜

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院浙江省器官發(fā)育與再生技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 311121)

Wnt基因最早在小鼠乳腺癌模型中被發(fā)現(xiàn)，其編碼一類分泌型蛋白WNT.哺乳動物和果蠅中的WNT蛋白具有高度保守性，含有多個保守的半胱氨酸殘基，并且都具有棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合區(qū)域[1].Wnt信號通路主要包含經(jīng)典Wnt信號通路(canonical Wnt signaling pathway)和非經(jīng)典Wnt信號通路(non-canonical Wnt signaling pathway).在由β-Catenin介導(dǎo)的經(jīng)典Wnt信號通路中，配體蛋白WNT與膜受體Frizzled和輔助受體LRP5/6結(jié)合，抑制GSK3β、APC、AXIN等蛋白組成的降解復(fù)合體的形成，使細(xì)胞質(zhì)中β-Catenin進(jìn)入細(xì)胞核并與TCF/LEF家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[1].研究表明，Wnt信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和分化，在胚胎發(fā)育、器官發(fā)生和組織穩(wěn)態(tài)方面具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[1-3].Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異?？稍斐赡承┫忍煨约膊3-5].以Wnt配體基因突變?yōu)槔?，Wnt1純合突變小鼠在胚胎發(fā)育過程中死亡、中腦和小腦發(fā)育嚴(yán)重異常[6]，Wnt2敲除小鼠發(fā)生胎盤發(fā)育缺陷[7]，小鼠Wnt3缺失可導(dǎo)致體軸形成失敗[8-9]，Wnt3a敲除小鼠體節(jié)缺失、脊索及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常[10]，小鼠Wnt9b[11]或Wnt5a[12]缺失均可導(dǎo)致腭裂，人類WNT5A和WNT9B等WNT基因突變也可導(dǎo)致唇腭裂等顱面部器官發(fā)育缺陷[13-14].此外，Wnt信號通路基因表達(dá)異常也和乳腺癌、腸癌、胃癌和前列腺癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[15-16].

TMEM181(transmembrane protein 181)又名GPR178，是一種G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)，介導(dǎo)致病菌分泌的細(xì)胞致死腫脹毒素(cytolethal distending toxin, CDT)反應(yīng)[17].目前關(guān)于TMEM181的研究報道較少，其潛在功能尚不清楚.采用BLASTP進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)[18]，TMEM181含有WNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域，提示TMEM181的功能可能與Wnt信號通路相關(guān).本研究分析Tmem181在小鼠發(fā)育中的表達(dá)情況，觀察其表達(dá)部位是否和WNT活性部位相關(guān)，為進(jìn)一步研究TMEM181在哺乳動物顱面部形態(tài)發(fā)生和器官發(fā)育過程中的分子機(jī)制提供基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用健康的C57BL/6小鼠(購于杭州師范大學(xué)實驗動物中心)，體質(zhì)量為25～30 g.實驗小鼠飼養(yǎng)于杭州師范大學(xué)實驗動物中心無特定病原體(SPF)環(huán)境，雌雄交配后每日7:00—9:00檢栓，陰栓檢測陽性視為交配成功，同時記錄為E0.5 (embryonic day 0.5)，收取E7.5—E14.5各時期孕鼠.小鼠出生當(dāng)天記錄為P0(postnatal day 0)，收取P40成體鼠.小鼠的飼養(yǎng)和使用受到杭州師范大學(xué)實驗動物福利與倫理委員會的監(jiān)督，倫理審批號為HSD20150101.

1.2 探針質(zhì)粒構(gòu)建及探針合成

將小鼠Tmem181a基因的轉(zhuǎn)錄本(transcript variant 1)mRNA的22～549 bp片段克隆到pGEM-easy線性化載體中，測序鑒定后用RNA探針合成試劑盒(Roche，美國)合成探針.

1.3 原位雜交

1.3.1 小鼠全胚胎原位雜交

收集E7.5—E12.5小鼠全胚胎樣品，使用4%多聚甲醛固定.蛋白酶K處理后，雜交液封閉，加入探針于雜交液孵育過夜.漂洗后，加入抗地高辛抗體孵育過夜.樣品在室溫中避光顯色，使用PBST終止反應(yīng)后，于體視鏡下拍照觀察.

1.3.2 小鼠組織切片原位雜交

小鼠胚胎樣品經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜后，酒精梯度脫水、過蠟、切片，切片厚度為12 μm.組織切片經(jīng)蛋白酶、乙酸酐處理，雜交液封閉等一系列處理后，加入地高辛標(biāo)記的Tmem181反義RNA探針孵育過夜.經(jīng)抗地高辛抗體孵育后，加入底物顯色，采用PBS緩沖液終止反應(yīng).隨后，對組織切片使用伊紅對染，經(jīng)樹脂封片后，于顯微鏡下觀察拍照.

1.4 實時定量PCR

采用RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen，美國)分別提取P30小鼠腦、心臟等組織總RNA，取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.設(shè)計小鼠Tmem181特異定量引物，正向引物序列：5’-TGCCTGCTAATTATTCACTCAA -3’，反向引物序：5’-AGGGCTCCAGCTCCACAAC -3’.以cDNA為模板進(jìn)行實時定量PCR，擴(kuò)增結(jié)果采用管家基因ACTB進(jìn)行校正.

2 結(jié)果與分析

2.1 Tmem181在小鼠胚胎中的表達(dá)

Tmem181在多種生物中高度保守，編碼小鼠TMEM181的基因是Tmem181a，本文所指小鼠Tmem181基因為Tmem181a.本研究采用Tmem181特異性探針對E7.5—E12.5小鼠進(jìn)行全胚胎原位雜交.結(jié)果顯示，在E7.5，Tmem181在胚胎整體部位均有表達(dá)(圖1A).在E8.5，Tmem181在整胚有表達(dá)，于神經(jīng)管處強表達(dá)(圖1B).在E9.5—E10.5，Tmem181的表達(dá)集中在第一、第二鰓弓，以及肢芽(圖1).這些定位結(jié)果與Wnt信號表達(dá)位置高度重合[19-23]，提示TMEM181和Wnt信號通路可能存在聯(lián)系.

探針信號為紫色；nt: 神經(jīng)管；hl: 后肢芽；fl: 前肢芽；ba: 鰓弓.A—B比例尺：500 μm; C—F比例尺：1 mm.

2.2 Tmem181在小鼠胚胎顱面部的表達(dá)

為進(jìn)一步研究Tmem181在顱面部各個器官組織中的表達(dá)，本研究對小鼠胚胎不同時期石蠟樣品進(jìn)行冠狀面切片，并采用Tmem181特異性探針進(jìn)行原位雜交.結(jié)果顯示，E11.5—E14.5，在牙齒發(fā)育中Tmem181主要在表皮表達(dá)，在間充質(zhì)也有弱表達(dá).E14.5帽狀期，Tmem181在釉節(jié)和頸環(huán)處有強烈表達(dá).E11.5—E13.5，Tmem181在腭板、舌的表皮和間充質(zhì)中有表達(dá).E12.5—E14.5，Tmem181在舌部肌肉組織中有表達(dá).見圖2.

A—C：E11.5；D—F：E12.5；G—I：E13.5；J—L：E14.5；探針信號為紫色；p：腭板；m：磨牙；t：舌；比例尺：100 μm.

2.3 Tmem181在小鼠胚胎和成年小鼠腦部的表達(dá)

小鼠胚胎期Tmem181原位雜交結(jié)果顯示，Tmem181在小鼠腦部有大量表達(dá).E11.5時的雜交信號主要在腦室(圖3A)，E12.5時Tmem181在腦室區(qū)均勻表達(dá)(圖3B)，E14.5時Tmem181在腦室區(qū)呈點狀分布(圖3C)，提示Tmem181在小鼠腦發(fā)育中可能發(fā)揮重要作用.收集成年小鼠(P40)的肺、肝、大腦、肌肉等組織進(jìn)行定量PCR，分析Tmem181在小鼠成體組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Tmem181在成體小鼠心、肺、肝臟、肌肉、腦組織中均有表達(dá)，在腦組織中有強表達(dá)(圖3D).

探針信號為紫色；A—C：小鼠胚胎腦部組織Tmem181原位雜交結(jié)果；D：P40小鼠組織Tmem181定量表達(dá)結(jié)果；比例尺：200 μm.

3 討論

Wnt信號通路對哺乳動物器官的形態(tài)發(fā)生、組織分化和功能成熟有重要的調(diào)節(jié)作用.在胚胎發(fā)育早期和器官發(fā)育的多種組織中都可以檢測到Wnt信號通路基因的表達(dá)和Wnt信號通路活性的存在[6-9,12].多種Wnt信號通路拮抗劑和配體在胚胎神經(jīng)發(fā)育早期就具有特定的時空表達(dá)模式，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育特別是腦組織發(fā)育中具有重要調(diào)節(jié)作用[2].TMEM181和Wnt配體的分泌調(diào)控蛋白GPR177都具有WNT結(jié)合結(jié)構(gòu)域.GPR177在體軸形成和器官發(fā)育中非常重要，Gpr177早在胚胎發(fā)育的E6.25就有表達(dá);E9.5,在顱面部突起處可以檢測到Gpr177的表達(dá)[24].隨著顱面發(fā)育的進(jìn)行，Gpr177在腭板上皮和間充質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)[25]，在牙齒發(fā)育過程中的口腔和牙齒上皮、間充質(zhì)也有強烈表達(dá)[26].此外，Gpr177在小鼠胚胎舌上皮組織中也有強烈表達(dá)[27].和Gpr177類似，多種Wnt配體和Wnt信號通路基因在這些組織中也有不同的時空表達(dá)[2,8,20,22,25-27].在小鼠中全敲除Gpr177可導(dǎo)致小鼠胚胎原條和中胚層發(fā)育異常并引起胚胎早期死亡[24].而在不同組織中，條件性敲除Gpr177會引起Wnt信號通路活性的降低，并且產(chǎn)生各種發(fā)育缺陷型，比如顱面發(fā)育畸形、腭裂、牙齒發(fā)育和分化問題、味蕾發(fā)育異常、小鼠肢芽發(fā)育異常等[22-23,25-28].本研究結(jié)果顯示，小鼠胚胎發(fā)育中Tmem181基因的表達(dá)與Wnt信號通路相關(guān)因子表達(dá)高度重合.TMEM181具有1個WNT蛋白結(jié)合域，由此提示TMEM181在機(jī)體發(fā)育中的功能可能和Wnt信號通路相關(guān).

TMEM181是G蛋白偶聯(lián)受體之一，在脊椎動物和昆蟲中均高度保守.系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，脊椎動物與人類的TMEM181氨基酸同源性超過70%[29].細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，Tmem181突變體對CDT具有抗性，在NIH3T3細(xì)胞、U2OS細(xì)胞和Hela細(xì)胞中過表達(dá)Tmem181，可使這些細(xì)胞對CDT中毒敏感[17].GeneCards數(shù)據(jù)庫信息顯示，TMEM181表達(dá)紊亂與生殖器感染疾病軟下疳以及Ⅰb型生長激素缺乏癥相關(guān).患病家族全基因組分析結(jié)果顯示，TMEM181是兒童和成人齲齒的基因連鎖位點[30].這些數(shù)據(jù)顯示TMEM181和人類遺傳疾病密切相關(guān)，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究TMEM181在哺乳動物發(fā)育中的功能提供數(shù)據(jù).