郭利芳 蘇鵬 周樹權(quán)

（1 海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 海南?？?570216；2 海南省商業(yè)學(xué)校 海南海口 570100）

19世紀(jì)初瑞典化學(xué)家發(fā)現(xiàn)硒后，有關(guān)研究經(jīng)歷漫長發(fā)展。20世紀(jì)50年代初首次證明硒的營養(yǎng)作用，發(fā)現(xiàn)硒是機(jī)體正常生命活動的必要元素，可以發(fā)揮抗癌等生理作用。硒的研究從無機(jī)硒到植物硒不斷豐富。1990年后國內(nèi)外開發(fā)諸多硒產(chǎn)品，研究方向轉(zhuǎn)變?yōu)樘崛∮袡C(jī)硒，帶動富硒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。硒多糖避免無機(jī)硒毒性，逐漸引起人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)硒多糖對高血脂與病毒具有抑制作用，充分認(rèn)識硒多糖結(jié)構(gòu)用于醫(yī)藥研制具有巨大價值。地瓜在世界食品貿(mào)易中占據(jù)重要地位，是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物。地瓜具有增強(qiáng)神經(jīng)興奮等功能，海南澄邁縣橋頭鎮(zhèn)土壤富含硒元素，沙土瓜皮色紅，青脆可口，全鎮(zhèn)種植面積達(dá)666.67 hm2，被譽(yù)為海南富硒之鄉(xiāng)。隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，當(dāng)前人們對食物營養(yǎng)價值日益關(guān)注，橋頭地瓜風(fēng)味獨特，具有藥用保健功效，其開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。研究橋頭地瓜硒多糖提取分離，對打造橋頭地瓜品牌，帶動當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。

1 植物多糖研究

多糖廣泛分布于多種生物體中，是構(gòu)成生命四大基本物質(zhì)之一，根據(jù)來源分為動植物多糖與微生物多糖。多糖在食品行業(yè)廣泛應(yīng)用，多糖生物資源開發(fā)研究成為天然藥物與生命科學(xué)研究熱點。硒是生物體必需的微量元素，可以保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能，對生育視力等具有重要影響。低毒硒化合物研發(fā)日益受到重視［1］。自然界中硒以多種形式存在，無機(jī)硒主要有亞硒酸、硒酸鈉等。硒多糖是生物體對無機(jī)硒生物有機(jī)化形式，硒多糖研究具有開發(fā)價值。

植物硒多糖來源于根莖葉皮種花，目前已有300多種多糖類化合物從天然產(chǎn)物中分離。植物細(xì)胞壁較為牢固，要去除組織表面脂肪釋放多糖。通常將原料搗碎加入甲醇進(jìn)行脫脂，稀酸中提取多糖。酸堿性引起多糖降解，可以用超聲波處理加速多糖釋放。純化是多糖研究的關(guān)鍵，植物多糖純化分為分離與分級純化，分離純化是去除粗多糖中的無機(jī)鹽與小分子有機(jī)物等雜質(zhì)，分離純化步驟包括脫色、除蛋白等；分級純化是多糖混合物分離為單一多糖，分級純化需要結(jié)合多種方法純化［2］。常用的方法包括柱層析法與沉淀法。其他純化方法有超過濾法、活性炭柱色譜等。國外采用紫外檢測多糖，分離效果良好。

植物多糖表征鑒定方法有糖含量測定，純度鑒定等。多糖含量測定通常采用比色法，利用多糖在強(qiáng)酸下水解后脫水生成糖醛，與酚類等化合物縮合生成物質(zhì)進(jìn)行測定。多糖純度標(biāo)準(zhǔn)不能用小分子化合物衡量，其純度代表某多糖相似鏈長平均分布，多糖純度鑒定方法有超離心法、凝膠過濾法等。需要多種方法鑒定多糖均一性。多糖分子量分布較為分散，以往常用測定方法有粘度法等，目前常用方法有高效液相色譜法等。組成多糖單糖品種繁多，連接方式不同造成多糖結(jié)構(gòu)測定困難［3］。通常研究僅限于多糖一級結(jié)構(gòu)，多糖一級結(jié)構(gòu)分析方法分為理化生方法。化學(xué)分析法有高碘酸氧化、甲基化反應(yīng)等。儀器分析法是研究多糖結(jié)構(gòu)特性，具有快速靈敏等優(yōu)點，目前應(yīng)用較多的有UV，GC等?，F(xiàn)代分析儀器出現(xiàn)促進(jìn)多糖鏈結(jié)構(gòu)研究工作發(fā)展。

植物多糖化合物由于其獨特功能顯示廣闊的應(yīng)用前景，在提高免疫，降血糖血脂等方面具有良好效果。多糖抗腫瘤分為具有細(xì)胞毒性的多糖殺死腫瘤細(xì)胞，生物免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑間接抑制腫瘤細(xì)胞。自由基是人體衰老的原因，人體自由基產(chǎn)生過多會攻擊各種細(xì)胞器官。研究表明灌喂枸杞多糖提高衰老小鼠體內(nèi)超氧化物岐化酶活性，降低脂質(zhì)過氧化物丙二醛含量。多糖降血糖活性通過影像糖代謝酶硒活性抑制糖的異生。經(jīng)過多年發(fā)展，多糖研究發(fā)現(xiàn)許多具有重要生物活性植物多糖，隨著多糖制備結(jié)構(gòu)及臨床研究深入，其低毒效應(yīng)在臨床應(yīng)用中顯示巨大潛力［4］。低含量植物中分離提取技術(shù)，結(jié)構(gòu)鑒定等方面研究是未來方向。

2 硒多糖的研究

1817年，瑞典化學(xué)家Berzelius在生產(chǎn)硫酸尾礦中發(fā)現(xiàn)硒。1957年，美國科學(xué)家Foltz發(fā)現(xiàn)硒可防治大鼠肝壞死。常見的無機(jī)硒有硒酸鈉，無機(jī)硒具有蓄積毒性作用，有機(jī)硒毒性低，可以更好地發(fā)揮硒的作用，多糖具有多種生物功能，硒多糖結(jié)合轉(zhuǎn)化可以優(yōu)化硒多糖的生理藥理功能。很多研究者在植物中發(fā)現(xiàn)硒多糖存在，近年來研究者不斷創(chuàng)新技術(shù)，使得硒多糖日益受到關(guān)注［5］。硒多糖來源分為化學(xué)合成法、從富硒植物中提取。人工方法獲取硒多糖是講無機(jī)硒添加到培養(yǎng)基中，對硒進(jìn)行富集獲得硒多糖。

硒多糖提取分離純化與多糖方法類似，包括去除大分子，對蛋白質(zhì)等大分子需通過特定手段去除。脫蛋白后組分需進(jìn)行純化，硒多糖純化法主要參考沉淀法、柱層析法等。結(jié)構(gòu)是決定生物大分子生理活性的基礎(chǔ)，需要探索硒多糖結(jié)構(gòu)了解硒多糖生理活性。硒多糖結(jié)構(gòu)分析法包括紅紫外分析法、高效液氣相色譜法，核磁共振等。硒多糖硒含量測定常用DAN熒光法，隨著分析手段的發(fā)展，很多分析方法用于硒的分析測定，如電感耦合等離子體等，硒多糖中多糖含量可用硫酸法測定。硒多糖分子量可用HPLC等方法測定，薄層色譜、高效液相色譜等方法分析單糖組成。硒多糖中羥基取代情況可用甲基化反應(yīng)等方法分析。硒參與多種酶的組成代謝，具有延緩衰老等生理功能，多糖是具有廣譜的免疫促進(jìn)劑，具有抗感染、抗凝血等作用。硒多糖是有機(jī)硒化合物，是生物體將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒有效形式。

硒多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，抗氧化損傷作用，降低某學(xué)有毒元素毒性等效果。研究表明硒可調(diào)節(jié)免疫功能，T淋巴細(xì)胞特異性增殖作用降低，國產(chǎn)新藥硒酸酯多糖臨床研究表明，藥物延長荷瘤鼠的生存時間［6］?；暖熁颊呖诜狨ザ嗵呛竺庖咔虻鞍譍含量上升。服用硒酸酯多糖組患者巨噬細(xì)胞吞噬率高于對照組。研究表明許多疾病發(fā)生與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物是損害機(jī)體主要途徑，硒是人體必需微量元素，研究發(fā)現(xiàn)硒云芝多糖提高機(jī)體組織谷胱甘肽過氧化物酶的活性，有效提高機(jī)體抗氧化能力。近年來研究了解硒多糖一些功能，但其生化特性尚不清楚，硒多糖構(gòu)效關(guān)系等方面直接證據(jù)不足。通過實驗分析純化深入研究硒多糖結(jié)構(gòu)功能對藥品保健品開發(fā)具有重要社會經(jīng)濟(jì)效益。

硒是人體維持生命活動必要元素，硒有益于某些植物生長發(fā)育。目前人們未從植物中得到明確結(jié)構(gòu)的硒化合物。硒在世界上分布不均勻，海南澄邁縣橋頭鎮(zhèn)是著名高硒區(qū)，境內(nèi)地瓜產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展［7］。硒在疾病防治方面具有多種功能，缺硒導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。通過實驗研究橋頭地瓜硒多糖結(jié)構(gòu)生化功能，有助于全面了解橋頭地瓜營養(yǎng)價值，促進(jìn)當(dāng)?shù)氐毓限r(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)發(fā)展，提高社會經(jīng)濟(jì)效益。本文通過對湖南澄邁縣橋頭鎮(zhèn)地瓜硒多糖提取分離分析，研究地瓜硒多糖初步結(jié)構(gòu)，為產(chǎn)品開發(fā)提供參考價值，充分利用橋頭鎮(zhèn)特產(chǎn)資源，帶動地方經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展。

3 海南省澄邁縣橋頭鎮(zhèn)地瓜硒多糖提取分離

研究發(fā)現(xiàn)缺乏維E飲食中添加硒可防止?fàn)I養(yǎng)性肝壞死，近年來有關(guān)硒的生物醫(yī)學(xué)作用研究轉(zhuǎn)向有機(jī)硒化合物。海南省澄邁縣橋頭鎮(zhèn)是我國高硒區(qū)，具有富硒之鄉(xiāng)稱號，一些區(qū)域植物含硒量比一般地區(qū)高數(shù)十倍，專家建議對富硒植物有機(jī)硒應(yīng)用研究。天然產(chǎn)物研究具有一定難度，大分子間的分離純化較為困難。橋頭地瓜硒多糖獲得要經(jīng)過原料粉碎等步驟，提取中采取溶劑浸提法。常用的提取液法是有機(jī)試劑沉淀法，脫蛋白是硒多糖分離純化的重要環(huán)節(jié)。

高溫浸提植物多糖可提高多糖溶出率，以橋頭地瓜甘薯進(jìn)行不同條件預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)高溫下對實驗田種植地瓜多糖浸提不可取，高溫下非功能性多糖溶出率較高。由于淀粉存在使得脫出淀粉家中后續(xù)脫蛋白負(fù)擔(dān)。對預(yù)實驗部分調(diào)整，從試驗田中地瓜提取硒多糖選擇良好塊莖，切片后鼓風(fēng)干燥，過80目曬干燥器備用，硒多糖提取后獲取上清液，乙醇沉淀分離，乙醇分離洗滌后透析干燥。操作中烘干50℃干燥至恒重；沉淀遵循快叫慢加原則，封閉后4℃靜置24 h。硒含量測定參考國標(biāo)，將樣品置于消化管后加入5.0 mL硝酸混勻消化。將消化管置于200℃加熱板加入5 L 6 mol/L的鹽酸，消化管底部剩余1 mL消解液取放置室室溫下冷卻。取6支離心管加入硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，以去離子水定容至5 mL，加入0.5 g鐵氰化鉀測定原子熒光。

測定多糖含量試劑包括葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液。取對應(yīng)具塞試管取樣，室溫靜置30 min于490 nm波長處測定吸光度。吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品配制成溶液在規(guī)定時間內(nèi)測吸光度。測定蛋白質(zhì)試劑標(biāo)準(zhǔn)液取牛血清蛋白100 mg，定容至100 mL，取儲備液10 mL定容至100 mL。測定溶液蛋白質(zhì)含量取干凈試管，加入超純水0.5 mL混勻，在5～20 min內(nèi)于波長595 mm處測定吸光度。酶解法對硒多糖脫蛋白具有良好效果。實驗以木瓜蛋白酶進(jìn)行脫蛋白，取1 mg/mL樣品溶液5份，進(jìn)行酶解效果實驗70 min，滅酶時間10 min，取上清液蛋白質(zhì)。將醇沉后經(jīng)真空孔干燥樣品用超純水溶解，振蕩后離心棄沉淀后取上清液。進(jìn)行振蕩時間，V氯仿：V正丁醇影響單因素實驗。確定各因素單因素后進(jìn)行正交試驗。

研究酶解溫度60℃下酶底對比蛋白質(zhì)的影響。隨著酶底比增多，多糖吸光度變化不明顯。酶底比為0.1%時酶解效果較好，由于引入過多外源酶蛋白導(dǎo)致蛋白質(zhì)吸光度增大。蛋白質(zhì)含量降幅不大，由于地瓜酶解蛋白機(jī)理蛋白脫出率較低。進(jìn)行操作條件對硒多糖結(jié)構(gòu)無影響的Sevag法脫蛋白實驗?？紤]Sevag法脫蛋白后進(jìn)行酶解實驗，酶底按0.5%，0.65%進(jìn)行酶解。酶底變化時蛋白質(zhì)吸光度變化。由于Sevag法脫蛋白只能除掉部分提取液蛋白質(zhì)含量增加。多糖吸光度變化小。酶底比為0.575%，多糖保留率為85.88%。

4 海南橋頭地瓜硒多糖純化分析

海南橋頭地瓜經(jīng)脫蛋白等初步純化后需繼續(xù)純化，硒多糖通過離子交換柱層析法純化（圖2）。根據(jù)硒多糖帶電荷性質(zhì)純化，采用色譜技術(shù)進(jìn)行分離。由于離子交換柱層析具有重復(fù)性高等優(yōu)點，硒多糖初步分析包括硒的存在方式，糖苷鍵的種類等方面內(nèi)容，通過化學(xué)法對硒多糖進(jìn)行分析。本文對海南橋頭地瓜硒多糖進(jìn)行銀離子交換柱層析純化，以HPLC等手段對硒多糖初步分析。地瓜硒多糖柱層析純化實驗包括填料預(yù)處理，裝柱平衡與樣品透析等環(huán)節(jié)。

地瓜硒多糖物理性質(zhì)檢驗觀察顏色氣味，化學(xué)性質(zhì)包括多糖顯色，還原糖顯色等。采用直接觀察法對Se-Sp-P2，Se-Sp-P4物理性質(zhì)進(jìn)行判定，將樣品溶于水及有機(jī)試劑中觀察溶解度。多糖定性檢驗以苯酚-硫酸法進(jìn)行實驗。地瓜多糖蛋白質(zhì)定性檢測取干燥后樣品溶解于超純水中，觀察波長范圍內(nèi)紫外吸收變化。取干燥后樣品1 mg在4000～450 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描。植物多糖單糖組成分析以氣象色譜測定，由于具有前處理過程復(fù)雜等缺陷，分析單糖組成易出現(xiàn)色譜峰異構(gòu)化分裂等現(xiàn)象?？紤]單糖中不存在發(fā)色基團(tuán)，對樣品進(jìn)行PMP柱前衍生化處理。采用離子濺射制備掃描電鏡樣品，觀察硒多糖表面形態(tài)。

實驗以不同濃度NaCl溶液為洗脫劑脫洗，根據(jù)洗脫曲線吸光度變化趨勢，表明洗脫曲線億歐很大的反應(yīng)現(xiàn)象明顯峰。0.1 mol/L NaCl溶液為脫洗劑時脫洗曲線有糖反應(yīng)較弱的峰。0.15 mol/L NaCl溶液為洗脫劑脫洗曲線15～20管存在糖反應(yīng)較弱的峰。0.2 mol/L NaCl溶液為脫洗劑脫洗曲線出現(xiàn)3個峰，根據(jù)脫洗管數(shù)將組分Se-Sp-P2收集透析凍干備用。0.25 mol/L NaCl溶液為脫洗劑脫洗曲線出現(xiàn)4個峰，根據(jù)脫管數(shù)將組分Se-Sp-P3收集透析凍干備用。0.3 mol/L Nacl溶液為脫洗劑脫洗曲線有2組峰，15管后有糖反映較弱的峰。根據(jù)不同濃度洗脫液脫洗曲線，0.1、0.2、0.3 mol/LNaCI溶液可脫洗處多糖組分。本文對洗脫曲線進(jìn)行0.2 mol/L、0.3 mol/L NaCI溶液洗脫組分分析。

橋頭地瓜純化分析實驗表明4種硒多糖為白色粉末，Se-Sp-P1，Se-Sp-P3水溶性好。Se-Sp-P1是水溶性較好的硒多糖，推測柱層析純化導(dǎo)致Se-Sp-P4空間結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致硒多糖溶解變化。4種硒多糖硫酸-苯酚顯色呈陽性，碘-碘化鉀顯色反應(yīng)呈陰性。4種硒多糖Fehling試劑顯色反應(yīng)呈陰性。4種硒多糖硫酸-咔唑顯色中Se-Sp-P1呈陰性。推斷Se-Sp-P1是不含淀粉中性硒多糖，P2，P3，P4為還原糖硒多糖。地瓜粗硒多糖在200 nm附近有多糖吸收峰，硒多糖粗品中存在蛋白等雜志，DEAE-cellulose52對地瓜多糖純化取得一定效果，4種硒多糖樣品無蛋白質(zhì)等雜質(zhì)成分，色素含量少。4種組分中無蛋白質(zhì)等雜質(zhì)成分，4種成分為多糖，Se-Sp-P1不含糖醛酸結(jié)構(gòu)，Se-Sp-P3，P4含有糖醛酸結(jié)構(gòu)。