張美娜 施明杰 秦 通 孫 毅

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是一種蜱媒出血熱，長角血蜱Haemaphysalislongicornis被確定為主要的傳播媒介(Luoetal., 2015; Huetal., 2020)。SFTS自近10年前出現(xiàn)以來，地理分布范圍在不斷擴(kuò)大(Zhanetal., 2017; Tranetal., 2019; Winetal., 2020)，危害人口快速增加，其病死率為12%～50% (Takahashietal., 2014; Kimetal., 2018; Lietal., 2018; Tranetal., 2019)?？紤]到主要蜱媒的廣泛分布和擴(kuò)散(Raineyetal., 2018; Miaoetal., 2020)以及通過接觸患者血液和/或其他體液的另一種傳播潛力(Tangetal., 2013; Kogaetal., 2019; Akagietal., 2020)，SFTS的死亡人數(shù)和潛在威脅被低估了。SFTS的病原體為發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTS virus，SFTSV)(Abudurexitietal., 2019)，在以往研究中，SFTSV被證實(shí)是通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞或吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞(Lozachetal., 2010)。在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(receptor mediated endocytosis，RME)中，細(xì)胞表面上的受體靶向特定的貨物，當(dāng)貨物內(nèi)化時(shí)則被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)體, 貨物也可能會(huì)被回收至細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸或輸送到溶酶體進(jìn)行降解(Woodetal., 2021)。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(clathrin mediated endocytosis，CME)是 RME 研究最多的形式，被認(rèn)為是細(xì)胞中的最主要的內(nèi)吞過程(Kirchhausen, 2000; Woodetal., 2021)。網(wǎng)格蛋白(clathrin)在真核生物中具有高度進(jìn)化保守性，其介導(dǎo)的內(nèi)吞作用調(diào)節(jié)許多生理過程，包括細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、有絲分裂、細(xì)胞遷移、生長因子和受體內(nèi)化、病原體入侵和突觸傳遞( Briantetal., 2020; McMahonetal., 2011)等。

一些病毒在長期進(jìn)化中形成利用胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)發(fā)生過程實(shí)現(xiàn)病毒傳播的機(jī)制(Altan-Bonnetetal., 2019)。EVs的大小及內(nèi)含物組分具有較高的異質(zhì)性，不同的細(xì)胞通過分泌攜帶不同組分的EVs實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間通訊和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。EVs通過質(zhì)膜融合、大胞飲作用及網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用被受體細(xì)胞吸收，然后通過物質(zhì)交換或釋放內(nèi)含物，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)和信號(hào)的交流(Parolinietal., 2009; Commissoetal., 2013; Tianetal., 2014; Kamerkaretal., 2017; Kallurietal., 2020)。除了在疾病方面的特異性診斷與靶向治療應(yīng)用外，EVs與病原體互作模式的研究領(lǐng)域已成為分析病原體擴(kuò)散、傳播的重要手段。利用EVs生成途徑，病毒的整體或部分核酸、膜蛋白及受體細(xì)胞調(diào)控小分子(mRNA、miRNA、ncRNA、cirRNA等)，甚至完整病毒顆粒(Silvasetal., 2016)得以從宿主細(xì)胞中釋放并擴(kuò)散或傳播至新的受體細(xì)胞或宿主動(dòng)物(Andersonetal., 2016; Altan-Bonnetetal., 2019)。EVs除了可以轉(zhuǎn)運(yùn)病毒及病毒組分，還可運(yùn)載功能蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、核酸等生物活性分子，調(diào)控受體細(xì)胞免疫或者凋亡，為病毒入侵做準(zhǔn)備，實(shí)現(xiàn)免疫逃避，進(jìn)而成功入侵機(jī)體。幾乎所有的真核細(xì)胞都會(huì)分泌EVs (Raposoetal., 1996；Zitvogeletal., 1998；Raposoetal., 2013)，并且EVs天然存在各種體液中 (Kallurietal., 2020)，這一特點(diǎn)再次為EVs介導(dǎo)病原體傳播提供研究實(shí)證。為此，本研究在已明確EVs介導(dǎo)病原體傳播的基礎(chǔ)上，采用對維持血管動(dòng)態(tài)平衡起著重要作用的HUVEC細(xì)胞對感染SFTSV的Vero細(xì)胞分泌的EVs(SFTSV-EVs)與游離的SFTSV的傳播速率進(jìn)行觀察，利用網(wǎng)格蛋白抑制劑(Pitstop2)和外泌體合成/釋放抑制劑(GW4869)對SFTSV的胞間傳播進(jìn)行抑制，探討基于EVs抑制SFTSV阻斷傳播的可能性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和病毒株

細(xì)胞系為非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero系)、人成角質(zhì)上皮細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞系)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC細(xì)胞系)為本實(shí)驗(yàn)室長期傳代培養(yǎng)細(xì)胞系，凍存于液氮罐中。SFTSV為河南省信陽株，在研究室Ⅱ級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室長期擴(kuò)繁，并凍存于-80 ℃冰箱。

1.2 主要試劑

胎牛血清(Gibco公司)、去外泌體胎牛血清(SBI公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(Promega)、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ScienCell)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、GW4869(Med Chem Express)、Pitstop2(Med Chem Express)、二甲基亞砜—DMSO(Solarbio)、Viral RNA Isolation Kits(QIGEN)。

1.3 SFTSV-EVs感染動(dòng)力學(xué)分析

為了確認(rèn)SFTSV-EVs的感染動(dòng)力學(xué)，在感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)=0.001的條件下，用SFTSV-EVs感染HUVEC細(xì)胞，加入ECM1001完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取感染3、6、12、24、48、72、96 h的下層細(xì)胞檢測細(xì)胞病毒載量。對照組為SFTSV感染，其他實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)驗(yàn)組一致。

1.4 GW4869抑制EVs的釋放

依據(jù)GW4869試劑使用說明及對文獻(xiàn)(Zhouetal., 2018; Regmietal., 2020)的研究方法進(jìn)行調(diào)整，將Vero細(xì)胞傳至0.4 μm的細(xì)胞小室中，在前一天鋪好Vero細(xì)胞的細(xì)胞小室中加入1 mL 10 μmol/L GW4869 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h；將SFTSV-EVs稀釋至適合的倍數(shù)，每孔細(xì)胞小室加入100 μL染毒90 min后用PBS清洗3次；然后將細(xì)胞小室接種在鋪好 HaCaT細(xì)胞的12孔板中；在培養(yǎng)6、24、48、72 h取下層細(xì)胞檢測細(xì)胞病毒載量。對照組為DMSO組，其他實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)驗(yàn)組(GW4869組)一致。

1.5 Pitstop2抑制SFTSV的傳播

按照Pitstop2試劑使用說明和文獻(xiàn)(Zhouetal., 2018)進(jìn)行方法優(yōu)化，將Vero細(xì)胞傳至12孔板中，培養(yǎng)24 h后分別加入1 mL 15、30、45 μmol/L Pitstop2 并于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育15 min；然后再將SFTSV-EVs稀釋至適合的倍數(shù)，每孔細(xì)胞小室加入200 μL染毒90 min后用PBS清洗3次；加入1 mL細(xì)胞維持液培養(yǎng)72 h后，用PBS清洗3次后，檢測細(xì)胞病毒載量。對照組為DMSO組，其他實(shí)驗(yàn)條件與Pitstop2組一致。

按照細(xì)胞培養(yǎng)的操作方法，將Vero細(xì)胞傳至0.4 μm的細(xì)胞小室中，在前一天鋪好Vero細(xì)胞的細(xì)胞小室中加入1 mL 15 μmol/L GW4869 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育15 min；將SFTSV-EVs稀釋至適合的倍數(shù)，每孔細(xì)胞小室加入200 μL染毒90 min后用PBS清洗3次；然后將細(xì)胞小室接種在鋪好 HaCaT細(xì)胞的12孔板中；在6、24、48、72 h用PBS清洗3次后，取下層細(xì)胞檢測細(xì)胞病毒載量。對照組為DMSO組，其他實(shí)驗(yàn)條件與Pitstop2組一致。細(xì)胞病毒載量的檢測方法，參照文獻(xiàn)(Huetal., 2020)及試劑使用說明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)，資料服從正態(tài)分布，采用均值形式描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。SFTSV 載量分析多組間方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以雙側(cè)P<0.05和P<0.01為顯著和極顯著差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFTSV-EVs與SFTSV侵染宿主細(xì)胞動(dòng)力學(xué)分析

在SFTSV-EVs感染HUVEC動(dòng)力學(xué)分析中，研究發(fā)現(xiàn)在3、6、12、24 h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，SFTSV-EVs組細(xì)胞病毒載量明顯高于SFTSV組，并在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)(48、72、96 h)均高于SFTSV組，但在48 h后SFTSV-EVs組與SFTSV組病毒增殖都進(jìn)入平臺(tái)期，之后二者病毒含量越來越接近(圖1)。值得注意的是，在染毒培養(yǎng)后第3 h時(shí)，對SFTSV-EVs組與游離的SFTSV組的細(xì)胞病毒載量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在3、6、12、24、48、72和96 h兩組的細(xì)胞病毒載量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且在3 h時(shí)SFTSV-EVs組細(xì)胞病毒載量是SFTSV組的2.292倍(圖1)。

圖1 SFTSV-EVs與SFTSV侵染HUVEC細(xì)胞動(dòng)力分析

2.2 GW4869抑制EVs介導(dǎo)的SFTSV傳播分析

將含有SFTSV的EVs接種于10 μmol/L GW4869作用24 h后的Vero細(xì)胞，然后與下層HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)，取不同時(shí)間點(diǎn)的HaCaT細(xì)胞檢測細(xì)胞病毒載量，取SFTSV RNA拷貝數(shù)的對數(shù)進(jìn)行比較，GW4869組與DMSO組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=154.389，P<0.01)，時(shí)間點(diǎn)6、24、48、72 h組間比較差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3472.814，P<0.01)。對照組DMSO組的細(xì)胞SFTSV載量隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)遞增的趨勢，而GW4869組的細(xì)胞SFTSV載量先是隨著時(shí)間增加而增加，在第24 h這一時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞SFTSV載量達(dá)到一個(gè)最低點(diǎn)，之后細(xì)胞病毒載量又隨著時(shí)間的增加而增加(圖2)。在24 h內(nèi)GW4869抑制效果先是隨著時(shí)間增加而增強(qiáng)，24 h后則隨時(shí)間增加逐漸降低。

圖2 GW4869對EVs介導(dǎo)的SFTSV傳播的抑制分析

2.3 Pitstop2抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的SFTSV傳播分析

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一培養(yǎng)時(shí)間條件下，30 μmol/L Pitstop2抑制效果最佳(圖3-a)。據(jù)此進(jìn)一步分析Pitstop2的最佳抑制時(shí)間，可以發(fā)現(xiàn)，將含有SFTSV的胞EVs接種于不同濃度Pitstop2處理15 min后的Vero細(xì)胞，然后連續(xù)培養(yǎng)72 h并于6、24、48、72 h分別檢測Vero細(xì)胞SFTSV病毒載量，對比SFTSV RNA拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)Pitstop2組與DMSO組的病毒載量都是先隨著時(shí)間的增加而增加，而后在培養(yǎng)24 h后病毒載量開始降低，并在培養(yǎng)72 h時(shí)，Pitstop2組的病毒載量明顯低于DMSO組，這表明30 μmol/L Pitstop2作用15 min后培養(yǎng)72 h的抑制效果最佳，能夠有效抑制SFTSV的感染(圖3-b)。

圖3 Pitstop2對SFTSV傳播的抑制研究

3 討論

蜱媒病毒以跨物種適應(yīng)和傳播的特性，成為解讀病毒性傳染病傳播共性規(guī)律、開展傳播阻斷新技術(shù)研發(fā)的典型代表。目前，有很多研究采用遺傳與化學(xué)方法來阻止網(wǎng)格蛋白依賴性傳播途徑(Hauckeetal., 2018)：如研究人員通過RNA干擾技術(shù)阻止細(xì)胞中的網(wǎng)格蛋白生成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在沒有網(wǎng)格蛋白的情況下，細(xì)胞分裂會(huì)變得像在癌癥等疾病中的細(xì)胞一樣，極不規(guī)律(Brodsky, 2012)。研究證實(shí)，SFTSV大多都是通過網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞(Lozachetal., 2010)，Pitstop 2 是一種網(wǎng)格蛋白抑制劑，可通過與網(wǎng)格蛋白的末端域相關(guān)聯(lián)來抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，本研究利用Pitstop2選擇性地抑制配體與網(wǎng)格蛋白末端域的結(jié)合特點(diǎn)，通過抑制SFTSV在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有效抑制SFTSV的傳播。

與其他布尼亞病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSs不同，SFTSV-NSs與IFN反應(yīng)的多種成分相互作用，并將其重新定位到細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)中(Jungbauer, 2018)。已知雙鏈RNA、病毒蛋白NP和L均參與SFTSV的復(fù)制，可共同存在于囊泡中(Altan-Bonnetetal., 2019)。這些囊泡也被發(fā)現(xiàn)與脂滴共存(Wuetal., 2014)。此外，影響脂肪酸合成的抑制劑對這些棘突狀結(jié)構(gòu)的形成以及病毒復(fù)制都有負(fù)面影響(Wuetal., 2014)。這些研究為這些結(jié)構(gòu)的來源提供了初步證據(jù)，但對于這些結(jié)構(gòu)是如何包裝病毒RNA并在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，以及如何在MVB中結(jié)合糖蛋白形成具有感染性的病毒粒子目前仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，SFTSV相關(guān)的EVs被釋放至細(xì)胞外，并被鄰近細(xì)胞所攝取，這是一種新的由EVs介導(dǎo)的SFTSV傳播模式，其感染宿主細(xì)胞可能是經(jīng)過EVs膜與宿主細(xì)胞膜相融合而釋放囊泡內(nèi)含物作用，或者EVs與宿主細(xì)胞表面受體相結(jié)合而相互作用，亦或者直接通過巨胞飲進(jìn)入宿主細(xì)胞而作用。

本研究通過對EVs介導(dǎo)的SFTSV與游離的SFTSV傳播速率進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)SFTSV-EVs感染HUVEC細(xì)胞后3 h時(shí)就形成了大范圍的侵染增殖。相比于游離的SFTSV來說，SFTSV-EVs能夠更快地侵染宿主細(xì)胞，并在較短的感染時(shí)間內(nèi)形成大量增殖，表明EVs介導(dǎo)的SFTSV傳播可使得SFTSV在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量復(fù)制增殖，傳播速率明顯高于游離SFTSV，這可能是因?yàn)镾FTSV是通過網(wǎng)格蛋白受體依賴性傳播，而EVs介導(dǎo)的SFTSV傳播是通過不依賴于網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用和巨噬細(xì)胞吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞，亦或者是因?yàn)镋Vs膜與宿主膜的同質(zhì)性而直接融合進(jìn)入細(xì)胞 (Costa Verderaetal., 2017; Shafaq-Zadahetal., 2020)。而隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加，SFTSV-EVs組與SFTSV組病毒增殖都進(jìn)入平臺(tái)期，之后二者病毒含量越來越接近，可能是因?yàn)樗拗骷?xì)胞在感染游離的SFTSV后也會(huì)產(chǎn)生SFTSV-EVs，并且新產(chǎn)生的SFTSV-EVs又會(huì)重新侵染HUVEC細(xì)胞，因而，隨著SFTSV-EVs與游離的SFTSV侵染宿主細(xì)胞后培養(yǎng)的時(shí)間越長，兩者病毒載量越接近。GW4869是非競爭性的中性鞘磷脂(N-Smase)抑制劑，也稱EVs合成/釋放抑制劑，可以通過抑制神經(jīng)酰胺水解從而抑制囊泡的形成。本研究通過觀察GW4869對SFTSV傳播的抑制效果，發(fā)現(xiàn)10 μmol/L 的GW4869對SFTSV增殖抑制具有時(shí)段效應(yīng)，24 h時(shí)抑制效果最佳。GW4869可以在濃度依賴的條件下保護(hù)細(xì)胞免于死亡并抑制神經(jīng)酰胺(SM)被水解途徑形成囊泡，能夠有效抑制SFTSV的感染傳播。

這種由EVs所介導(dǎo)的SFTSV傳播模式是一種非受體依賴性傳播模式，區(qū)別于以往的網(wǎng)格蛋白依賴性傳播模式，這種新的病毒傳播模式具有更快的時(shí)效性、更高的宿主適應(yīng)性及更廣泛的宿主譜(Zhouetal., 2018)，且可以使病毒完美地實(shí)現(xiàn)對中和抗體脅迫的免疫逃逸(Andersonetal., 2016)。這提示由EVs發(fā)生途徑入手可以開發(fā)出更有效的病原體傳播防控策略，未來需要對EVs的發(fā)生機(jī)制及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)行深入研究，以期找到更多科學(xué)、有效地抑制病原體傳播及治療的新策略，以推動(dòng)以傳播阻斷為主要方式的蟲媒病預(yù)防策略和防控新技術(shù)的發(fā)展。