鄭煒智 劉炳輝 盛玲玲 游淑清 潘冰

1.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院病理科，浙江臺(tái)州 318020；2.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江臺(tái)州 318020

大腸癌是臨床中最常見的惡性腫瘤之一，近年來研究數(shù)據(jù)顯示，我國大腸癌患者人數(shù)逐年增加，并且患者越來越年輕化。大腸癌患者手術(shù)切除腫瘤后，有40%的患者因?yàn)椴∏閻夯?、?fù)發(fā)導(dǎo)致死亡。因此，對(duì)大腸癌做到早期診斷、治療，患者預(yù)后評(píng)估、提高生存率已經(jīng)逐漸成為臨床研究的重中之重。聯(lián)絲蛋白（synemin，SYNM）屬于一種中間絲蛋白質(zhì)，其具有較長的C 末端結(jié)構(gòu)域，可與紐蛋白、α–肌動(dòng)蛋白等相關(guān)蛋白結(jié)合，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮黏附、收縮功能，參與細(xì)胞轉(zhuǎn)移、黏附過程。乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體中大量存在，參與細(xì)胞增生、分化等多種生物學(xué)過程，ALDH1 是ALDH 家族中的主要組成部分，其表達(dá)水平異常，參與多種腫瘤發(fā)展過程。β–半乳糖苷結(jié)合蛋白屬于一種凝集素家族，半乳糖凝集素–3（Galectin–3）是其重要成員，主要在免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞中表達(dá)，在細(xì)胞增生、凋亡、分化中均有作用。本研究探討SYNM、ALDH1、Galectin–3 在大腸癌中的表達(dá)及與病理特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年8 月至2019 年8 月在臺(tái)州市第一人民醫(yī)院病理科保存的大腸癌組織標(biāo)本74 例，設(shè)為大腸癌組，其中男42 例，女32 例；年齡30～78 歲，平均（51.30±20.10）歲；患病部位：直腸39 例，結(jié)腸35 例；分化程度：高分化13 例，中分化41 例，低分化20 例；TNM 分期：Ⅰ期12 例，Ⅱ期14 例，Ⅲ期21 例，Ⅳ期27 例；浸潤深度：未超過肌層40例，超過肌層或漿膜層34 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移49 例，無轉(zhuǎn)移25 例。另選取同期在臺(tái)州市第一人民醫(yī)院病理科保存的正常大腸黏膜（距離癌組織>5.0cm）74 例設(shè)為對(duì)照組。本研究經(jīng)臺(tái)州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2020– KY022–02）。患者及其家屬均知情并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：74 例大腸癌患者均符合大腸癌的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且經(jīng)過病理學(xué)確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)其他惡性腫瘤患者；②進(jìn)行放療、化療患者；③精神、意識(shí)障礙患者；④心、肺等重要器官損傷患者；⑤合并免疫系統(tǒng)疾病患者；⑥合并感染疾病患者。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 將兩組組織標(biāo)本制成4μm 厚度切片，60℃烘烤50min，進(jìn)行二甲苯脫蠟處理，使用遞減梯度乙醇脫二甲苯；在3%過氧化氫中孵育10min，將組織中內(nèi)源性過氧化物酶活性清除干凈，之后采用蒸餾水清洗干凈，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）浸潤5min，在微波爐中將0.01mol/L 的枸櫞酸鈉緩沖液加熱至沸騰后將兩組組織切片置入其中，給予抗原修復(fù)15min，室溫靜置4min，再次采用PBS 溶液連續(xù)沖洗3 次，每次5min，滴加50μl 的一抗（SYNM、ALDH1、Galectin–31∶80工作液），4℃過夜保存。之后采用PBS 溶液沖洗3次，每次5min；滴加二抗（羊抗鼠或羊抗兔IgG 聚合物），溫室孵育10min；PBS 溶液再次沖洗，通過DAB 顯色5min，采用蒸餾水沖洗干凈。最后使用蘇木精給予復(fù)染，封片進(jìn)行顯微鏡下觀察。

1.3.2 陽性結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)半定量積分法給予SYNM、ALDH1、Galectin–3 陽性結(jié)果判定，陽性細(xì)胞是指染色為棕黃色、棕色顆粒細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取10 個(gè)視野，計(jì)數(shù)為100 個(gè)細(xì)胞，（1）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分表示陽性細(xì)胞<5%，1 分表示陽性細(xì)胞6%～25%，2 分表示陽性細(xì)胞26%～50%，3 分表示陽性細(xì)胞51%～75%，4 分表示陽性細(xì)胞>75%。（2）陽性強(qiáng)度評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：0 分表示細(xì)胞無染色，1 分表示細(xì)胞呈淺黃色，2 分表示細(xì)胞為黃色，3 分表示細(xì)胞為棕褐色。最終陽性結(jié)果評(píng)估是（1）+（2）結(jié)果：0分為（–），1～2 分為（+），3～4 分為（++），5～6分為（+++）；（–）為陰性，（+）表示弱陽性，（++）表示中等陽性，（+++）表示強(qiáng)陽性。陰性、弱陽性視為陰性，中等陽性、強(qiáng)陽性視為陽性。SYNM、ALDH1、Galectin–3 染色結(jié)果均由2 名以上經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行評(píng)估完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計(jì)數(shù)資料以例（百分比）[（%）]表示，組間比較采用χ檢驗(yàn)?；颊咝g(shù)后總體生存分析采用Kaplan–Meier 法完成。<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者SYNM、ALDH1、Galectin–3 陽性表達(dá)情況比較

與對(duì)照組比較，大腸癌組SYNM 陽性表達(dá)下降，ALDH1、Galectin–3 陽性表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見表1、圖1。

圖1 SYNM、ALDH1、Galectin-3 在兩組組織中的表達(dá)（IHC）

表1 兩組患者SYNM、ALDH1、Galectin-3 陽性表達(dá)情況比較[n（%）]

2.2 不同因素患者SYNM、ALDH1、Galectin-3 的陽性表達(dá)情況比較

男性、女性患者，≤60 歲、>60 歲患者，浸潤深度未超過肌層、超過肌層或漿膜層患者SYNM、ALDH1、Galectin–3 陽性表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者 SYNM 陽性表達(dá)較低，ALDH1、Galectin–3 陽性表達(dá)較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。與腫瘤最大徑<2.0cm 患者相比，2.0～5.0cm、>5.0cm 患者ALDH1、Galectin–3 陽性表達(dá)較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。直腸、結(jié)腸患病部位患者SYNM、ALDH1、Galectin–3 陽性表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。與高分化程度患者相比，低、中分化程度患者SYNM 陽性表達(dá)較低，ALDH1、Galectin–3 陽性表達(dá)較高；且中分化程度患者ALDH1、Galectin–3 陽性表達(dá)高于低分化程度患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期患者SYNM 陽性表達(dá)低于Ⅰ、Ⅱ期患者，ALDH1、Galectin–3 陽性表達(dá)高于Ⅰ、Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見表2。

表2 不同因素患者SYNM、ALDH1、Galectin-3 陽性表達(dá)情況比較[n（%）]

2.3 大腸癌患者生存率比較

通過手機(jī)、微信、QQ 等形式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪至2020 年8 月，統(tǒng)計(jì)SYNM ALDH1、Galectin–3陽性、陰性患者存活狀況。SYNM 陰性表達(dá)和ALDH1、Galectin–3 陽性表達(dá)患者生存率分別低于SYNM 陽性表達(dá)和ALDH1、Galectin–3 陰性表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見圖2。

圖2 大腸癌患者Kaplan-Meier 生存曲線

3 討論

目前臨床中對(duì)大腸癌主要采用手術(shù)治療，以全身、局部放療、化療為輔，但大多數(shù)患者手術(shù)后仍然容易復(fù)發(fā)，引起肝轉(zhuǎn)移。也有研究認(rèn)為，對(duì)大腸癌患者做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，是提高大腸癌患者術(shù)后存活率的關(guān)鍵，分析大腸癌相關(guān)蛋白、基因表達(dá)，有利于對(duì)疾病機(jī)制研究，為患者的綜合治療提供理論依據(jù)。大腸癌發(fā)病過程需要多種基因參與，多種步驟相互協(xié)同，屬于一種漸進(jìn)性過程。

SYNM 屬于一種Ⅳ型中間絲蛋白，在哺乳動(dòng)物心、骨骼肌中廣泛存在，并且在一些神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)。因自身結(jié)構(gòu)的特殊性，不能自我聚合產(chǎn)生細(xì)絲，通過與結(jié)蛋白、Ⅲ型波形蛋白結(jié)合，發(fā)揮共聚作用，通過與LIM 域蛋白相互影響，對(duì)細(xì)胞黏附運(yùn)動(dòng)有明顯的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，在大腸癌患者中SYNM 陽性表達(dá)較低，孫伯堯等研究通過二維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用及免疫印跡技術(shù)也發(fā)現(xiàn)，SYNM 在大腸癌患者組織中表達(dá)下降。本研究中，SYNM 陽性表達(dá)的高低受大腸癌患者腫瘤最大徑、分化程度、TNM 分期的影響，提示SYNM 表達(dá)與大腸癌患者病理特征有關(guān)。Deville等研究認(rèn)為，SYNM 表達(dá)異常會(huì)引起宮頸癌轉(zhuǎn)移。在本研究中，SYNM 陽性表達(dá)高低與大腸癌患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

ALDH1 屬于一種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，在乳腺癌、肝癌、肺癌等多種癌癥組織中均有表達(dá)，并且對(duì)其浸潤、轉(zhuǎn)移具有一定的促進(jìn)作用。有研究顯示，ALDH1 表達(dá)水平的高低與口腔鱗癌患者預(yù)后以及治療耐受狀況有關(guān)，當(dāng)患者放棄放療后，ALDH1 表達(dá)下降，說明ALDH1 在腫瘤發(fā)展中有明顯的參與作用。本研究中，大腸癌患者ALDH1 陽性表達(dá)較高，提示ALDH1 可能參與大腸癌患者病情發(fā)展以及大腸癌轉(zhuǎn)移、浸潤過程。田靜等的研究也證實(shí)這一觀點(diǎn)。

Galectin–3 是一種基質(zhì)金屬蛋白酶2 的底物，參與腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤過程，Galectin–3 具有糖親和性的特點(diǎn)，能抑制細(xì)胞凋亡。Matsuda等研究指出，Galectin–3 表達(dá)升高會(huì)增加內(nèi)皮細(xì)胞的親和性，增強(qiáng)癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，參與腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲過程。導(dǎo)致大腸癌患者病死率較高的原因是癌細(xì)胞的不斷轉(zhuǎn)移和浸潤，基底膜完整性被破壞。在本研究中，ALDH1、Galectin–3 陽性表達(dá)和SYNM 陰性表達(dá)患者存活率較低，提示SYNM、ALDH1、Galectin–3 表達(dá)水平的高低與患者的預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，SYNM 在大腸癌組織中低表達(dá)，ALDH1、Galectin–3 在大腸癌組織中高表達(dá)，三者陽性表達(dá)高低與患者腫瘤直徑、分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，三者聯(lián)合檢測(cè)在大腸癌患者預(yù)后中具有重要意義。但因本文所納入樣本量較少，所以其具體臨床效果還需要進(jìn)一步分析研究，才能更好地為臨床所用。