馮珊珊金 毅婁東曉魏孟超謝泳嬌王汝仙李 靜*

(1.廣東東陽光藥業(yè)有限公司,廣東 東莞 523871;2.深圳市藥品檢驗研究院(深圳市醫(yī)療器械檢測中心),深圳 518057)

在生物學、基礎醫(yī)學、藥理學研究和新藥評價中,實驗動物具有非常重要的地位,但隨著動物福利日益受到重視,3R原則(reduction,replacement,refinement)的廣泛接受,實驗動物替代技術逐漸被學術界認可[1]。近年來,器官芯片(organ-on-achip)、類器官(organoid)、細胞球(spheroid)等三維(3D)細胞模型技術的發(fā)展為實驗動物替代提供了便利條件[2-4]。我國最新發(fā)布的《基因修飾細胞治療產(chǎn)品非臨床研究技術指導原則(試行)》已明確將3D細胞模型納入評估藥物有效性和安全性的候選模型[5]。研究類器官或細胞球的組織形態(tài)特征、組織病理學、基因表達的時空分布通常采用冰凍切片或石蠟切片結合組織化學染色、免疫熒光染色等。冰凍切片雖然具有制片簡便快速的優(yōu)點,但也具有保存時間較短,制片過程中冰晶的形成可能影響抗原定位等缺點[6]。石蠟切片具有組織結構保存良好,貼片牢固、抗原定位準確、可長期保存等優(yōu)點。但由于類器官或細胞球的培養(yǎng)體系復雜,體積小,組成相對單一,制作病理切片難度較大。傳統(tǒng)細胞球或類器官石蠟切片采用瓊脂、瓊脂糖、蛋清等預包埋,存在制片過程復雜,耗時長,受瓊脂糖濃度和熔融狀態(tài)的影響還可能導致浸蠟不充分,不易切片,在加入瓊脂過程中因溫度原因極易凝固、脫水時易收縮、瓊脂含水量高導致脫水時間過長等問題,這在一定程度上限制了石蠟切片技術在3D細胞模型研究中的應用[7-10]。本研究結合3D細胞模型的特點,通過對經(jīng)典石蠟包埋切片技術進行改良,旨在建立一種適合于3D細胞培養(yǎng)模型的、快速高效的石蠟切片技術及其染色方法,為3D細胞培養(yǎng)模型形態(tài)、功能、及應用研究提供便利的病理技術平臺。

1 材料和方法

1.1 細胞系

人肝癌細胞HepG2細胞來自美國菌種保藏中心(貨號:HB-8065);人肝星形細胞LX-2細胞購于美國默克公司(貨號:SCC064)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司,貨號:SH30809.01B);胎牛血清(美國Gibco公司,貨號:10099141C);青霉素-鏈霉素混合液(美國Hyclone公司,貨號:SV30010);10%中性福爾馬林(北京索萊寶科技有限公司,貨號:G2161);鱗片狀切片石蠟(德國Leica公司,貨號:39601006);0.5%水溶性伊紅染液、蘇木素(珠海貝索生物科技有限公司,貨號:BA4024、BA4041);抗 熒 光 淬 滅 封 片 液、QuickBlockTM免疫染色封閉液、免疫染色通透液(碧云天生物,貨號:P0131、P0260、P0096);抗體(美國Abcam公 司,貨 號:ab207327、ab8798、ab150077、ab150120、ab6721)。超 低 吸 附96孔 板(美 國Corning公司,貨號:4515);全自動組織脫水機(美國Thermo Scientific公司,型號:Excelsior AS);石蠟包埋機(德國美康公司,型號:EC360);石蠟切片機(德國美康公司,型號:HM340E);自動染色一體機(德國Leica公司,型號:STS020);倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司,型號:DM i8)。

1.3 實驗方法

1.3.1 3D細胞球培養(yǎng)

將HepG2細胞或/和LX-2細胞以2000～5000個/孔的密度,不同比例接種至超低吸附96孔培養(yǎng)板中[11],置于CO2培養(yǎng)箱內,5% CO2,37℃靜置培養(yǎng)3～5 d,待細胞聚集形成質地較為緊密的,直徑為100～500 μm細胞微球時進行收集。在細胞接種至超低吸附96孔培養(yǎng)板后,也可以200 r/min離心1～2 min,能加速細胞聚集成球。

1.3.2 制作石蠟切片

收集培養(yǎng)的3D細胞球至離心管中,待細胞球沉淀或低速離心至離心管底部后,移除上清培養(yǎng)基,加入適量的10%的中性福爾馬林,室溫固定20～30 min。因細胞球十分微小,可在固定過程中加入幾滴水溶性伊紅染液對樣品染色2 min,使樣品標記為紅色,便于后續(xù)操作中識別樣品。移除伊紅染液,依次按照75%乙醇5 min,90%乙醇5 min,95%乙醇3 min,無水乙醇連續(xù)3次、每次5 min的順序進行脫水。加入適量的二甲苯,進行透明,連續(xù)3次,每次5 min。若樣品較多,脫水和透明的過程也可以采用全自動組織脫水機,但因細胞球體積微小,需先將樣品用濾紙包好,再放入包埋盒中,以防止丟失。將透明后的細胞球轉移至裝有液體石蠟的包埋底模中,置于65℃恒溫加熱臺或烘箱10 min,取出后立即置于冷板上使含細胞球的液體石蠟快速凝固。切片厚度設置為3 μm,將切下的一層蠟帶置于冷水中,用玻片在冷水中撈起蠟帶,將其置于溫水中使其展平,再貼于載玻片上于顯微鏡下初步觀察細胞球切割情況。將切好的片子置于42℃烘箱中烘烤30 min,置于4℃冰箱內備用。染色前進行脫蠟復水,將切片于室溫二甲苯中浸泡5 min,更換二甲苯,重復3次。100%乙醇浸泡切片3 min,連續(xù)2次;95%乙醇浸泡切片2 min;70%乙醇浸泡切片2 min。

1.3.3 HE、免疫組化和免疫熒光染色

(1)HE染色

將切片脫蠟、復水后進行常規(guī)HE染色:去離子水沖洗2 min,蘇木素染液浸染5 min,自來水沖洗1 min,鹽酸-乙醇溶液分化3 s,碳酸鋰稀溶液藍化30 s,自來水浸泡10 min,伊紅染液浸染10 min,依次經(jīng)95%乙醇(2次,每次1 min)、無水乙醇(3次,每次1 min)脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

(2)免疫組化染色

將切片脫蠟、復水后進行免疫組織化學染色:抗原修復,將裝有切片的架子放入PBS (0.01 mol/L,pH 7.2～7.4)內清洗,微波爐加熱Tris/EDTA抗原修復液(10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA,0.05%吐溫-20,pH 9.0)到100℃,將裝有切片的玻片架放入煮沸的Tris/EDTA修復液中,中火加熱20 min,取出容器放置冰水中快速冷卻10 min左右。含0.025% Triton X-100的1×TBS(pH 7.6)孵育樣品10 min,PBS洗滌3次,每次5 min。用封閉液(含10%山羊血清、1%BSA的1×TBS)在37℃下封閉1 h。滅活過氧化物酶:37℃復溫45 min;用含0.025% Triton X-100的TBS漂洗3次;將玻片在含0.3% H2O2TBS中孵育15 min。使用含1% BSA的1×TBS稀釋一抗,滴加100～200 μL至組織上,于濕盒內4℃過夜孵育。使用1×TBS稀釋二抗,室溫下避光孵育1 h。清洗后滴加顯色劑DAB,反應1 min。蘇木精復染,乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

(3)免疫熒光染色

將切片脫蠟、復水后進行抗原修復、通透和封閉,方法同免疫組化染色。使用含1% BSA的1×TBS稀釋一抗,滴加100～200 μL一抗至組織,于濕盒內4℃過夜孵育。移除一抗,PBS洗3次,每次5 min;滴加100～200 μL 1×TBS稀釋的二抗至組織,于濕盒中室溫下避光孵育1 h。滴加10～20 μL 含抗熒光淬滅劑的封片液(含DAPI),孵育10 min,PBS洗去多余的封片液。在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2 結果

2.1 3D細胞球包埋流程優(yōu)化

本研究中3D細胞球石蠟包埋的流程如圖1。在細胞聚集形成直徑100～500 μm、質地緊密的微球時收集固定。該流程從固定到完成包埋耗時僅80～90 min。在脫水前,先用伊紅對細胞球染色標記,可明顯提高細胞球的能見度,有利后續(xù)操作。

圖1 細胞球的培養(yǎng)和石蠟包埋Note. A, Cellular spheroids culture. B, Operation flow chart of embedding. C, Fixed and paraffin-embedded spheroids (unmarked). D, Fixed and paraffin-embedded spheroids (marked with eosin).Figure 1 Culture and embedding of cellular spheroids

2.2 HE染色

本方法制作的切片細胞球結構完整,細胞界限清晰,呈卵圓形,單個分布。HE染色質核分明,細胞形態(tài)完整,細胞活力高,核心無壞死;LX-2細胞所形成的細胞球體積較小,結構更為致密,HepG2細胞形成的細胞球體積較大,結構相對松散(圖2)。

圖2 細胞球HE染色Note. A, LX-2 cells. B, HepG2 cells.Figure 2 Hematoxylin and eosin staining of multicellular spheroids

2.3 免疫組化染色

免疫組化標記HepG2細胞表達的白蛋白呈棕色彌漫狀主要分布于HepG2和LX-2細胞共培養(yǎng)細胞球的內部,外周較少,細胞核藍染(圖3)。

圖3 免疫組織化學染色顯示白蛋白在HepG2和LX-2細胞共培養(yǎng)細胞球中的表達Figure 3 Albumin was detected by immunohistochemistry in multicellular spheroids of HepG2 cells co-culturing with LX-2 cells

2.4 免疫熒光染色

免疫熒光分別用綠色熒光標記HepG2細胞表達的白蛋白,紅色熒光標記LX-2細胞表達的波形蛋白,以及DAPI標記細胞核,可見在HepG2和LX-2共培養(yǎng)細胞球中,白蛋白主要分布于細胞球的內部,波形蛋白主要分布于細胞球的周邊,內部數(shù)量較少(圖4),該結果與免疫組化染色結果一致。這說明在HepG2細胞和LX-2細胞共培養(yǎng)的細胞球中,兩種細胞的空間分布特點是不同的,HepG2細胞集中于細胞球內部,LX-2細胞主要在細胞球的周邊。

圖4 免疫熒光顯示白蛋白和波形蛋白在HepG2和LX-2細胞共培養(yǎng)細胞球中表達Note. A, 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). B, Albumin. C, Vimentin. D, Merged.Figure 4 Albumin and vimentin were detected by immunofluorescence in multicellular spheroids of HepG2 cells co-culturing with LX-2 cells

3 討論

本研究根據(jù)3D細胞培養(yǎng)模型的特點,對傳統(tǒng)石蠟切片的制備方法進行了改進,從細胞球的收集到蠟塊制備完成耗時不到2 h,縮短了制片時間,顯著提高實驗效率。而以往報道的類器官石蠟切片制備方法完成同樣的過程耗時約4～30 h,且成片的組織結構松散,給組織鑒定增加了難度[12-14]。本方法操作簡便,無需離心富集,無需瓊脂糖、蛋清等預包埋,固定、脫水、透明、浸蠟等步驟都根據(jù)樣品特點進行了優(yōu)化。本方法可操作性和實用性強,制作的切片結構完整、細胞界限清楚,制作的切片可行HE染色、免疫組織化學染色和免疫熒光染色,均能取得良好的效果。

本文介紹的方法較一般石蠟切片制備方法的耗時短很多,主要在于縮短了固定、脫水、浸蠟、烤片等步驟的時間,這主要源于細胞球樣品體積較小,試劑滲透較快。在我們的實踐中,這種快速的蠟塊制備方法適用于直徑50～1000 μm的細胞球或類器官,若樣品體積更大,則應適當延長上述過程的時間。值得注意的是腫瘤球模型在直徑超過500 μm左右時,大多數(shù)會出現(xiàn)中心區(qū)的細胞壞死,所以,在培養(yǎng)細胞球時,應根據(jù)細胞的實際生長情況控制其大小[15]。

相較于病理切片中常見的組織,3D細胞球或類器官體積微小、幾乎無色透明且細胞成分相對簡單,導致樣本具有不易收集、易丟失、易損壞等特點,從而增加了樣品包埋和切片的難度。本研究在樣本固定后脫水前,采用了水溶性伊紅進行樣本標記,克服了上述操作難點。標記后的細胞球呈紅色,在蠟塊中清晰可見,便于后續(xù)切片和制片,并且該染色在復水過程中可被洗去,不影響對切片進行其他染色的效果。為保證樣本的結構完整性,在能保證固定和脫水充分的前提下,應盡量縮短這些過程的時間,且在樣本處理時,動作應盡量輕柔。

細胞球和類器官作為不同的3D細胞模型,各有優(yōu)勢,細胞球的培養(yǎng)更為簡單,成本適中,易于實現(xiàn);類器官在組成和功能上與真實器官相似度更高。如3D腫瘤球模型,相比較2D平面培養(yǎng)的細胞,腫瘤球模型結構上非常類似體內無血管的腫瘤小結節(jié),更適合作為腫瘤相關研究的體外模型[16]。本文中所用的肝細胞和星形細胞混合培養(yǎng)的細胞球,可用于構建肝脂肪變性和肝纖維化模型,進行藥物篩選[11]。雖然細胞球和類器官在細胞來源、構建難易程度、應用上有一定的差異,但由于二者組成和體積類似,對其形態(tài)結構、組織病理的研究手段是相通的,均可借助病理技術手段對其結構和功能進行鑒定。本文所述的快速石蠟切片不僅適用于各種細胞球,也適用于體積相似的類器官模型。

該快速石蠟切片方法雖然縮短了制片時間,但仍使用了甲醛、二甲苯等試劑,對于免疫活性容易被破壞的抗原在進行免疫組化染色或免疫熒光染色前,仍需進行抗原熱修復。本文介紹的適用于3D細胞模型的快速石蠟切片技術有助于細胞球、類器官等動物替代模型在研究中的應用,加快研究進程。