黃小鳳，袁 葉，余金昌，招勝堅(jiān)，韋陽(yáng)連

（東莞植物園，廣東 東莞 523086）

高等植物的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（nrDNA ITS，包括ITS1、5.8S和ITS2），在核基因組內(nèi)是高度重復(fù)的，這些拷貝位于同一染色體或不同染色體上［1］。nrDNA ITS通常是以致同進(jìn)化模式進(jìn)行，在這種模式下，ITS通過(guò)不等交換、基因轉(zhuǎn)換和基因擴(kuò)增等方式使得不同ITS拷貝的序列基本趨于一致或完全一致［2-4］，因此，同一物種基因組內(nèi)ITS序列多樣性會(huì)傾于降低或消失，即ITS序列在物種內(nèi)極少出現(xiàn)多態(tài)性，其多態(tài)性常存在于物種間。ITS序列進(jìn)化速率快，片段長(zhǎng)度適中，能夠提供較多的變異信息，因此常用于植物系統(tǒng)發(fā)育研究。

隨著研究的深入，越來(lái)越多的研究表明，ITS序列多樣性不僅存在于植物基因組間，在植物基因組內(nèi)也存在較高的多態(tài)性，某些物種內(nèi)甚至個(gè)體內(nèi)的ITS序列存在致同進(jìn)化不完全現(xiàn)象，拷貝之間存在明顯的差異，一些ITS拷貝可能由于功能退化而變成假基因［5-8］。據(jù)報(bào)道，裸子植物中，松科（Pinaceae）、買麻藤屬（GnetumL.）、蘇鐵屬（CycasL.）等多種植物基因組內(nèi)均存在ITS序列多態(tài)性［8-13］；被子植物中，梨屬（PyrusL.）和櫟屬（QuercusL.）、四照花亞屬［Cornussubg.Syncar-pea（Nakai）Q.Y.Xiang］等植物基因組內(nèi)也存在ITS序列多態(tài)性，同一物種不同個(gè)體間、甚至同一個(gè)體的不同克隆間均存在ITS序列多態(tài)性［14-16］。這些發(fā)現(xiàn)成為應(yīng)用ITS序列進(jìn)行進(jìn)化分析的一個(gè)新的挑戰(zhàn)，相應(yīng)的系統(tǒng)進(jìn)化分析會(huì)因同一物種中多樣化的序列類型而無(wú)法構(gòu)建出可靠的進(jìn)化樹［17］。

荔枝（Litchi chinensisSonn.）隸屬被子植物門無(wú)患子科（Sapindaceae）荔枝屬（LitchiSonn.），著名嶺南佳果，起源于中國(guó)和越南，我國(guó)海南、廣東、廣西和云南等地現(xiàn)今仍保存有完好的野生荔枝林。荔枝品種繁多，其中絕大多數(shù)是從實(shí)生荔枝中選育出來(lái)的，從芽變選出的品種極少，通過(guò)雜交育種、誘變育種、多倍體育種等現(xiàn)代育種方法獲得的品種少有報(bào)道［18］。姜帆等［19］對(duì)無(wú)患子科不同物種的ITS序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ITS序列在龍眼、車?yán)遄?、Beguea apetala等物種的基因組內(nèi)均存在多態(tài)性。筆者在NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，ITS序列在無(wú)患子科的歐洲七葉樹、Serjania pyramidata、Paullinia stipitata等物種基因組內(nèi)也存在多態(tài)性。荔枝屬無(wú)患子科，品種繁多，其ITS序列在基因組內(nèi)是否存在多態(tài)性目前尚未知。本文以4個(gè)荔枝品種為研究對(duì)象，對(duì)其ITS片段進(jìn)行克隆測(cè)序，以期檢測(cè)這些荔枝品種的ITS序列多態(tài)性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

荔枝依據(jù)成熟果實(shí)中部果皮上的龜裂片和裂片峰的主要特征可分為3種類型：尖突型、隆起型和平坦型。本研究在3種果皮類型的荔枝種質(zhì)中各選1個(gè)品種作為供試材料?！有Α窃耘喾秶顝V、適應(yīng)性最強(qiáng)的荔枝品種，是荔枝種質(zhì)遺傳研究的理想材料，因此也被選為供試材料。4份材料（表1）均采自東莞植物園荔枝種質(zhì)資源圃。

表1 供試材料清單Tab.1 Litchi varieties used in this study

1.2 試驗(yàn)方法

將各品種的葉片樣品混合后進(jìn)行試驗(yàn)。DNA提取、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、克隆、測(cè)序均委托廣州艾基生物技術(shù)有限公司完成。所用克隆載體為pGSI，所用測(cè)序引物委托測(cè)序公司設(shè)計(jì)（F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；R：5'-AGCGGATAACAATTTCACA-CAGGA-3'）。每個(gè)品種選擇13個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.3 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

用DNAMAN9對(duì)ITS序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)Gen-Bank中已有的荔枝ITS序列確定ITS1、5.8S、ITS2的邊界和序列信息。利用DNAMAN9計(jì)算各個(gè)ITS序列的長(zhǎng)度及GC含量。用DNASP v6分析單倍型核苷酸多態(tài)性（π）和核苷酸差異平均值（K）。采用MEGA5.2對(duì)遺傳距離進(jìn)行分析，使用ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，置信度采用自引導(dǎo)法（Bootstrap analysis）重復(fù)檢測(cè)1 000次。用Arlequin3.5.2.2進(jìn)行分子方差分析（AMOVA），計(jì)算品種間、品種內(nèi)的變異方差分布。

1.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

5.8S區(qū)域相對(duì)于ITS1區(qū)域和ITS2區(qū)域而言更為保守，因此利用網(wǎng)絡(luò)在線版Mfold對(duì)所有樣本序列中5.8S二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能（△Gat 37℃）進(jìn)行測(cè)算，并分析5.8S中保守基序的堿基變化情況；同時(shí)利用在線版Mfold對(duì)ITS序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征及遺傳距離分析

將所獲得的所有序列信息在NCBI中進(jìn)行BLAST搜索，其中克隆FXZ-5、FZX-9、SJQ-1、SJQ-5、SJQ-8、XYGL-3、XYGL-10、FSHDL-3、FSHDL-4、FSHDL-8、FSHDL-9、FSHDL-10的序列搜索結(jié)果為真菌ITS序列，這是因?yàn)楸狙芯克肐TS擴(kuò)增引物為通用引物（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS5：5'-GGAAGTAA-AAGTCGTAACAAGG-3'），在實(shí)驗(yàn)中將葉片內(nèi)生真菌的ITS序列也擴(kuò)增出來(lái)，故而克隆測(cè)序結(jié)果中會(huì)出現(xiàn)真菌的ITS序列；其余克隆序列均與荔枝的ITS序列（登錄號(hào)MW070204.1）高度同源，因此選擇登錄號(hào)MW070204.1的ITS序列作為荔枝ITS對(duì)照序列。

各供試材料除去真菌的克隆序列后，‘妃子笑’、‘水晶球’、‘西園掛綠’和‘鳳山紅燈籠’共獲得40條ITS序列（尚未上傳到GenBank上）。序列比對(duì)結(jié)果顯示：40個(gè)克隆所獲序列均與ITS對(duì)照序列不同；同一荔枝品種的不同克隆之間，‘西園掛綠’的2個(gè)克隆XYGL-8和XYGL-9的序列完全一致，‘鳳山紅燈籠’的4個(gè)克?。‵SHDL-1、5、6、13）的序列完全一致；不同品種的克隆之間，除了‘西園掛綠’的克隆XYGL-11和‘鳳山紅燈籠’的4個(gè)克?。‵SHDL-1、5、6、13）的序列完全一致外，其余克隆的序列各不相同；FZX-6在ITS1區(qū)有一段27 bp的插入片段，使其序列全長(zhǎng)達(dá)642 bp。

序列分析結(jié)果顯示，40個(gè)ITS拷貝的序列全長(zhǎng)為601-642 bp，GC含量為57.17%～67.74%。其中，ITS1長(zhǎng)度為226-265 bp，GC含量為57.98%～70.19%；5.8S長(zhǎng)度均為164 bp，GC含量均為50.61%～55.49%，最小自由能為-53～-42.9 kcal/mol；ITS2長(zhǎng)度為207-222 bp，GC含量為61.32%～71.23%。

ITS序列核苷酸多態(tài)性分析結(jié)果（表2）顯示，‘妃子笑’的ITS序列核苷酸多態(tài)性π為0.028 12，平均核苷酸差異為16.564，11條ITS克隆序列中含有變異位點(diǎn)39個(gè)?！?球’的ITS序 列 核苷 酸多 態(tài) 性π為0.065 37，平均核苷酸差異為39.289，10條ITS克隆序列中含有變異位點(diǎn)155個(gè)?！鲌@掛綠’的ITS序列核苷酸多態(tài)性π為0.013 32，平均核苷酸差異為8.073，11條ITS克隆序列中含有變異位點(diǎn)23個(gè)。‘鳳山紅燈籠’的ITS序列核苷酸多態(tài)性π為0.033 04，平均核苷酸差異為19.893，8條ITS克隆序列中含有變異位點(diǎn)71個(gè)。ITS序列在荔枝品種內(nèi)的核苷酸多態(tài)性排序?yàn)椤颉尽P山紅燈籠’＞‘妃子笑’＞‘西園掛綠’。

表2 不同荔枝品種的ITS序列核苷酸多態(tài)性Tab.2 Nucleotide diversity of the ITS region in different litchi varieties

基于ITS克隆序列對(duì)荔枝進(jìn)行品種內(nèi)和品種間遺傳距離分析，結(jié)果（表3）表明荔枝ITS序列品種內(nèi)平均遺離為0.013 5～0.072 7，其排序與其品種內(nèi)核苷酸多態(tài)性排序一致，均為‘水晶球’＞‘鳳山紅燈籠’＞‘妃子笑’＞‘西園掛綠’，其中‘水晶球’品種內(nèi)平均遺傳距離（0.072 7）大于品種間平均遺傳距離（0.043 4）。

表3 荔枝品種內(nèi)、品種間遺傳距離Tab.3 Genetic distance within or between litchi varieties

為進(jìn)一步分析荔枝品種間、品種內(nèi)ITS序列的差異，運(yùn)用Arlequin軟件對(duì)其進(jìn)行AMOVA分析，結(jié)果（表4）顯示荔枝品種間的遺傳變異百分比為11.74%，而品種內(nèi)的遺傳變異百分比達(dá)88.26%，表明其品種內(nèi)遺傳多樣性水平高于品種間。

表4 4個(gè)荔枝品種遺傳變異的分子方差分析（AMOVA）Tab.4 AMOVA analysis of genetic variation of 4 litchi varieties

2.2 ITS假基因

nrDNA ITS基因家族有成千上萬(wàn)的拷貝，在進(jìn)化過(guò)程中一些拷貝可能會(huì)功能退化而變成假基因，假基因通常具有明顯的長(zhǎng)度變異、較低的GC含量、較高的最小自由能、5.8S區(qū)變異增加等特征［15，17，20］。

荔枝為種子植物，其ITS序列中的5.8S區(qū)域中應(yīng)包含3個(gè)種子植物特有的保守基序（motif 1∶CGATGAAGAACGyAGC、motif 2∶GAATTGCAGAATCC、motif 3∶TTTGAAyGCA），其中保守基序2最為保守，5.8S基序的保守性分析是假基因判定的主要標(biāo)準(zhǔn)［20-23］，通過(guò)對(duì)荔枝的40個(gè)克隆序列進(jìn)行保守基序分析，發(fā)現(xiàn)所有序列的保守基序2均無(wú)變化，部分序列的保守基序1和保守基序3有不同程度的變異（表5）：保守基序1中，SJQ-3在第50個(gè)堿基位點(diǎn)存在核苷酸的替換，SJQ-4在49、52、54這3個(gè)位點(diǎn)中存在核苷酸的替換，SJQ-6在第54個(gè)堿基位點(diǎn)有替換，F(xiàn)SHDL-7在第49個(gè)堿基位點(diǎn)存在核苷酸的替換；保守基序3中，F(xiàn)SHDL-11的第112位堿基發(fā)生替換；保守基序1和3中的替換均為C→T、G→A的轉(zhuǎn)變。SJQ-3、SJQ-4、SJQ-6、FSHDL-7、FSHDL-11等5條序列在5.8S的3個(gè)保守基序中至少有一個(gè)基序存在堿基變異，可判定為假基因。

表5 不同ITS序列拷貝5.8S中2個(gè)保守基序的核苷酸變化Tab.5 Nucleotide changes in two motifs of 5.8S of different ITS copies

對(duì)所獲各序列的長(zhǎng)度、GC含量、5.8二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由進(jìn)行排序分析，發(fā)現(xiàn)5.8S沒(méi)有變異的序列中：FZX-6的序列長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于對(duì)照，也長(zhǎng)于4個(gè)假基因（SJQ-3、SJQ-4、SJQ-6和FSHDL-7）；SJQ-9的GC含量低于5個(gè)假基因；SJQ-2、XYGL-6的二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能大于等于3個(gè)假基因（SJQ-4、FSHDL-7和FSHDL-11）。假基因的判斷存在多種標(biāo)準(zhǔn)，從序列具有明顯的長(zhǎng)度變異、GC含量較低、最小自由能較高等標(biāo)準(zhǔn)來(lái)分析，F(xiàn)ZX-6、SJQ-2、SJQ-9、XYGL-6也可判定為假基因。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析同一品種的不同克隆以及不同品種克隆之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。由圖1可知，同一荔枝品種的不同克隆沒(méi)有按照品種聚在一起。40個(gè)ITS克隆大致可分為2組：A組含32個(gè)ITS克隆，其中除了XYGL-6是假基因外，其余全部為功能基因；B組含8個(gè)ITS克隆，全部為假基因。從ML樹整體可以看出，4個(gè)荔枝品種的31個(gè)ITS功能基因首先聚在一起，顯示其親緣關(guān)系較近；4個(gè)荔枝品種的9個(gè)ITS假基因中，除了XYGL-6穿插到ITS功能基因聚類的A組外，其余8個(gè)假基因因序列變異較大，分別聚在B組的4個(gè)分支，表明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 ML phylogenetic tree based on ITS sequence

2.4 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

在4個(gè)荔枝品種的ITS功能基因中，分別選擇遺傳距離最遠(yuǎn)的兩個(gè)克?。ā有Α械腇ZX-2、FZX-12；‘水晶球’中的SJQ-7、SJQ-13；‘西園掛綠’中的XYGL-5、XYGL-13；‘鳳山紅燈籠’中的FSHDL-2、FSHDL-6），采用Mfold在線版繪制其rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖2所示，各品種中遺傳距離最遠(yuǎn)的兩個(gè)克隆因ITS片段一級(jí)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度變異以及核苷酸的轉(zhuǎn)換、顛換等變化，導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象變異較大，莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及內(nèi)部環(huán)的結(jié)構(gòu)均不相同，二級(jí)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定且不保守，說(shuō)明ITS序列在樣本內(nèi)出現(xiàn)了較為明顯的變異，發(fā)生了明顯的遺傳分化。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 rRNA secondary structure based on ITS sequence

3 討論與結(jié)論

3.1 荔枝nrDNA ITS多態(tài)性

近年來(lái)，nrDNA ITS多態(tài)性在越來(lái)越多的植物中被發(fā)現(xiàn)，如蘇鐵屬［8］、四照花亞屬［16］、龍眼屬［19］、云南山茶［24］、枸杞屬［25］等。多倍化、孤雌生殖、雜交以及基因家族在染色體上的結(jié)構(gòu)方面因素等都可能導(dǎo)致致同進(jìn)化不完全，產(chǎn)生基因組內(nèi)ITS多態(tài)性［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，荔枝nrDNA ITS在基因組內(nèi)存在多態(tài)性：4個(gè)荔枝品種的40個(gè)ITS克隆獲得了35條不同的序列，ITS序列全長(zhǎng)變異范圍為601-642 bp，ITS1長(zhǎng)度變異范圍為226-265 bp，ITS2長(zhǎng)度變異范圍為207-222 bp，其中5個(gè)克隆在5.8S區(qū)發(fā)生了變異。荔枝nrDNA ITS序列多態(tài)性不僅出現(xiàn)在品種間，還出現(xiàn)在品種內(nèi)，且品種內(nèi)遺傳變異高于品種間遺傳變異，因此，ITS序列不宜用于進(jìn)行荔枝的系統(tǒng)進(jìn)化研究。

荔枝nrDNA ITS在品種間和品種內(nèi)的多態(tài)性表明，其ITS逃離了致同進(jìn)化，其原因可能與荔枝品種的選育有關(guān)：迄今為止，我國(guó)大多數(shù)荔枝主栽品種都是前人有意或無(wú)意從實(shí)生資源中選擇出來(lái)的。荔枝實(shí)生選種是指從荔枝實(shí)生繁殖所產(chǎn)生的自然變異中，選擇出無(wú)性系品種的方法，供選群體主要是由播種自然雜交（即自然授粉）種子所產(chǎn)生的實(shí)生樹。我國(guó)近些年選育的‘鳳山紅燈籠’、‘御金球’、‘燎原’、‘冰荔’、‘井崗紅糯’等30個(gè)新品種均來(lái)自實(shí)生選種，父、母本都不清楚［26］。荔枝為異花授粉的果樹，本身的遺傳基礎(chǔ)十分復(fù)雜，基因型為雜合型。荔枝品種間的自然雜交使遺傳物質(zhì)從一個(gè)品種進(jìn)入另一個(gè)品種，易引起遺傳多樣性的增加，產(chǎn)生多樣復(fù)雜的自然變異［8］?！P山紅燈籠’是通過(guò)實(shí)生選種選育出來(lái)的荔枝品種，在本研究構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹中，它的8個(gè)ITS克隆沒(méi)有聚在一起，而是分散在不同的分支：5個(gè)克隆與‘水晶球’、‘西園掛綠’的部分克隆聚在A組上部的一個(gè)小分支，1個(gè)克隆與‘妃子笑’、‘水晶球’、‘西園掛綠’的部分克隆聚在A組下部的1個(gè)小分支，另有2個(gè)克隆聚在B組的2個(gè)小分支上，表明不同ITS序列拷貝在‘鳳山紅燈籠’基因組內(nèi)發(fā)生了不同程度的變異，導(dǎo)致序列拷貝之間的遺傳距離各不相同，分別聚在系統(tǒng)樹的不同小分支上?！P山紅燈籠’功能基因中遺傳距離最遠(yuǎn)的2個(gè)克隆（FSHDL-2、FSHDL-6）的rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾環(huán)、內(nèi)環(huán)、凸環(huán)的數(shù)量和位置及單鏈結(jié)構(gòu)的位置等均有差異，這些變化均與其ITS序列的長(zhǎng)度變異以及核苷酸的轉(zhuǎn)換、顛換等變化有關(guān)。同樣地，類似的ITS序列拷貝變異情況也發(fā)生在‘妃子笑’、‘水晶球’和‘西園掛綠’的基因組內(nèi)，導(dǎo)致同一品種的不同克隆分散在進(jìn)化樹的不同小分支上，不同克隆的rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變異。荔枝基因組內(nèi)的ITS序列多態(tài)性是其品種間自然雜交引起種質(zhì)遺傳多樣性增加的體現(xiàn)。

3.2 荔枝ITS假基因

本文在所研究的4個(gè)荔枝品種中共發(fā)現(xiàn)9個(gè)ITS假基因，其中‘水晶球’中的假基因數(shù)量最多（5個(gè)），‘妃子笑’和‘西園掛綠’中的假基因數(shù)量最少（1個(gè)），表明假基因在荔枝品種間的產(chǎn)生頻率不同；‘水晶球’的5個(gè)ITS假基因拷貝分散在不同的分支上，‘鳳山紅燈籠’的2個(gè)ITS假基因拷貝也分散在2個(gè)分支上，表明ITS假基因在荔枝品種內(nèi)也存在多態(tài)性。

ML系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，絕大部分假基因拷貝在基因樹上能與功能基因（A組）明顯分開，獨(dú)自形成分支聚在B組，這與梨屬［14］、四照花亞屬［16］、乳突球?qū)伲?7］等的報(bào)道相似，說(shuō)明這些假基因起源較早，且難以與功能序列之間進(jìn)行遺傳信息的交換。而假基因拷貝XYGL-6與功能基因聚在A組，顯示出較近的親緣關(guān)系，其原因可能是XYGL-6正從功能基因向假基因轉(zhuǎn)化，因此它與功能基因的親緣關(guān)系較近。