羅文彬 李華偉 許國(guó)春 林志堅(jiān) 紀(jì)榮昌 許泳清 邱思鑫 湯浩

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方薯類科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，福建省特色旱作物品種選育工程技術(shù)研究中心，福建福州 350013）

馬鈴薯是福建省第三大糧食作物，種植類型主要有冬種、春種和秋種。福建省是南方冬作馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)之一，多年來(lái)利用冬閑田發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)取得了較高的經(jīng)濟(jì)效益。福建省冬作馬鈴薯面積占全省馬鈴薯總種植面積的85%以上（湯浩 等，2006；湯浩，2010；凌永勝 等，2018）。然而，由于生產(chǎn)上應(yīng)用的馬鈴薯品種均不耐低溫霜凍，福建省馬鈴薯生產(chǎn)基本上每年都會(huì)受到不同程度的霜凍影響，2016 年的霜凍氣候造成了福建沿海馬鈴薯受凍面積約1.67 萬(wàn)hm，減產(chǎn)20%左右；受凍特別嚴(yán)重的地區(qū)，植株凍死，減產(chǎn)60%左右（薛凌英 等，2016）。在全國(guó)范圍內(nèi)，2008 年的特大低溫霜凍災(zāi)害使南方冬作區(qū)馬鈴薯受災(zāi)面積達(dá)到了40.93 萬(wàn)hm，直接經(jīng)濟(jì)損失約10 億元（魏亮 等，2012），造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。低溫霜凍已成為制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一（李飛 等，2008）。因此，選育耐寒的馬鈴薯新品種，對(duì)南方冬作馬鈴薯區(qū)域發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

我國(guó)馬鈴薯栽培品種遺傳背景狹窄，大多數(shù)品種不耐低溫霜凍，為篩選抗寒種質(zhì)和選育抗寒品種，首先需對(duì)馬鈴薯種質(zhì)資源進(jìn)行耐寒性評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)馬鈴薯種質(zhì)資源耐寒性的方法主要有田間自然霜凍法、電導(dǎo)率法、隸屬函數(shù)法等（李飛，2008；劉浩和張宗山，2008；楊超英，2014）。涂衛(wèi)等（2015）利用模擬田間自然霜凍法和電導(dǎo)率法建立了馬鈴薯苗期抗寒性直接鑒定法，并應(yīng)用該方法對(duì)馬鈴薯抗寒資源進(jìn)行了篩選。魏亮等（2017）利用電解質(zhì)滲漏法結(jié)合田間自然霜凍法評(píng)價(jià)馬鈴薯抗寒性，室內(nèi)鑒定的LT與田間自然霜凍損傷結(jié)果呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.928 7，表明室內(nèi)低溫鑒定結(jié)果真實(shí)可信。楊慧菊和郭華春（2017）采用主成分分析法、隸屬函數(shù)法和聚類分析法對(duì)馬鈴薯品種的抗寒性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)；丁紅映等（2020）采用主成分分析、隸屬函數(shù)和聚類分析3 種方法對(duì)馬鈴薯材料的耐寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明丙二醛、可溶性蛋白含量和SOD 活性可作為評(píng)價(jià)馬鈴薯耐寒性的重要參考指標(biāo)。

閩薯2 號(hào)系福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所2018 年育成的馬鈴薯新品種（羅文彬 等，2019），該品種產(chǎn)量高，商品薯率高，抗馬鈴薯X 病毒和馬鈴薯Y 病毒，為目前福建省主要推廣品種。為了鑒定和評(píng)價(jià)閩薯2 號(hào)的耐寒性，本試驗(yàn)以生產(chǎn)中主栽品種費(fèi)烏瑞它為對(duì)照，采用電導(dǎo)率法和田間自然霜凍法，測(cè)定馴化前后離體葉片半致死溫度（LT），霜凍前后植株損傷等級(jí)、形態(tài)特征和葉片微生物多樣性指數(shù)，綜合評(píng)價(jià)閩薯2 號(hào)的耐寒性，探討其耐寒機(jī)理，以期為馬鈴薯抗寒育種的親本選擇及南方冬作區(qū)馬鈴薯耐寒品種的應(yīng)用推廣提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試馬鈴薯閩薯2 號(hào)及對(duì)照費(fèi)烏瑞它的種薯級(jí)別均為原種。

1.2 室內(nèi)耐寒性鑒定法

室內(nèi)耐寒性鑒定于2018 年3—4 月在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所進(jìn)行，采用電導(dǎo)率法進(jìn)行測(cè)定（李飛 等，2008）。組培苗移栽生長(zhǎng)4 周后進(jìn)行煉苗，然后移至10 cm × 10 cm 的塑料缽中，置于植物生長(zhǎng)室（16 h 光照/8 h 黑暗、22 ℃/18 ℃、濕度60% ± 10%）生長(zhǎng)4 周后測(cè)定離體葉片半致死溫度（LT）；之后，將植株轉(zhuǎn)至低溫生長(zhǎng)室〔14 h 光照/10 h 黑暗、（4 ± 2）℃、濕度50% ± 10%〕馴化處理2 周，再次測(cè)定離體葉片LT。每個(gè)品種測(cè)定3 株，3 次重復(fù)。

1.3 田間自然霜凍法

1.3.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) 福建省福州市長(zhǎng)樂(lè)區(qū)文武砂鎮(zhèn)三站村播種時(shí)間為2017 年11 月23 日，收獲時(shí)間為2018 年5 月2 日。寧德市霞浦縣沙江鎮(zhèn)南屏村播種時(shí)間為2019 年12 月18 日，收獲時(shí)間為2020 年4 月15 日。

1.3.2 試驗(yàn)方法 采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3 次重復(fù)，小區(qū)面積19.5 m（15.0 m ×1.3 m）；每個(gè)小區(qū)1 壟，每壟種植150 株。全生育期各小區(qū)按復(fù)合肥（N-P-K為15-15-15）1 500 kg · hm、腐熟鴨糞7 500 kg ·hm折算施肥量。利用田間氣象數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)采集田間溫度。

霜凍后第1 天，分別對(duì)兩個(gè)品種每個(gè)重復(fù)的20 株幼苗進(jìn)行耐寒性鑒定（Vega &Bamberg，1995），計(jì)算品種受害程度的平均數(shù)，即損傷等級(jí)（AS）。

AS=∑x/總株數(shù)

式中：x代表第霜凍級(jí)別的株數(shù)，代表霜凍級(jí)別（表1）。

表1 霜凍損傷評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（Vega &Bamberg，1995）

1.4 葉片微生物多樣性指數(shù)測(cè)定

在霜凍前后分別對(duì)馬鈴薯植株從上向下數(shù)第3 片真葉進(jìn)行取樣，每品種隨機(jī)取3 株。葉片微生物菌落總DNA 抽提，根據(jù)E.Z.N.A.soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說(shuō)明書進(jìn)行。以樣品DNA 為模板，使用799F（5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′）和1115R（5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′）擴(kuò)增16S rDNA的V3～V4 可變區(qū)。將同一樣品的PCR 產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用Quantus? Fluorometer（Promega，USA）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 進(jìn)行建庫(kù)。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司），獲得微生物多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)耐寒性鑒定與分析

室內(nèi)耐寒性鑒定結(jié)果表明（表2），閩薯2 號(hào)馴化前的LT為-2.26 ℃，馴化后的LT為-2.81℃；對(duì)照費(fèi)烏瑞它馴化前的LT為-1.84 ℃，馴化后的LT為-2.57 ℃。若馴化后品種LT提升1 ℃以上，則被稱為具有低溫馴化能力。因此，這兩個(gè)品種均沒(méi)有低溫馴化能力，閩薯2 號(hào)在馴化前、后的耐寒性均顯著高于對(duì)照費(fèi)烏瑞它。

表2 閩薯2 號(hào)和費(fèi)烏瑞它室內(nèi)耐寒性鑒定結(jié)果 ℃

2.2 田間氣象因素分析

從田間氣象數(shù)據(jù)可以看出（圖1），長(zhǎng)樂(lè)區(qū)試驗(yàn)點(diǎn)2018 年2 月上旬出現(xiàn)低溫氣候，最低氣溫為0.6℃；霞浦縣試驗(yàn)點(diǎn)2020 年2 月中旬出現(xiàn)低溫氣候，最低氣溫為-0.5 ℃。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的馬鈴薯品種均出現(xiàn)輕微霜凍，頂部葉片輕微傷害，部分頂部葉片有凍死現(xiàn)象（圖2）。綜上，長(zhǎng)樂(lè)區(qū)和霞浦縣防霜時(shí)間為2 月上、中旬，在此期間開展防霜凍措施可以降低馬鈴薯凍害造成的損失。

圖1 長(zhǎng)樂(lè)區(qū)（2018）和霞浦縣（2020）日最低氣溫

圖2 閩薯2 號(hào)（左）和費(fèi)烏瑞它（右）霜凍后的植株癥狀

2.3 田間自然霜凍鑒定與分析

在發(fā)生霜凍后1 d，分別對(duì)閩薯2 號(hào)和對(duì)照費(fèi)烏瑞它進(jìn)行田間耐寒性鑒定。結(jié)果表明（表3），閩薯2 號(hào)的損傷等級(jí)均顯著低于對(duì)照費(fèi)烏瑞它。表明，閩薯2 號(hào)的田間耐寒性強(qiáng)于對(duì)照費(fèi)烏瑞它。

表3 閩薯2 號(hào)和費(fèi)烏瑞它低溫霜凍后的損傷等級(jí)

2.4 霜凍前后植株形態(tài)特征和葉片微生物多樣性指數(shù)變化

由于霜凍后馬鈴薯植株受到損傷，葉片凍傷后影響其光合作用進(jìn)而影響植株的正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致株高降低，生育期延長(zhǎng)。閩薯2 號(hào)和對(duì)照費(fèi)烏瑞它的株高均降低3～4 cm；閩薯2 號(hào)生育期延長(zhǎng)15 d 左右，對(duì)照費(fèi)烏瑞它生育期延長(zhǎng)10 d 左右。

霜凍前、后葉片微生物多樣性指數(shù)變化表明（表4），閩薯2 號(hào)霜凍前葉片細(xì)菌豐富度Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)均顯著高于霜凍后，而對(duì)照費(fèi)烏瑞它不僅Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)霜凍前顯著高于霜凍后，香農(nóng)指數(shù)霜凍前亦顯著高于霜凍后。表明霜凍后馬鈴薯葉片細(xì)菌豐富度和多樣性均顯著降低，但閩薯2 號(hào)的變化比對(duì)照費(fèi)烏瑞它小，即閩薯2 號(hào)較費(fèi)烏瑞它更能適應(yīng)一定程度的低溫脅迫。

表4 閩薯2 號(hào)和費(fèi)烏瑞它霜凍前后的葉片微生物多樣性指數(shù)（屬水平）

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯栽培種不耐低溫霜凍。通常情況下，當(dāng)氣溫在-0.8～-0.5 ℃時(shí)，會(huì)發(fā)生冷害；當(dāng)氣溫低于-1.5 ℃時(shí)，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的凍害；當(dāng)氣溫低于-3℃時(shí)，整株萎蔫，甚至枯死，造成嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)（張永成和田豐，1996）。田間實(shí)際凍害表現(xiàn)因受多因素影響存在一定的差異性，除環(huán)境因素（低溫霜凍）及栽培措施外，品種的耐寒性水平也直接影響凍害的程度。每年我國(guó)馬鈴薯各個(gè)種植區(qū)域都會(huì)受到不同程度的冷害和凍害，特別是南方冬作區(qū)的冬季和早春霜凍天氣是影響其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一（李巖 等，2014）。因此，馬鈴薯抗寒育種已成為最主要的育種目標(biāo)之一，也是防御低溫霜凍的最根本途徑。開展新品種耐寒性鑒定有利于明確其抗性水平，進(jìn)而增加其推廣應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，馬鈴薯耐寒研究在種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、耐寒性評(píng)價(jià)方法和耐寒機(jī)理等方面取得了很大進(jìn)展（趙喜娟，2013；Dou et al.，2015；李華偉等，2016；Kou et al.，2018；鄧高峰，2019）。鄧英毅等（2017）對(duì)馬鈴薯新品種桂農(nóng)薯1 號(hào)冬種田間耐寒性進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)桂農(nóng)薯1 號(hào)受寒害程度低于對(duì)照費(fèi)烏瑞它，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐寒性，適合在冬作區(qū)推廣種植。李麗淑等（2017）評(píng)價(jià)了廣西冬種馬鈴薯不同品種的耐寒性，結(jié)果表明麗薯6 號(hào)和興佳2 號(hào)較費(fèi)烏瑞它具有更強(qiáng)的耐寒性。目前，室內(nèi)電導(dǎo)率法、田間自然霜凍法和生理指標(biāo)測(cè)定法已在馬鈴薯耐寒鑒定中得到廣泛應(yīng)用（丁旭 等，2017），選擇其中兩種及兩種以上的方法評(píng)價(jià)馬鈴薯耐寒性，結(jié)果更為可靠。隨著馬鈴薯抗寒研究進(jìn)程的推進(jìn)，具有一定耐寒性的材料陸續(xù)篩選或創(chuàng)制出來(lái)。董建科等（2019）利用電導(dǎo)率法對(duì)國(guó)內(nèi)140 份馬鈴薯栽培品種和8 份種間雜種進(jìn)行了直接抗性和馴化抗性鑒定，結(jié)果表明大多數(shù)栽培品種抗寒能力較低，且大多幾乎沒(méi)有低溫馴化能力；而種間雜種的抗寒能力和低溫馴化能力顯著強(qiáng)于栽培品種。丁紅映等（2019）采用綜合評(píng)價(jià)方法對(duì)103 份馬鈴薯種質(zhì)資源進(jìn)行耐寒性評(píng)價(jià)，篩選出16 份抗寒材料。黃先群等（2014）采用綜合評(píng)價(jià)方法對(duì)地方品種普安紫洋芋和對(duì)照費(fèi)烏瑞它進(jìn)行自然及輻射變異株系的抗寒性鑒定，結(jié)果表明普安紫洋芋和費(fèi)烏瑞它變異株系不同單株間抗寒能力表現(xiàn)出明顯差異，在單株間進(jìn)行抗寒性鑒選是有效的。楊慧菊和郭華春（2016）采用綜合評(píng)價(jià)方法對(duì)14 份馬鈴薯材料進(jìn)行苗期耐寒性鑒定，耐寒性強(qiáng)弱表現(xiàn)為轉(zhuǎn)心烏＞會(huì)-2 ＞冀張薯12 號(hào)＞麗薯6 號(hào)＞中薯18 號(hào)＞晉薯16 號(hào)＞米拉＞費(fèi)烏瑞它＞滇同薯1 號(hào)＞滇薯716 ＞芒果洋芋＞宣薯2號(hào)＞合作88 ＞威芋3 號(hào)。本試驗(yàn)采用電導(dǎo)率法和田間自然霜凍法鑒定了閩薯2 號(hào)及對(duì)照費(fèi)烏瑞它的耐寒性，結(jié)果表明閩薯2 號(hào)較費(fèi)烏瑞它具有更強(qiáng)的耐寒性；低溫霜凍后其葉片組織的微生物變化比費(fèi)烏瑞它小，也說(shuō)明了霜凍對(duì)閩薯2 號(hào)的損傷較小，可以在我國(guó)馬鈴薯南方冬作區(qū)推廣種植。