王 瑩，姜君君，蘭 衛(wèi)，武嘉林

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830002；2.烏魯木齊市第四人民醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830002;3.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017；4.新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830011)

硬尖神香草是維吾爾醫(yī)常用藥材，維吾爾名為“祖帕”，為唇形科植物硬尖神香草(HyssopuscuspidatusBoriss.)的干燥全草[1]，硬尖神香草和以硬尖神香草為主藥的寒喘祖帕顆粒均收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：維吾爾藥分冊(cè)》(WS3-BW-0195-98)[2]。研究表明，神香草具有祛痰、止咳、平喘、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[3-5]。

作者采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定硬尖神香草中蘆丁含量，旨在為制定硬尖神香草質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

硬尖神香草，采集于新疆和田地區(qū)策勒縣博斯坦鄉(xiāng)神香草人工種植基地，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中藥資源教研室盛萍教授鑒定為硬尖神香草(HyssopuscuspidatusBoriss.)的干燥全草。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)20130329)，上海源葉生物科技有限公司；乙腈(批號(hào)67-56-1)、甲醇(批號(hào)61-56-1)，色譜純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；磷酸(批號(hào)20150209)、乙酸(批號(hào)20160319)，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

Agilent 1200-DAD型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；KQ-200KD型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；AL204型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；CBM-20A型高效液相色譜儀(LC-6AD雙泵，SPD-20A紫外雙波長(zhǎng)檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-10AS柱溫箱，LC-solution色譜工作站)，日本島津。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取4.12 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容于100 mL容量瓶中，即得0.041 2 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 供試溶液的配制

稱取硬尖神香草藥材1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入10 mL甲醇，稱重；用100 Hz超聲波提取40 min，取出，放至常溫，再用甲醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，搖勻；用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試溶液。

1.2.3 色譜條件

Hypersil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫程序：0～9 min，13%～16%B；9～20 min,16%～32%B；20～40 min,32%～60%B；40～45 min,60%～13%B，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)354 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC圖譜

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液的HPLC圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)和供試溶液(b)的HPLC圖譜

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，擬合得線性回歸方程為：y=2055.8x+0.85,R2=0.9993。表明，蘆丁濃度在0.004 12～0.020 60 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖2 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 精密度

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按1.2.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。測(cè)得峰面積分別為90.5、91.2、89.6、90.1、88.3、92.1，平均峰面積為90.3，RSD值為1.45%。表明儀器的精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性

平行稱取6份硬尖神香草藥材各1.0 g，按1.2.2方法制備供試溶液，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得峰面積分別為29.5、30.2、29.4、30.7、30.7、29.7，平均峰面積為30.0，RSD值為1.95%。表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性

取供試溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h按1.2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得峰面積分別為30.3、31.0、30.3、29.8、29.3、30.6，平均峰面積為30.2，RSD值為1.98%。表明供試溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加標(biāo)回收率

平行稱取9份硬尖神香草藥材各1.0 g，均分為3組，分別加入1.78 mL(低濃度組)、3.54 mL(中濃度組)、3.72 mL(高濃度組)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2方法制備供試溶液，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加標(biāo)回收率結(jié)果

由表1可知，低濃度組的平均加標(biāo)回收率為100.91%，RSD值為2.07%；中濃度組的平均加標(biāo)回收率為101.60%，RSD值為1.03%；高濃度組的平均加標(biāo)回收率為100.96%，RSD值為1.96%。

2.3 硬尖神香草中蘆丁含量的測(cè)定

取硬尖神香草藥材3份，按1.2.2方法制備供試溶液，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得峰面積分別為30.8、31.2、30.5，平均峰面積為30.83，計(jì)算得到硬尖神香草中蘆丁含量為0.146 mg·g-1。

2.4 討論

蘆丁為黃酮類成分，具有抗氧化、抗炎癥、抗病原微生物、提高免疫力等作用[6]。董元火等[7]采用HPLC法測(cè)定野生蘄艾中蘆丁含量，流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸(55∶45，體積比，下同)，檢測(cè)波長(zhǎng)257 nm；作者發(fā)現(xiàn)該色譜條件下硬尖神香草中蘆丁所對(duì)應(yīng)位置未出峰。肖作奇等[8]采用HPLC法測(cè)定地膚子中蘆丁含量，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脫；作者發(fā)現(xiàn)該色譜條件下硬尖神香草中蘆丁出峰時(shí)間與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品一致，但峰面積較小。齊紅等[9]采用HPLC法測(cè)定白花蛇舌草中蘆丁含量，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸(30∶70)，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)353 nm；作者發(fā)現(xiàn)該色譜條件下硬尖神香草中蘆丁出峰效果不理想。于姍姍等[10]采用HPLC法測(cè)定槐枝中蘆丁含量，流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸(32∶68)，流速1.0 mL·min-1，柱溫36 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)257 nm；作者發(fā)現(xiàn)該色譜條件下硬尖神香草中蘆丁分離度不理想。作者以乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相，調(diào)整流動(dòng)相比例，梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)硬尖神香草中蘆丁出峰時(shí)間與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品一致，峰形較好，分離度>1.5，理論塔板數(shù)>3000。因此，選用乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相測(cè)定硬尖神香草中蘆丁含量。

維藥硬尖神香草的品種選擇很重要，從直觀判斷，正宗硬尖神香草花朵正常開(kāi)放是藍(lán)紫色的，而其它品種神香草是除藍(lán)紫色以外的其它顏色。

由于硬尖神香草與大苞荊芥外形、用法相似，故維吾爾族民間用藥常以大苞荊芥充當(dāng)硬尖神香草，造成藥材誤用，導(dǎo)致療效下降。因此，制定硬尖神香草質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)十分重要。

3 結(jié)論

首次建立了測(cè)定硬尖神香草中蘆丁含量的HPLC法。色譜條件為：Hypersil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)354 nm，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果表明，蘆丁濃度在0.004 12～0.020 60 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；硬尖神香草中蘆丁含量為0.146 mg·g-1。采用HPLC法測(cè)定硬尖神香草中蘆丁含量準(zhǔn)確可靠，為制定硬尖神香草質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。