王書利，魏淑娟，李夢含，鄭 好，司麗芳，李志強(qiáng)

（1. 河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003；2. 商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院，河南 商丘 476000；3. 河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）引起的一類人畜共患傳染病，給許多國家?guī)砭薮蟮慕?jīng)濟(jì)損失[1]。該病可導(dǎo)致雌性動物出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎，雄性動物表現(xiàn)為睪丸炎和附睪炎，從而影響受感染動物的繁殖性能[2]。人感染布魯氏菌后，可引起波浪熱、感染性心內(nèi)膜炎、脾膿腫、子宮內(nèi)膜炎、結(jié)節(jié)性紅斑和敗血癥等[3]。吸入細(xì)菌氣溶膠、攝入受污染的食品或接觸傷口、黏膜是人感染的主要途徑[4]。據(jù)估計(jì)，每年約新增50 萬人類感染病例[5]。

布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅳsecretion system，T4SS）是由12 種蛋白質(zhì)（VirB1—VirB12）組成的大分子復(fù)合物，是布魯氏菌的重要毒力因子，由virB操縱子編碼，在調(diào)節(jié)胞內(nèi)存活和操縱宿主對細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6]。布魯氏菌可通過T4SS分泌的效應(yīng)蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞，效應(yīng)蛋白可改變病原菌的胞內(nèi)運(yùn)輸，逃避感染細(xì)胞的免疫監(jiān)視，維持布魯氏菌在細(xì)胞的持續(xù)性感染[7]。MYENI 等[8]通過生物信息學(xué)和TEM-1 融合蛋白方法鑒定發(fā)現(xiàn)，BspA 和BspB 蛋白為T4SS 的分泌蛋白。BspA 和BspB 蛋白分別由191 個和187 個氨基酸組成，包含DUF2062 結(jié)構(gòu)域（功能未知的結(jié)構(gòu)域2062，Pfam 數(shù)據(jù)庫）和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類（SCOP）結(jié)構(gòu)域（兩側(cè)有2個跨膜結(jié)構(gòu)域）[8]。異位表達(dá)的BspA 和BspB 蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)[8]，其在胞內(nèi)與哪些宿主分子相互作用還未見報(bào)道。鑒于此，以布魯氏菌T4SS 效應(yīng)蛋白BspA 和BspB 為研究對象，利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)載體，以獲得具有活性的BspA 和BspB 效應(yīng)蛋白，為進(jìn)一步研究布魯氏菌分泌蛋白BspA和BspB的功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株、載體和細(xì)胞

布魯氏菌S2308 基因組和pEGFP-N1 載體由石河子大學(xué)張輝教授饋贈；T-Vector pMDTM19（Simple）購自Takara 公司；胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞（HPT-8）由石河子大學(xué)張輝教授饋贈。

1.2 主要試劑和儀器

普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；QuickCutTMEcoRⅠ和XbaⅠ限制酶購自Takara 公司；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購自美國Invitrogen 公司；鼠抗BspA 和鼠抗BspB單克隆抗體購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（H+L）購自美國Bioworld 公司；乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；人IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-5 細(xì)胞因子ELISA 檢測試劑盒均購自美國R&D Systems公司。

PCR 儀（nexus GSX1）購自德國Eppendorf 公司，凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR+）購自美國BIO-RAD 公司，分子雜交箱（Big SHOT Ⅲ）購自美國Boekel Scientific 公司，生物安全柜（BIO ⅡA）購自西班牙Telstar 公司，半干式轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自北京六一生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)布魯氏菌S2308 的BspA（BAB1_0678）和BspB（BAB1_0712）基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 布魯氏菌BspA和BspB基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of BspA and BspB genes of Brucella

以布魯氏菌S2308 基因組或ddH2O（陰性對照）為模板，利用表1 中的引物，分別對BspA和BspB基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的片段切膠回收純化。

1.4 重組質(zhì)粒pMD-BspA和pMD-BspB的構(gòu)建和鑒定

將回收后的BspA和BspB目的片段分別與TVector pMDTM19（Simple）連接，連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中，涂布含Amp（100 mg/L）的LB平板，篩選陽性菌，提取質(zhì)粒，利用EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pMD-BspA和pMD-BspB，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5 真核表達(dá)載體pEGFP-BspA和pEGFP-BspA的構(gòu)建和鑒定

將重組質(zhì)粒pMD-BspA、pMD-BspB和pEGFPN1 載體利用EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，回收酶切產(chǎn)物，連接pEGFP-N1載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Amp（100 mg/L）的LB 平板，篩選陽性菌，提取質(zhì)粒，利用EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pEGFP-BspA和pEGFP-BspB，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

利用LipofectamineTM2000 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染[9]。將HPT-8細(xì)胞傳代于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，分別取5 μg pEGFP-BspA、pEGFP-BspB或pEGFP-N1（陰性對照），加至1 mL 不完全DMEM 培養(yǎng)基中，再加入10 μL LipofectamineTM2000，混勻后室溫靜置20 min。將該混合液加至細(xì)胞培養(yǎng)孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，6 h 后棄去培養(yǎng)液，用PBS 液漂洗2 次，更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后棄掉培養(yǎng)液，使用RAPA 裂解液裂解細(xì)胞，獲得總蛋白質(zhì)樣品，對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測定后，置于-20 ℃保存。

1.7 Western blot檢測BspA和BspB的表達(dá)

將蛋白質(zhì)樣品加熱變性后，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳結(jié)束后，將目的凝膠切下，利用半干式電轉(zhuǎn)法，以200 mA電流轉(zhuǎn)膜1 h，將目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（NC膜）上；用5 mL含5%脫脂奶粉的封閉液37 ℃封閉1 h；用TBST 洗膜3 次，加入5 mL一抗（鼠抗BspA 和BspB 單克隆抗體，稀釋比例為1∶5 000），37 ℃孵育1 h；用TBST 洗膜3 次，加入5 mL 二抗（HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，稀釋比例為1∶2 000），37 ℃孵育1 h；用TBST 洗膜3 次后，進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光檢測[10]。

1.8 細(xì)胞因子檢測

按1.6 中的方法轉(zhuǎn)染HPT-8 細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后12、24、48 h 收集細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后，利用人IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-5 細(xì)胞因子ELISA 檢測試劑盒檢測細(xì)胞因子水平[11]。試驗(yàn)設(shè)3個重復(fù)。

1.9 細(xì)胞毒性檢測

按1.6 中的方法轉(zhuǎn)染HPT-8 細(xì)胞，分別在轉(zhuǎn)染后12、24、48 h 利用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒，測定細(xì)胞毒性[12]。乳酸脫氫酶釋放量的計(jì)算方法：LDH=（處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度）/（細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 BspA和BspB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

BspA基因片段的大小為576 bp，BspB基因片段的大小為564 bp（圖1）。

圖1 布魯氏菌BspA和BspB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification products of the BspA and BspB genes of Brucella

2.2 重組質(zhì)粒pMD-BspA和pMD-BspB的酶切鑒定結(jié)果

由圖2 可知，重組質(zhì)粒pMD-BspA和pMD-BspB經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后，獲得的條帶大小分別為576 bp 和564 bp。測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建pMD-BspA和pMD-BspB載體。

圖2 重組質(zhì)粒pMD-BspA和pMD-BspB的酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmids pMD-BspA and pMD-BspB by enzyme digestion

2.3 重組質(zhì)粒pEGFP-BspA和pEGFP-BspB的酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pEGFP-BspA和pEGFP-BspB經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)2 條目的條帶，一條為pEGFP-N1 載體片段，另一條為目的基因條帶（圖3），且測序結(jié)果與GenBank登錄的序列同源性為100%，表明重組質(zhì)粒pEGFPBspA和pEGFP-BspB構(gòu)建正確。

圖3 重組質(zhì)粒pEGFP-BspA和pEGFP-BspB的酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of recombinant plasmids pEGFPBspA and pEGFP-BspB by enzyme digestion

2.4 BspA和BspB蛋白的表達(dá)結(jié)果

Western blot 分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載體的對照組未出現(xiàn)條帶，而轉(zhuǎn)染pEGFP-BspA和pEGFP-BspB組分別在70 ku和68 ku處出現(xiàn)目的條帶（圖4）。結(jié)果表明，BspA和BspB蛋白在HPT-8細(xì)胞中成功表達(dá)。

圖4 Western blot檢測BspA和BspB蛋白的表達(dá)結(jié)果Fig.4 Expression of BspA and BspB proteins detected by Western blot

2.5 BspA和BspB蛋白對細(xì)胞因子分泌的影響

細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示，與對照組（pEGFP-N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組）相比，pEGFP-BspA和pEGFP-BspB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中有較高水平的細(xì)胞因子產(chǎn)生（P＜0.01）（圖5）。此外，BspA 和BspB 蛋白誘導(dǎo)HTP-8 細(xì)胞產(chǎn)生Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ 和IL-2 的水平略微高于Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-5的水平。以上結(jié)果表明，pEGFP-BspA和pEGFP-BspB轉(zhuǎn)染HPT-8 細(xì)胞后，可誘導(dǎo)Th1 和Th2 型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，且BspA 和BspB 蛋白誘導(dǎo)HTP-8 細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子不存在偏好性。

圖5 pEGFP-BspA和pEGFP-BspB轉(zhuǎn)染HPT-8細(xì)胞后IFN-γ（A）、IL-2（B）、IL-4（C）和IL-5（D）的水平檢測結(jié)果Fig.5 Productions of IFN-γ（A），IL-2（B），IL-4（C）and IL-5（D）in HPT-8 cells transfected with pEGFP-BspA and pEGFP-BspB

2.6 BspA和BspB蛋白對細(xì)胞毒性的影響

細(xì)胞毒性檢測結(jié)果（圖6）顯示，pEGFP-BspA和pEGFP-BspB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞12 h 后，細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放量分別為5.88%和5.72%，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的乳酸脫氫酶釋放量為3.52%；轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放量分別為6.17%和6.08%，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的乳酸脫氫酶釋放量為4.63%；轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放量分別為6.58%和6.43%，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的乳酸脫氫酶釋放量為5.05%。隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放水平逐漸增加，但各組差異均不 顯 著（P＞0.05）。結(jié) 果 表 明，pEGFP-BspA和pEGFP-BspB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，對細(xì)胞無毒性反應(yīng)。

圖6 BspA和BspB蛋白對HPT-8細(xì)胞的毒性Fig.6 The cytotoxicity of BspA and BspB proteins on HPT-8 cells

3 結(jié)論與討論

布魯氏菌為胞內(nèi)寄生菌，T4SS是其關(guān)鍵的毒力因子，在感染期間抑制宿主免疫應(yīng)答和調(diào)控胞內(nèi)生存中發(fā)揮重要作用[13]。已有研究證明，在受感染的人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）中，BspA 和BspB 蛋白可抑制宿主蛋白的分泌[8]。此外，BspA 和BspB 蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中過表達(dá)時可抑制宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)分泌途徑[8]。雖然BspA和BspB缺失后，影響布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的繁殖能力，以及在感染小鼠肝臟中的生存能力[8]，但僅在感染后期發(fā)揮作用，并且BspA 蛋白與BspB 蛋白具有互補(bǔ)功能。本研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGFP-BspA和pEGFP-BspB，轉(zhuǎn)染HPT-8細(xì)胞后，經(jīng)Western blot檢測，分別于70 ku和68 ku 處出現(xiàn)了目的條帶，表明HPT-8 細(xì)胞表達(dá)的BspA 和BspB 蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為下一步篩選宿主互作蛋白提供了材料。

本研究選取的pEGFP-N1載體具有高效穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的作用，該載體含有多克隆位點(diǎn)，可融合表達(dá)多種外源基因，并能保持外源蛋白的生物學(xué)活性，廣泛應(yīng)用于基因的表達(dá)檢測[14-15]。張沾等[16]構(gòu)建了T4SS 效應(yīng)蛋白VceC 的真核表達(dá)載體pEGFPVceC，轉(zhuǎn)染HPT-8 細(xì)胞后，促進(jìn)細(xì)胞釋放一氧化氮（NO）和增加乳酸脫氫酶活力。李躍峰等[17-18]利用pEGFP-N1載體構(gòu)建了結(jié)核桿菌CFP10基因的重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-CFP10，轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞（293T）后，對細(xì)胞有促凋亡的作用。王慧勤等[19]研發(fā)了基于結(jié)核桿菌ESAT6基因的DNA 疫苗，免疫小鼠后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外，結(jié)核分支桿菌分泌蛋白Rv2031c 和Rv2626c 的融合表達(dá)重組載體pEGFP-N1-Rv2031c和pEGFPN1-Rv2626c轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后24、48 h 時促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[20]。除了293T 細(xì)胞外，HPT-8 細(xì)胞也被廣泛用于表達(dá)研究外源基因，驗(yàn)證所構(gòu)建的載體是否有效表達(dá)[21]，且該細(xì)胞為布魯氏菌的靶細(xì)胞[22-23]。本研究利用構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-BspA和pEGFPBspB轉(zhuǎn)染HPT-8 細(xì)胞，經(jīng)Western blot 證實(shí)BspA 和BspB 蛋白獲得表達(dá)，為篩選BspA 和BspB 在宿主細(xì)胞中的互作蛋白，研究效應(yīng)蛋白BspA 和BspB 對宿主細(xì)胞正常代謝、凋亡等生理功能的影響及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

以產(chǎn)生IFN-γ 和IL-2 為特征的Th1 型免疫應(yīng)答與布魯氏菌的保護(hù)性免疫有關(guān)[24]。IFN-γ 可刺激Th1分化，從而誘導(dǎo)活化漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體[25]。IFN-γ在感染早期根除胞內(nèi)病原菌方面發(fā)揮重要作用[26]。IL-2 與布魯氏菌的保護(hù)性免疫有關(guān)。IFN-γ 和IL-2是布魯氏菌誘導(dǎo)Th1型免疫中的關(guān)鍵細(xì)胞因子[27]。IL-4 是一種重要的抗炎因子，參與對抗細(xì)胞外病原體，屬于Th2 型細(xì)胞因子[28]。IL-5 由Th2 型細(xì)胞產(chǎn)生，是一種主要參與特應(yīng)性疾病發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞因子[29]。IL-4 和IL-5 的功能相互補(bǔ)充，促進(jìn)Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的過敏反應(yīng)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，BspA 和BspB 蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-5，表明BspA 和BspB 蛋白可誘導(dǎo)Th1 和Th2 型混合免疫反應(yīng)。

BspA和BspB基因大小分別為576 bp 和564 bp。重組質(zhì)粒pEGFP-BspA和pEGFP-BspB轉(zhuǎn)染HPT-8細(xì)胞后，經(jīng)Western blot 檢測顯示，分別在70 ku 和68 ku 處出現(xiàn)目的條帶，表明真核表達(dá)載體能在HPT-8 細(xì)胞中表達(dá)。此外，BspA 和BspB 蛋白均可誘導(dǎo)細(xì)胞分泌Th1 型細(xì)胞因子（IFN-γ 和IL-2）和Th2型細(xì)胞因子（IL-4和IL-5），且不存在偏好性，對HPT-8 細(xì)胞無毒性。本研究為篩選分泌蛋白BspA和BspB在宿主細(xì)胞的互作蛋白，從宿主互作分子角度闡述布魯氏菌逃避免疫的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。