徐鳳華，黃明（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 蘇州 215153；2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床藥理實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215151）

雙醋瑞因膠囊原研制劑（商品名安必丁?）由阿根廷TRB Pharma S.A.公司研發(fā)，是骨關(guān)節(jié)炎白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）的主要抑制劑，用于髖、膝關(guān)節(jié)等骨關(guān)節(jié)炎的臨床治療[1]。有研究指出，該藥對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)功能具有顯著的保護(hù)作用，可通過(guò)減輕疼痛、延緩病程來(lái)提高患者的生活質(zhì)量，且較非甾體抗炎藥有更強(qiáng)的后續(xù)效應(yīng)和更高的安全性[1-2]。

藥動(dòng)學(xué)研究和仿制藥一致性評(píng)價(jià)均需要測(cè)定藥物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，故準(zhǔn)確檢測(cè)生物樣品中的藥物濃度顯得非常重要。按照我國(guó)藥品注冊(cè)管理要求，仿制藥注冊(cè)需在健康人體中進(jìn)行生物等效性研究[3]。目前，雙醋瑞因膠囊仿制藥在中國(guó)健康受試者空腹?fàn)顟B(tài)下的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)已有報(bào)道[4]。參考上述研究，結(jié)合原研制劑說(shuō)明書(shū)推薦（雙醋瑞因宜餐后服用），本研究擬采用甲醇沉淀蛋白預(yù)處理血漿樣品，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法測(cè)定人血漿中雙醋瑞因活性代謝產(chǎn)物大黃酸的濃度；同時(shí)，擬初步評(píng)價(jià)雙醋瑞因膠囊原研制劑（參比制劑）與國(guó)產(chǎn)仿制藥（受試制劑）在中國(guó)健康受試者體內(nèi)的餐后生物等效性，以期為國(guó)產(chǎn)雙醋瑞因膠囊的上市及臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），Turboionspray?型電噴霧離子源、API4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、Analyst 1.6數(shù)據(jù)采集軟件（美國(guó)AB Sciex公司），XS 105DU型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），Milli-Q Academic型純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用受試制劑雙醋瑞因膠囊（批號(hào)T93-013，規(guī)格50 mg）由江蘇某制藥有限公司提供；參比制劑雙醋瑞因膠囊（商品名安必丁?，國(guó)藥準(zhǔn)字HJ20150130，規(guī)格50 mg）由阿根廷TRB Pharma S.A.公司生產(chǎn)并由昆明積大制藥股份有限公司分裝。大黃酸對(duì)照品（批號(hào)110757-200206，純度100.0%）、大黃素對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)110756-200110，純度100.0%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇和甲酸均為色譜純，氫氧化鈉和醋酸銨均為分析純，水為超純水。

1.3 空白血漿

空白血漿來(lái)自本研究所納入的健康受試者，于其給藥前采集、處理所得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse plus C8（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），保護(hù)柱為Phenomenex Security GuardTMC18（4 mm×3.0 mm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-含0.4%甲酸的5 mmoL/L醋酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～4.1 min，75%A；4.1～4.2 min，75%A→95%A；4.2～5.2 min，95%A；5.2～5.3 min，95%A→75%A；5.3～8.0 min，75%A）；流速為1 000 μL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；分析時(shí)間為8.0 min。

離子源為電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi-reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行負(fù)離子掃描；霧化氣壓力為344 738 Pa，加熱輔助氣壓力為344 738 Pa；離子源溫度為550℃；電噴霧電壓為-3 500 V；大黃酸和內(nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)分別為m/z283.0→238.8、m/z268.9→224.8，去簇電壓分別為-50、-125 V，射入電壓分別為-3、-10 V，碰撞電壓分別為-35、-50 V，碰撞室射出電壓均為-5 V。

2.2 大黃酸和內(nèi)標(biāo)相關(guān)溶液的配制

2.2.1 大黃酸貯備溶液及工作溶液 稱(chēng)取大黃酸對(duì)照品10.00 mg，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液20 μL，再用甲醇定容，混勻，得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的大黃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線貯備溶液。取上述貯備溶液適量，用甲醇稀釋?zhuān)觅|(zhì)量濃度分別為200.0、100.0、40.00、20.00、10.00、4.000、2.000、0.600 0 μg/mL 的大黃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，160.0、16.00、1.600 μg/mL的大黃酸質(zhì)控工作溶液和0.600 0 μg/mL的大黃酸定量下限工作溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)貯備溶液及工作溶液 稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品10.00 mg，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用甲醇定容，混勻，得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備溶液。取上述貯備溶液適量，用甲醇稀釋?zhuān)觅|(zhì)量濃度為0.500 0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

2.3 大黃酸校正標(biāo)樣和質(zhì)控血漿樣品的配制及處理

精密吸取空白血漿200 μL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入大黃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控工作溶液或定量下限工作溶液10 μL和內(nèi)標(biāo)工作溶液50 μL，再加入蛋白沉淀劑（甲醇）600 μL，振蕩混勻約1 min，于4℃下以23 755×g離心10 min。向潔凈進(jìn)樣瓶中加入稀釋劑（水）600 μL，再加入上述離心后的上清液300 μL，混勻，備測(cè)。

2.4 受試者待測(cè)血漿樣品的處理

精密吸取受試者待測(cè)血漿樣品200 μL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入甲醇10 μL（用于體積補(bǔ)償）和內(nèi)標(biāo)工作溶液50 μL，其余步驟按“2.3”項(xiàng)下方法操作，備測(cè)。

2.5 選擇性試驗(yàn)

分別取空白血漿200 μL按“2.3”項(xiàng)下方法處理（不加內(nèi)標(biāo)）后所得樣品、空白血漿200 μL與大黃酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液（20.00 μg/mL）10 μL混勻后按“2.3”項(xiàng)下方法處理所得樣品、某受試者餐后口服雙醋瑞因膠囊（參比制劑）50 mg后1.0 h的血漿樣品按“2.4”項(xiàng)下方法處理所得樣品適量，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖1，空白血漿樣品圖略）。結(jié)果顯示，大黃酸、內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為2.4、3.6 min，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾大黃酸和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

圖1 大黃酸定量分析的典型MRM圖

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和定量下限考察

按“2.3”項(xiàng)下方法制得大黃酸質(zhì)量濃度分別為30.00、100.0、200.0、500.0、1 000、2 000、5 000、10 000 ng/mL的校正標(biāo)樣并進(jìn)行處理后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（c）、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），采用最小二乘法（權(quán)重系數(shù)為1/c2）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.001 4c+0.012 5（r＝0.999 4），大黃酸檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為30.00～10 000ng/mL，定量下限為30.00ng/mL。

2.7 殘留試驗(yàn)

取3個(gè)空白血漿樣品和“2.6”項(xiàng)下最高質(zhì)量濃度校正標(biāo)樣（10 000 ng/mL）進(jìn)行殘留試驗(yàn)。在檢測(cè)最高質(zhì)量濃度校正標(biāo)樣后連續(xù)檢測(cè)3個(gè)空白血漿樣品，記錄峰面積。結(jié)果顯示，3個(gè)空白血漿樣品中大黃酸和內(nèi)標(biāo)的峰面積均為0，提示殘留效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)，不影響待測(cè)物的檢測(cè)[5]。

2.8 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按“2.3”項(xiàng)下方法制得大黃酸質(zhì)量濃度為30.00 ng/mL的定量下限質(zhì)控血漿樣品和80.00、800.0、8 000 ng/mL的低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控血漿樣品。在至少2 d內(nèi)，使用3個(gè)獨(dú)立分析批、4個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品（每質(zhì)量濃度平行6份）來(lái)評(píng)估批內(nèi)、批間精密度（以RSD表示）和準(zhǔn)確度（以RE表示），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大黃酸定量分析的精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.9 提取回收率試驗(yàn)

按“2.3”項(xiàng)下方法制得大黃酸質(zhì)量濃度分別為80.00、800.0、8 000 ng/mL的低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控血漿樣品（每質(zhì)量濃度平行6份）并進(jìn)行處理后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，得大黃酸和內(nèi)標(biāo)的峰面積（A1、A2）。精密吸取空白血漿200 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，取上清液，加入大黃酸質(zhì)控工作溶液，使其質(zhì)量濃度與低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)（每質(zhì)量濃度平行6份），再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，得大黃酸和內(nèi)標(biāo)的峰面積（A3、A4）。分別以A1/A3×100%、A2/A4×100%計(jì)算大黃酸和內(nèi)標(biāo)的提取回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大黃酸定量分析的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.10 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)

精密吸取6個(gè)不同來(lái)源的空白血漿200 μL，分別置于1.5 mL離心管中，加入蛋白沉淀試劑（甲醇）600 μL，振蕩混勻約1 min，于2～8℃下以23 755×g離心10 min，取上清液，即得血漿基質(zhì)樣品。精密吸取水200 μL，置于1.5 mL離心管中，按上述方法處理，得純?nèi)芤悍腔|(zhì)樣品。取血漿基質(zhì)樣品或純?nèi)芤悍腔|(zhì)樣品200 μL，加入大黃酸質(zhì)控工作溶液10 μL和內(nèi)標(biāo)工作溶液50 μL，混勻，即得低、中、高質(zhì)量濃度樣品溶液（每質(zhì)量濃度平行6份）。取上述溶液300 μL，加入稀釋劑（水）600 μL，混勻后，分別按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄大黃酸峰面積（B血漿基質(zhì)、B非基質(zhì)）和內(nèi)標(biāo)峰面積（C血漿基質(zhì)、C非基質(zhì)），分別以B血漿基質(zhì)/B非基質(zhì)×100%、C血漿基質(zhì)/C非基質(zhì)×100%計(jì)算大黃酸和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，結(jié)果見(jiàn)表2。以大黃酸基質(zhì)因子除以?xún)?nèi)標(biāo)基質(zhì)因子，計(jì)算得低、中、高質(zhì)量濃度樣品溶液中大黃酸的平均內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子分別為96.2%、94.7%、92.4%。

2.11 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將80.00、800.0、8 000 ng/mL的低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控血漿樣品（每質(zhì)量濃度平行3份）在室溫白光下放置24 h、-20℃下儲(chǔ)存49 d和反復(fù)凍融（-20℃～室溫）循環(huán)3次后，再按“2.3”項(xiàng)下方法處理，測(cè)得各樣品實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的RE均在±10.0%以?xún)?nèi)，提示質(zhì)控血漿樣品在上述條件下放置的穩(wěn)定性較好。將低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控血漿樣品按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，在自動(dòng)進(jìn)樣器（4℃）中放置23 h或在室溫白光下放置24 h，測(cè)得各樣品實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的RE均在±10.0%以?xún)?nèi)，提示經(jīng)處理的質(zhì)控血漿樣品在上述條件下放置的穩(wěn)定性較好。將大黃酸和內(nèi)標(biāo)貯備溶液（質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL）在室溫白光下放置24 h或冷藏（2～8℃）保存47 d，測(cè)得各溶液實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的RE均在±10.0%以?xún)?nèi)，提示各貯備溶液在上述條件下放置的穩(wěn)定性較好。

2.12 兩種制劑生物等效性評(píng)價(jià)

2.12.1 研究對(duì)象 本研究方案經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[倫理批件號(hào)為（2014）倫審第（22）號(hào)]。受試者入選標(biāo)準(zhǔn)包括：＞18周歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為19.0～26.0 kg/m2，試驗(yàn)前14 d病史、生命體征、體格檢查，實(shí)驗(yàn)室檢查及篩選期其他相關(guān)檢查均正?；蛭匆?jiàn)有臨床意義的異常。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：過(guò)敏體質(zhì)或有藥物、食物過(guò)敏史者；篩選前12個(gè)月內(nèi)有嗜煙（每天吸煙數(shù)量≥5支）史者；篩選前12個(gè)月內(nèi)有藥物濫用史或成癮性物質(zhì)檢測(cè)陽(yáng)性者；篩選前3個(gè)月內(nèi)接受過(guò)手術(shù)（特別是會(huì)影響藥物吸收、分布、代謝、排泄的手術(shù)）或者計(jì)劃在試驗(yàn)期間進(jìn)行手術(shù)者；篩選前14 d內(nèi)有處方藥、非處方藥、中草藥、保健品服用史者。按上述標(biāo)準(zhǔn)，本研究最終納入健康受試者24名。所有受試者均簽署知情同意書(shū)，年齡為（24±3）歲，身高為（1.70±0.06）m，體質(zhì)量為（61.9±6.9）kg，BMI符合上述標(biāo)準(zhǔn)。

2.12.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究采用隨機(jī)、開(kāi)放、雙周期交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)：將24名受試者隨機(jī)分成2組（每組12名），禁食過(guò)夜10 h后，于每周期試驗(yàn)首日早晨進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)餐30 min后，分別口服受試制劑或參比制劑50 mg（用溫開(kāi)水240 mL送服）。受試者兩周期服藥順序由隨機(jī)結(jié)果決定，清洗期為1周。分別于服藥前以及服藥后20、40 min和1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、10、12、15、24 h時(shí)于肘靜脈取血3 mL，置于肝素鈉采血管中，于4℃下以2 304×g離心5 min，分離上層血漿，將血漿分成2份（1份用于檢測(cè)，1份用于備份），于-20℃下凍存。本研究所用標(biāo)準(zhǔn)餐食譜符合餐后生物等效性研究設(shè)計(jì)中對(duì)高脂高熱量食譜的要求[6]。

2.12.3 生物等效性評(píng)價(jià) 24名受試者均完成試驗(yàn)。取其凍存的血漿樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿樣品中大黃酸的質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示，受試者血漿樣品中大黃酸的質(zhì)量濃度為35～7 305 ng/mL，均在線性范圍內(nèi)。采用DAS 3.2.9軟件繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線并計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)包括血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0-24h、AUC0-∞）、峰濃度（cmax）、達(dá)峰時(shí)間（tmax）、半衰期（t1/2）。其中，cmax和tmax均以實(shí)測(cè)值表示；AUC0-24h用梯形法計(jì)算；AUC0-∞和t1/2分別按下式計(jì)算：AUC0-∞＝AUC0-24h+ct/λz，t1/2＝0.693/λz（式中，ct為最后1個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度；λz為末端消除速率常數(shù)，以對(duì)數(shù)血藥濃度-時(shí)間曲線末端直線部分的斜率求得）。24名受試者餐后口服受試制劑和參比制劑50 mg后，大黃酸的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

圖2 受試者餐后口服受試制劑和參比制劑50 mg后大黃酸的平均血藥濃度-時(shí)間曲線（n＝24）

表3 受試者餐后口服受試制劑和參比制劑50 mg后大黃酸的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝24）

表3 受試者餐后口服受試制劑和參比制劑50 mg后大黃酸的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝24）

a：tmax以“中位數(shù)（最小值，最大值）”表示

制劑受試制劑參比制劑t1/2/h 4.26±1.12 4.19±1.05 AUC0-24 h/（ng·h/mL）25764±6134 24316±5856 AUC0-∞/（ng·h/mL）26679±6409 25170±6415 cmax/（ng/mL）3517±1121 3225±755 tmaxa/h 3.50（0.67，12.00）4.00（1.50，7.00）

本研究對(duì)受試者餐后狀態(tài)下的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（cmax、AUC0-24h、AUC0-∞）進(jìn)行自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，然后以多因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，用雙向單側(cè)t檢驗(yàn)及90%置信區(qū)間來(lái)評(píng)價(jià)受試制劑與參比制劑的生物等效性。若經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后受試制劑和參比制劑cmax、AUC0-24h、AUC0-∞幾何均值比的90%置信區(qū)間落在接受范圍（80.00%～125.00%）之內(nèi)，則表示兩制劑生物等效[5]。對(duì)tmax進(jìn)行配對(duì)秩和檢驗(yàn)。采用DAS 3.2.9軟件進(jìn)行上述統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

方差分析模型中，以序列、藥物、周期為固定效應(yīng)，受試者（序列）為隨機(jī)效應(yīng)，計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)幾何均值比（受試制劑/參比制劑）的90%置信區(qū)間。結(jié)果顯示，兩制劑cmax、AUC0-24h、AUC0-∞幾何均值比的90%置信區(qū)間分別為 100.8%～113.9%、103.1%～109.4%、103.2%～109.9%，相對(duì)生物利用度（受試制劑與參比制劑AUC0-24h之比）為（106.6±8.9）%。由此可判定，在餐后狀態(tài)下，兩制劑生物等效。此外，受試制劑的tmax與參比制劑比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

在試驗(yàn)過(guò)程中，所有受試者均未見(jiàn)明顯不良事件發(fā)生。相關(guān)檢測(cè)結(jié)果顯示，24名受試者血常規(guī)、尿常規(guī)等檢測(cè)值異常發(fā)生率低，且異常并無(wú)臨床意義；同時(shí)，未見(jiàn)有臨床意義的心電圖變化，其收縮壓、舒張壓、脈搏、體溫均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)。

3 討論

血漿中大黃酸濃度的測(cè)定方法包括高效液相色譜-紫外光譜（HPLC-UV）法[7-8]和 HPLC-MS/MS 法[4，9-10]。近年來(lái)，血漿大黃酸濃度的測(cè)定以靈敏度更高、專(zhuān)屬性更強(qiáng)的HPLC-MS/MS法為主。本研究樣本量較大，甲醇直接沉淀蛋白法具有簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)點(diǎn)[11]，可滿足雙醋瑞因膠囊藥動(dòng)學(xué)研究的大樣本檢測(cè)。因此，本研究采用甲醇沉淀蛋白進(jìn)行血漿樣品前處理，定量下限為30.00 ng/mL，低于文獻(xiàn)所示結(jié)果[4]。

在血藥濃度測(cè)定方面，本課題組對(duì)液相條件進(jìn)行了優(yōu)化：在水相中加入醋酸銨，有利于大黃酸和內(nèi)標(biāo)色譜峰峰形的改善。雖然有研究指出，在負(fù)離子掃描模式下，若在水相中加入酸性物質(zhì)（如甲酸），理論上會(huì)減弱大黃酸的色譜響應(yīng)[12]。但本課題組前期考察結(jié)果顯示，在水相中加入少量甲酸有利于大黃酸和內(nèi)標(biāo)色譜峰峰形的進(jìn)一步改善，且不會(huì)影響大黃酸的定量下限；同時(shí)，當(dāng)在水相中加入0.4%的甲酸時(shí)，大黃酸色譜峰的響應(yīng)較強(qiáng)且保留時(shí)間適中。此外，筆者在檢測(cè)方法建立的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在等度洗脫條件下連續(xù)分析多個(gè)樣品后，大黃酸的質(zhì)譜響應(yīng)波動(dòng)明顯且有減弱趨勢(shì)，分析原因可能與蛋白沉淀所得血漿樣品中內(nèi)源性雜質(zhì)較多有關(guān)，遂在保證試驗(yàn)效率的基礎(chǔ)上，采取如下措施：（1）在沉淀蛋白后，取上清液300 μL并加水600 μL稀釋?zhuān)靹蚝笤龠M(jìn)樣分析，有助于減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾并降低液質(zhì)聯(lián)用儀、色譜柱被污染的可能性；（2）將流動(dòng)相洗脫方式優(yōu)化為梯度洗脫，即先用75%甲醇等度洗脫，使大黃酸及內(nèi)標(biāo)出峰；再用95%甲醇洗脫，洗去內(nèi)源性雜質(zhì)以減少對(duì)后續(xù)樣品檢測(cè)的影響。

本研究報(bào)道了餐后狀態(tài)下中國(guó)健康受試者口服雙醋瑞因膠囊后主要代謝產(chǎn)物大黃酸的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)。Mandawgade等[13]報(bào)道，印度健康志愿者餐后口服雙醋瑞因膠囊50 mg，其體內(nèi)大黃酸的AUC0-∞、cmax、tmax分別為26 578.63 ng·h/mL、4 298.63 ng/mL、5 h；Nicolas等[14]報(bào)道，法國(guó)健康志愿者餐后口服雙醋瑞因膠囊50 mg后，其體內(nèi)大黃酸的AUC0-∞為25 900 ng·h/mL，tmax為5.2 h。本研究所得受試制劑和參比制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0-∞、tmax與上述文獻(xiàn)接近，但cmax與Mandawgade等[13]的結(jié)果有所差異，這可能與樣本量和受試者人群不同有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，受試制劑（國(guó)產(chǎn)雙醋瑞因膠囊）和參比制劑（安必丁?）生物等效。

綜上所述，在受試者餐后狀態(tài)下，受試制劑和參比制劑生物等效。本研究采用甲醇沉淀蛋白預(yù)處理血漿樣品，使用HPLC-MS/MS法測(cè)定了中國(guó)健康受試者餐后口服雙醋瑞因膠囊后血漿中活性代謝產(chǎn)物大黃酸的濃度，計(jì)算了該成分的主要藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，并評(píng)價(jià)了受試制劑與參比制劑的生物等效性，為國(guó)產(chǎn)雙醋瑞因膠囊上市及臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù)。