韓利紅，柯欣茹，秦相月，普 琪，任怡園，劉 潮

(曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院/云南省高校特色果酒技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用工程研究中心，云南 曲靖 655011)

【研究意義】蟲草屬[Cordyceps(Fr.) Link]和棒束孢屬(IsariaFries)真菌隸屬于蟲草科(Cordycipitaceae)，其中很多物種具有重要經(jīng)濟價值。蟲草屬物種多富含蟲草素、腺苷、噴司他丁和多糖等有效成分，可作為冬蟲夏草的替代品；棒束孢屬物種中的有效活性成分一般包括蟲草酸、多糖、麥角甾醇和腺苷等，它們被廣泛應(yīng)用于抗菌、抗病毒、抗腫瘤、提高免疫力等方面，具有較高醫(yī)療保健價值[1-3]。蟲草屬真菌多為昆蟲病原真菌，通過寄生于落葉層、苔蘚或表層土壤的昆蟲體內(nèi)，從變成僵蟲的蟲體前端生出有柄頭狀或棍棒狀的子座[4-5]。2018年5月公布的《中國生物多樣性紅色名錄—大型真菌卷》(生態(tài)環(huán)境部)包含了59種蟲草屬和2種棒束孢屬物種。線粒體作為真核生物的能量工廠，是具有獨立基因組的半自主細(xì)胞器，在真核生物生長發(fā)育、能量代謝和應(yīng)激響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[6]。線粒體基因組已成為研究真核生物起源、進化和系統(tǒng)發(fā)育的重要工具[7-10]。線粒體基因組的大小、結(jié)構(gòu)、基因排列、重復(fù)序列內(nèi)容和內(nèi)含子信息成為反映真核生物起源和進化的重要參考[7,11]。【前人研究進展】近20年來，隨著分子生物學(xué)證據(jù)的加入，這2個屬的分類地位發(fā)生了較大變化。Sung等[5]基于7個基因分子片段(nrLSU+nrSSu+tef1α+rpb1+rpb2+β-tubulin+atp6)，對廣義蟲草開展了分子系統(tǒng)發(fā)育研究，發(fā)現(xiàn)廣義蟲草屬[Cordyceps(Fr.) Link s.l.]和廣義麥角菌科(Clavicipitaceaes.l.)均為多系類群，依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹不同演化枝的聚類關(guān)系，可將廣義麥角菌科分為3個科，分別為狹義麥角菌科(Clavicipitaceae s.s.)、蟲草科(Cordycipitaceae)和線蟲草科(Ophiocordycipitaceae)，但棒束孢屬位于狹義蟲草屬(Cordycepss.s.)分支中。Kepler等[12]基于5個分子片段(nrLSU+nrSSU+teff1α+rpb1+rpb2)，針對蟲草科物種分類展開了系統(tǒng)發(fā)育研究，將狹義蟲草屬細(xì)分為11個屬，其中包括蟲草屬和白僵菌屬(Beauveria)等；而棒束孢屬為多系起源，該屬部分物種甚至超出了蟲草科的范疇，因此將粉質(zhì)棒束孢(Isariafarinose)和細(xì)腳棒束孢(I.tenuipes)等與蟬棒束孢(C.cicade)親緣關(guān)系較近的物種置于蟲草屬下，修訂為粉質(zhì)蟲草(C.farinose)和細(xì)腳蟲草(C.tenuipes)。一些棒束孢屬物種被證實為蟲草無性型，如細(xì)腳蟲草為高雄山蟲草無性型[13]。李增智等[14-15]基于6個分子片段(ITS+nrLSU+nrSSu+teff1α+rpb1+rpb2)，描述了新種蟬花蟲草(C.chanhuaZ.Z. Li，F(xiàn).G. Luan，HywelJones，C.R. Li & S.L. Zhang)，并證明C.cicadae代表了一個物種復(fù)合群。蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyceshepiali)是我國重要藥用蟲草真菌，Wang等[16]將其轉(zhuǎn)移至Samsoniella屬，該屬兼具類似蟲草屬有性形態(tài)和棒束孢屬無性形態(tài)，一些棒束孢屬物種被重新歸在該屬[17]。蛹蟲草和蟬花蟲草等部分物種被廣泛用于生產(chǎn)栽培，針對菌株選育[18-19]、有效成分[20-22]和培養(yǎng)條件[23]等開展了大量研究。目前多個蟲草屬物種核基因組[24-25]和線粒體基因組[26-29]已被公布，蛹蟲草基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等研究[30-31]對蟲草屬資源保護、菌種選育和資源開發(fā)具有重要的推動作用?！颈狙芯壳腥朦c】蟲草屬物種具有重要的藥食兩用經(jīng)濟價值及巨大開發(fā)應(yīng)用前景，近年來已成為人們的研究熱點之一。但是，關(guān)于蟲草科代表性物種線粒體基因組特征及其進化的研究還較少，相關(guān)遺傳分析對于揭示該科物種的起源進化、資源保護和開發(fā)利用均具有重要的理論和實踐指導(dǎo)意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究基于線粒體基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法，對蟲草屬物種的親緣關(guān)系和遺傳多樣性進行研究，為蟲草資源的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列獲取

從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載球孢蟲草(C.bassiana)、布氏蟲草(C.brongniartii)、蟬花蟲草(C.chanhua)、粗糙蟲草(C.confragosa)、蛹蟲草(C.militaris)、粉被蟲草(C.pruinosa)、細(xì)腳蟲草(C.tenuipes)、蟬棒束孢(C.cicadae)、粉質(zhì)蟲草(C.farinosa)9個蟲草屬物種線粒體基因組數(shù)據(jù)。

1.2 基因組組成分析

使用MEGA X[32]統(tǒng)計各物種線粒體基因組4種堿基構(gòu)成。為了解線粒體基因組的堿基使用偏性，分別計算AT偏移(AT-skew)和GC偏移(GC-skew)[33]。計算公式分別為AT-skew=(A-T)/(A+T)和GC-skew=(G-C)/(G+C)。

1.3 重復(fù)序列分析

利用REPuter軟件(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer)分析線粒體基因組序列重復(fù)，包括正向(forward)、反向(reverse，R)、回文(palindromic)和互補(complementary，C)重復(fù)，篩選參數(shù)為最小重復(fù)長度30 bp，Hamming距離3。利用MISA在線工具(https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/)檢測SSR數(shù)量及位置分布，最小重復(fù)數(shù)設(shè)置為單核苷酸為8，二核苷酸和三核苷酸為4，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸均為3。

1.4 序列多樣性分析

利用mVISTA在線軟件(https://genome.lbl.gov/vista/index.shtml)，以球孢蟲草(C.bassiana)線粒體基因組(EU100742)序列為參照，對蟲草屬物種線粒體基因組序列變異進行可視化比對。利用MAFFT v7.490 軟件(https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)對各物種線粒體蛋白編碼基因串聯(lián)序列進行比對，使用DnaSP v 6.10[34]分析線粒體蛋白編碼序列(Coding sequence，CDS)核苷酸多樣性(Pi)，以分析蟲草屬物種的基因變異程度。

1.5 基因進化分析

利用MAFFT v7.490 軟件對各物種線粒體CDS進行比對，利用PAMLX[35]的CODEML算法采用位點模型法對正選擇位點進行檢測，并評價蟲草屬物種線粒體基因的進化情況。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

為分析蟲草屬物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從GenBank數(shù)據(jù)庫下載5個白僵菌屬(Beauveria)、3個蠟蚧菌屬(Lecanicillium)和2個擬青霉屬(Paecilomyces)物種線粒體基因組序列，使用MAFFT進行多序列比對，通過IQ-TREE v. 2.1.1軟件基于最大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹模型為GTR+F+R4，步長值為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體基因組組成

根據(jù)已公布的線粒體數(shù)據(jù)分析顯示，蟲草屬物種線粒體基因組大小差異較大，其中細(xì)腳蟲草基因組最大(66.7 kb)，其次是蟬棒束孢(56.6 kb)，而粉質(zhì)蟲草最小(24.2 kb)，平均大小為39.3 kb，均含有15個蛋白編碼基因(Protein coding gene，PCG)和2個rRNA，不同物種編碼的tRNA數(shù)目略有差異(表1)。所有物種線粒體基因組AT堿基比例均高于72%，含有較高的A和T堿基。核苷酸偏移(skew)分析顯示，蟲草屬物種線粒體基因組多數(shù)AT-skew(除粗糙蟲草和粉質(zhì)蟲草外)和GC-skew均為正值，相比于T，多數(shù)物種更偏好A，但偏差程度很小，而相對于C，所有物種更偏好G。與基因組相比，蛋白 編碼基因更偏好使用堿基T，且不同密碼子位置的堿基偏移有明顯差異，其中第1位偏好T和G，第2位偏好T和C，第3位偏好A和C(表2)。結(jié)果表明，蟲草屬物種線粒體基因組偏好嘌呤堿基，而蛋白編碼基因密碼子不同位置有不同的偏好，這可能與密碼子的簡并性和基因表達(dá)有關(guān)。

表1 蟲草屬物種線粒體基因組特征

表2 蟲草屬物種線粒體基因組堿基組成及偏移

2.2 線粒體基因組重復(fù)序列

重復(fù)序列分析發(fā)現(xiàn)，蟲草屬物種重復(fù)序列數(shù)目差異較大，細(xì)腳蟲草含有的重復(fù)序列數(shù)最多，達(dá)81個，其次為布氏蟲草含有57個，而粉被蟲草僅含有1個反向重復(fù)，粉質(zhì)蟲草僅含有1個回文重復(fù)(圖1-A)。各物種重復(fù)序列以正向重復(fù)和回文重復(fù)為主，僅含少量的反向序列，未發(fā)現(xiàn)互補序列。30～39 bp長度的重復(fù)序列數(shù)目最多，其次為40～49 bp長度序列(圖1-B)。

圖1 蟲草屬物種線粒體基因組重復(fù)序列類型及分布Fig.1 Type and distribution of repeats in the mitogenome of Cordyceps species

蟲草屬線粒體基因組中含有13～27個SSR位點(圖2-A)，主要以二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重復(fù)為主，其中各物種三核苷酸數(shù)目接近，均介于5～9個，其他類型SSR數(shù)目種間差異較大，所有物種均未檢測到六核苷酸重復(fù)(圖2-A)。單核苷酸全部為A/T重復(fù)，二核苷酸重復(fù)僅有AT/AT 1種類型，三核苷酸重復(fù)僅有AAT/ATT重復(fù)，均未檢測到CG/GC重復(fù)，四核苷酸重復(fù)有AAGC/CTTG、AAGT、AATT/AATT和AAAT/ATTT 4種類型，五核苷酸重復(fù)有AATAA和ATTAT 2種類型，未檢測到六核苷酸重復(fù)，所有SSR中均含有較高比例的A或T堿基(圖2-B)。

圖2 蟲草屬物種線粒體基因組SSR位點類型及分布Fig.2 Type and distribution of SSRs in the mitogenome of Cordyceps species

2.3 線粒體基因組結(jié)構(gòu)變異

以球孢蟲草線粒體基因組(EU100742)為參照，利用mVISTA軟件分析了蟲草屬線粒體基因組結(jié)構(gòu)變異(圖3)。結(jié)果顯示，9個物種線粒體基因組結(jié)構(gòu)相似度較高，未發(fā)生基因重排現(xiàn)象，非編碼區(qū)的變異水平高于編碼區(qū)，tRNA區(qū)的變異水平低于PCG區(qū)和rRNA區(qū)。分析發(fā)現(xiàn)，9個物種線粒體基因組大小和內(nèi)含子長度之間的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.960(P<0.001)，二者呈線性相關(guān)(圖4)，表明線粒體基因組大小與內(nèi)含子密切相關(guān)，內(nèi)含子區(qū)增加或減少顯著影響線粒體基因組大小。

圖3 蟲草屬物種線粒體基因組結(jié)構(gòu)比較Fig.3 Comparison of mitogenome structure of Cordyceps species

圖4 蟲草屬線物種粒體基因組大小與內(nèi)含子長度相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between mitogenome sizes and intron lengths of Cordyceps species

使用DnaSP軟件對蟲草屬物種線粒體14個編碼基因核苷酸多態(tài)性(Nucleotide diversity，Pi)進行分析(圖5)。9個物種線粒體編碼基因平均Pi值為0.045，基因rps3核苷酸變異程度最高(Pi值0.097)，其次為nad6(Pi值0.061)，此外，nad1、cox3、nad4、nad2和nad3的Pi值均大于0.05。

圖5 蟲草屬物種線粒體蛋白編碼基因序列核苷酸多態(tài)性Fig.5 The nucleotide diversity (Pi) of mitogenome sequence of Cordyceps species

2.4 基因進化分析

為了解基因在進化過程中是否受到選擇作用，利用PAML軟件對蟲草屬線粒體蛋白編碼基因dN/dS比率和正選擇位點進行分析(圖6，表3)。dN/dS比率用于在密碼子替換模型中估計選擇壓力，dN/dS<1、dN/dS=1和dN/dS>1分別表示純化、中性和正選擇[36]。所有基因的dN/dS比率均小于1，表明蟲草屬線粒體蛋白編碼基因主要受純化選擇作用。根據(jù)經(jīng)驗貝葉斯分析，共有7個蛋白質(zhì)編碼基因正選擇位點達(dá)顯著水平(P>95%)，分別為nad4、rps3、cob、nad2、nad1、nad6和cox1，正選擇位點數(shù)分別為6、5、4、3、2、2和1(表3)。結(jié)果表明，盡管蟲草屬線粒體基因主要受純化選擇作用，但部分位點仍受到正選擇作用。

圖6 蟲草屬物種線粒體蛋白編碼基因dN/dS分析Fig.6 The dN/dS ratio analyses of the protein coding genes of mitogenome of Cordyceps species

表3 基于位點模型的蟲草屬物種線粒體蛋白編碼基因正選擇分析

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于線粒體基因組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了蟲草屬物種系統(tǒng)發(fā)育樹(圖7)。粗糙蟲草和粉質(zhì)蟲草聚類關(guān)系較近，與蠅蚧疥霉(Lecanicilliummuscarium)和蝙蝠蛾擬青霉聚在一起，靠近系統(tǒng)發(fā)育樹基部，隨后是粉被蟲草，節(jié)點支持率均為100%。細(xì)腳蟲草、蟬棒束孢和蟬花蟲草以100%的支持率聚在一支。

圖7 基于IQ-TREE軟件構(gòu)建的蟲草屬物種線粒體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of mitogenome sequences of Cordyceps species based on IQ-TREE

3 討 論

線粒體基因組的結(jié)構(gòu)變異或基因突變可影響真核細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)和代謝過程。不同科屬真菌的線粒體基因組在基因含量、基因排列、重復(fù)序列和內(nèi)含子數(shù)量上存在較大差異，甚至親緣關(guān)系很近的物種之間也有不同[11,37-38]。本研究對9個蟲草屬線粒體基因組特征及進化進行了分析，發(fā)現(xiàn)蟲草屬物種線粒體基因組大小存在較大差異，平均為39.3 kb，但編碼的基因數(shù)目基本一致。線粒體基因在AT和GC傾斜上略有不同，但總體趨勢一致，基因組偏好A和G，編碼蛋白基因不同密碼子位置偏好明顯，這可能與密碼子的簡并性和基因表達(dá)有關(guān)。

線粒體基因組序列變異率往往大于核基因組，甚至一些近緣種間的線粒體也存在較大的差異。與銀耳(Tremellafuciformis)等近緣種相比，稻瘟菌(Hannaellaoryzae)線粒體核心PCG在長度和堿基組成上有很高的變異率[11]。物種進化過程中，大部分線粒體基因轉(zhuǎn)移到核基因組，但大多數(shù)真菌仍保留14個用于能量代謝的保守蛋白質(zhì)編碼基因和1個rps3基因，這些被稱為真菌線粒體基因組的核心PCGs[39]。多種因素導(dǎo)致線粒體基因組大小差異，包括內(nèi)含子、未知功能基因和基因間序列的動態(tài)變化，這些因素共同導(dǎo)致牛肝菌屬不同物種間較大的線粒體基因組差異[7]。蟲草屬線粒體均含有15個保守的蛋白編碼基因，基因組大小與內(nèi)含子長度正相關(guān)，二者呈線性關(guān)系，表明內(nèi)含子長度和數(shù)量直接影響了物種線粒體基因組大小。蟲草屬物種的線粒體結(jié)構(gòu)高度相似，未發(fā)現(xiàn)基因重排現(xiàn)象，基因順序高度保守，反映了這些物種具有密切的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。與牛肝菌屬(Boletus)[7]、栓菌屬(Trametes)[40]和一些擔(dān)子菌門(Basidiomycota)[39]真菌研究一致，蟲草屬線粒體基因組大小與內(nèi)含子含量密切相關(guān)，線粒體基因組大小受到內(nèi)含子區(qū)插入或缺失的影響。研究發(fā)現(xiàn)，rps3、nad6和nad1等表現(xiàn)出較高的核苷酸多態(tài)性，這些變異度較高的基因可為種群遺傳學(xué)提供潛在的分子標(biāo)記。所有基因均受純化選擇作用，但從nad4、rps3、cob、nad2和cox1等5個基因中檢測到多個正選擇位點，表明這些基因在與宿主和環(huán)境互作過程中受到了輕微的選擇作用，可能與物種的生態(tài)適應(yīng)性有關(guān)。

蟲草屬種類豐富、生活史復(fù)雜，歷史分類地位多次變更[13,16]。隨著分子系統(tǒng)發(fā)育研究的發(fā)展，核基因組和線粒體基因組被廣泛用于真菌物種的分類和鑒定。因線粒體基因組較小，測序成本低，具有較高的保守性和區(qū)分度，已成為分析真菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的重要研究方向。本研究基于線粒體基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)粗糙蟲草、粉質(zhì)蟲草和蝙蝠蛾擬青霉聚在一支，細(xì)腳蟲草、蟬棒束孢和蟬花蟲草親緣關(guān)系較近，該結(jié)果與基于核基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系類似[5,13]，證明線粒體基因組序列是有效的蟲草類真菌分類研究的分子標(biāo)記。隨著高通量測序成本的降低，越來越多的真菌線粒體基因組被測序，有望在大型真菌的進化、起源和系統(tǒng)發(fā)育研究中發(fā)揮更大的作用。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，蟲草屬物種線粒體基因組大小存在較大差異，主要受內(nèi)含子長度影響，但基因組結(jié)構(gòu)高度保守，未檢測到基因重排。線粒體重復(fù)序列和SSR數(shù)目差異較大，正向重復(fù)和回文重復(fù)比例較高，含有較多的二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重復(fù)SSR。編碼基因主要受純化選擇影響，部分基因存在正選擇位點。粗糙蟲草和粉質(zhì)蟲草親緣關(guān)系較近，而細(xì)腳蟲草則與蟬花蟲草親緣關(guān)系較近。蟲草屬線粒體基因組研究可為蟲草類真菌資源保護和開發(fā)利用提供參考。