郭雪萍，馬英才，李澤龍，王添姿，高函雅，徐李依娜， 吳煜鋒，鐘 旗，姚 剛*，馬雪連,2*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧學(xué)博士后流動(dòng)站，烏魯木齊 830052； 3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830000)

牛傳染性鼻氣管炎(bovine infectious rhinotracheitis，IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus，IBRV)引起的牛的一種急性接觸性傳染病，又稱(chēng)紅鼻病或壞死性鼻炎，臨床上以高熱、鼻炎和上呼吸道炎癥為主要特征，并可引起膿皰性外陰陰道炎、龜頭炎及母牛的乳汁減少和流產(chǎn)等癥狀。近年來(lái)，隨著IBR感染率的升高，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)IBRV的研究主要集中在臨床應(yīng)用方面，而關(guān)于IBRV的致病機(jī)制及如何誘導(dǎo)宿主細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷的研究還不夠深入。線(xiàn)粒體是細(xì)胞的“動(dòng)力工廠(chǎng)”，細(xì)胞生命活動(dòng)所需能量大部分是由線(xiàn)粒體的氧化磷酸化產(chǎn)生。多種細(xì)胞代謝過(guò)程都有線(xiàn)粒體的參與。近年來(lái)研究表明，線(xiàn)粒體在宿主細(xì)胞抗病毒反應(yīng)中起著核心作用。一方面，當(dāng)病毒感染細(xì)胞時(shí)，線(xiàn)粒體抗病毒信號(hào)蛋白(mitochondria antiviral signaling protein，MAVS)作為干擾素β的啟動(dòng)子，可刺激相關(guān)復(fù)合體的生成激活信號(hào)通路，誘導(dǎo)干擾素表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)天然免疫反應(yīng)。另一方面，病毒入侵細(xì)胞后，也可通過(guò)造成線(xiàn)粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的丟失、線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的異常開(kāi)放損傷線(xiàn)粒體，阻礙線(xiàn)粒體的正常功能，從而改變細(xì)胞內(nèi)正常的生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。綜上所述，線(xiàn)粒體損傷是病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。

本研究采用透射電鏡、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)觀(guān)察細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷情況、檢測(cè)MMP、MPTP等指標(biāo)，確定IBRV誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷最適濃度和時(shí)間點(diǎn)，以期為深入探討IBR的發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑 MDBK細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心細(xì)胞庫(kù)，IBRV病毒株(AV21)購(gòu)自于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Biological Industries公司，MPTP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博公司，MMP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑(探針?lè)?購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，電鏡固定液購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司，812包埋劑購(gòu)自SPI公司，鋨酸購(gòu)自Ted Pella Inc公司。

1.1.2 主要儀器 全自動(dòng)新型隔水恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Galaxy 170 R)、高速離心機(jī)和移液器均購(gòu)自Eppendorf；醫(yī)用凈化工作臺(tái)(YJ-875)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自Bri Cyte，普通光學(xué)顯微鏡(AE31E)購(gòu)自Nikon，透射電子顯微鏡(HT7800)購(gòu)自HITACHI，7500 Fast Real-Time PCR System購(gòu)自Thermo Scientific。

1.2 方 法

1.2.1 IBRV誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞病變情況檢測(cè) 使用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37 ℃、含5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MDBK細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至85%～90%，用0.5、1.0、1.5、2.0 MOI IBRV病毒感染MDBK細(xì)胞，于感染后6、12、24、36、48 h時(shí)間點(diǎn)置于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞病變。

1.2.2 IBRV誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷最適濃度的確定 按照3×10·孔細(xì)胞數(shù)將MDBK細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至85%～90%，分別用0.5、1.0、1.5、2.0 MOI IBRV病毒感染MDBK細(xì)胞，12 h后收集細(xì)胞，按照病毒DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)；根據(jù)MPTP及MMP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線(xiàn)粒體損傷情況。

1.2.3 IBRV誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷最佳時(shí)間的確定 按照3×10·孔細(xì)胞數(shù)將MDBK細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至85%～90%，用1.5 MOI的病毒感染MDBK細(xì)胞，于感染后6、12、24、36 h后收集細(xì)胞，按照病毒DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)；根據(jù)MPTP及MMP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線(xiàn)粒體損傷情況。

1.2.4 引物和探針 特異性引物和特異性TaqMan探針Probe是參照GenBank中已發(fā)表的IBRV-基因序列(登錄號(hào)：MK654723.1)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如表1。

表1 引物及探針序列Table 1 Sequence of primers and probe

1.2.5 透射電鏡觀(guān)察線(xiàn)粒體損傷情況 按照3×10·孔細(xì)胞數(shù)將MDBK細(xì)胞接種至100 mm皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至85%～90%，用1.5 MOI 的IBRV病毒感染MDBK細(xì)胞6、24 h，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，放置2.5%戊二醛固定液固定24 h，再經(jīng)過(guò)1%鋨酸后固定，系列乙醇脫水，純812包埋劑37 ℃ 5～8 h，超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，最后用透射電鏡觀(guān)察。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 各組結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 IBRV誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞病變情況

分別將感染0.5、1.0、1.5、2.0 MOI IBRV的MDBK細(xì)胞于6、12、24、36、48 h置于普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，結(jié)果顯示，12 h起就有細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)皺縮，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞出現(xiàn)拉網(wǎng)、葡萄串樣典型病變，48 h時(shí)細(xì)胞病變率達(dá)到90%以上(圖1)。

圖1 不同濃度及時(shí)間IBRV誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞病變情況(bar=100 μm)Fig.1 MDBK cell pathological changes induced by IBRV at different concentrations and times(bar=100 μm)

2.2 IBRV誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷最適濃度

不同MOI IBRV感染MDBK細(xì)胞12 h后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，結(jié)果顯示：隨著病毒濃度的增加，病毒拷貝數(shù)逐漸上升(圖2)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MPTP及MMP變化情況，結(jié)果顯示：MPTP檢測(cè)值在0.5 MOI時(shí)，與對(duì)照組相比差異顯著(<0.05)，其他三個(gè)感染組與對(duì)照組相比差異極顯著(<0.01)，其中，1.5 MOI的檢測(cè)值降低最明顯(圖3)。MMP檢測(cè)值在1.5～2.0 MOI時(shí)，與對(duì)照組相比差異極顯著(<0.01)，其他兩個(gè)感染組與對(duì)照組相比差異不顯著(>0.05)(圖4)。結(jié)果表明，1.5 MOI為IBRV誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷最適濃度。

圖2 不同MOI IBRV感染MDBK細(xì)胞12 h病毒拷貝數(shù)Fig.2 Virus copy number of MDBK cells infected with different MOI IBRV for 12 h

*.P<0.05；**.P<0.01圖3 不同MOI IBRV感染MDBK細(xì)胞12 h MPTP變化情況Fig.3 The changes of MPTP in MDBK cells infected with different MOI of IBRV for 12 h

*.P<0.05；**.P<0.01圖4 不同MOI IBRV感染MDBK細(xì)胞12 h MMP變化情況Fig.4 The changes of MMP in MDBK cells infected with different MOI of IBRV for 12 h

2.3 IBRV誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷最佳時(shí)間

1.5 MOI的IBRV感染MDBK細(xì)胞6、12、24、36 h后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，結(jié)果顯示：隨著時(shí)間的增加，病毒拷貝數(shù)逐漸上升(圖5)。

圖5 1.5 MOI IBRV感染MDBK細(xì)胞不同時(shí)間病毒拷貝數(shù)Fig.5 Virus copy number of MDBK cells infected with 1.5 MOI IBRV at different times

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MPTP、MMP變化情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MPTP和MMP檢測(cè)值隨著病毒感染時(shí)間增加而降低，其中MPTP在12 h 后極顯著低于對(duì)照組(<0.01)(圖6)，MMP在24 h后極顯著低于對(duì)照組(<0.01)(圖7)。

*.P<0.05；**.P<0.01圖6 1.5 MOI IBRV感染MDBK細(xì)胞不同時(shí)間MPTP變化情況Fig.6 The changes of MPTP in MDBK cells infected with 1.5 MOI IBRV at different times

*.P<0.05；**.P<0.01圖7 1.5 MOI IBRV感染MDBK細(xì)胞不同時(shí)間MMP變化情況Fig.7 The changes of MMP in MDBK cells infected with 1.5 MOI IBRV at different times

2.4 IBRV誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷電鏡檢測(cè)

由圖8可見(jiàn)，IBRV感染MDBK細(xì)胞6 h和24 h后可以觀(guān)察到細(xì)胞線(xiàn)粒體發(fā)生不同程度的損傷感染。NC組線(xiàn)粒體致密，6 h時(shí)線(xiàn)粒體腫脹，破裂，24 h線(xiàn)粒體腫脹更加明顯，出現(xiàn)嵴斷裂現(xiàn)象、空泡狀，并且在線(xiàn)粒體附近可以看到IBRV病毒粒子。

箭頭所指為線(xiàn)粒體；三角所指為IBRV病毒粒子The arrow points to the mitochondria; the triangle points to the IBRV virus particles圖8 透射電鏡觀(guān)察MDBK細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷情況Fig.8 Transmission electron microscope observation of mitochondrial damage in MDBK cells

3 討 論

作為細(xì)胞存活和死亡的關(guān)鍵細(xì)胞器，線(xiàn)粒體損傷主要表現(xiàn)在形態(tài)、MMP、MPTP的開(kāi)放情況以及Ca通透性等方面。MMP的丟失會(huì)導(dǎo)致內(nèi)膜(IM)和外膜(OM)的膜電位失衡，進(jìn)而誘導(dǎo)正常細(xì)胞生物合成功能和生物能量學(xué)停滯，最終導(dǎo)致線(xiàn)粒體損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；其次MPTP的異常開(kāi)放使得細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)caspase凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可導(dǎo)致MMP的消失，進(jìn)而誘導(dǎo)線(xiàn)粒體損傷。因此，線(xiàn)粒體損傷的主要檢測(cè)方法為MMP檢測(cè)法、MPTP檢測(cè)法、ROS檢測(cè)法、mtDNA缺失突變法以及觀(guān)察線(xiàn)粒體形態(tài)等。本研究正是通過(guò)檢測(cè)MPTP、MMP以及用透射電鏡觀(guān)察線(xiàn)粒體形態(tài)變化情況，證實(shí)IBRV可誘導(dǎo)MDBK線(xiàn)粒體損傷,并且篩選出了最佳濃度和時(shí)間點(diǎn)。

線(xiàn)粒體在宿主抗病毒反應(yīng)中起著不可或缺的作用，多種病毒感染細(xì)胞時(shí)都會(huì)引起線(xiàn)粒體損傷。例如，PRRSV感染會(huì)引起線(xiàn)粒體損傷，導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜電位的破壞和活性氧的增加。HCV感染通常導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，干擾細(xì)胞的鈣信號(hào)通路，鈣穩(wěn)態(tài)的破壞改變了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)，增加的鈣被線(xiàn)粒體吸收，導(dǎo)致MMP的破壞，進(jìn)而使線(xiàn)粒體損傷。而關(guān)于IBRV誘導(dǎo)宿主細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷的研究較少。

在病毒誘導(dǎo)細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷時(shí)間的研究中，王巖等在CPV感染MDCK細(xì)胞24 h后，可顯著提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，引起細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷。楊雪等用HTLV-1感染細(xì)胞24 h后，宿主細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位呈顯著下降趨勢(shì)，線(xiàn)粒體出現(xiàn)損傷。這些研究表明，大多數(shù)病毒感染細(xì)胞24 h內(nèi)就可引起線(xiàn)粒體損傷，導(dǎo)致功能障礙，造成細(xì)胞內(nèi)能量合成受阻、代謝障礙、細(xì)胞發(fā)生自噬、凋亡等。在本研究中，使用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察MDBK細(xì)胞感染不同MOI的IBRV在6、12、24、36、48 h的變化情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在12 h時(shí)零星開(kāi)始病變，用不同MOI感染MDBK細(xì)胞12 h檢測(cè)MMP和MPTP變化，結(jié)果顯示，1.5 MOI病毒液為誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷的最佳濃度；再用1.5MOI IBRV感染MBDK細(xì)胞6、12、24、36 h檢測(cè)MMP和MPTP變化，結(jié)果顯示，6～24 h為IBRV誘導(dǎo)MDBK細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷的最佳時(shí)間。

細(xì)胞中的線(xiàn)粒體具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，且敏感多變，外界刺激很容易破壞其正常的形態(tài)和功能。線(xiàn)粒體腫脹是引起線(xiàn)粒體大小改變導(dǎo)致線(xiàn)粒體損傷的重要特征，其中，還伴隨著線(xiàn)粒體基質(zhì)變透明、線(xiàn)粒體嵴被破壞呈空泡狀等。為進(jìn)一步證實(shí)IBRV可誘導(dǎo)MDBK線(xiàn)粒體損傷，且在1.5 MOI感染6 h起就已經(jīng)開(kāi)始，作者又采用透射電鏡技術(shù)對(duì)線(xiàn)粒體形態(tài)進(jìn)行觀(guān)察。結(jié)果顯示，在1.5 MOI的IBRV感染MDBK細(xì)胞6 h，可明顯觀(guān)察到線(xiàn)粒體腫脹，出現(xiàn)部分空泡化；在24 h時(shí)，呈現(xiàn)線(xiàn)粒體嵴斷裂、完全空泡化。

4 結(jié) 論

通過(guò)電鏡技術(shù)觀(guān)察線(xiàn)粒體損傷情況、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞MMP、MPTP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IBRV感染MDBK細(xì)胞可誘導(dǎo)線(xiàn)粒體損傷，使MPTP、MMP水平降低，線(xiàn)粒體腫脹，且1.5 MOI病毒液感染6～24 h為誘導(dǎo)細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷較理想的濃度和時(shí)間點(diǎn)。此研究為病毒感染細(xì)胞誘導(dǎo)線(xiàn)粒體損傷提供了培養(yǎng)模型，為進(jìn)一步明確線(xiàn)粒體損傷發(fā)生機(jī)制及IBR的發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。