徐春林，曹玉珠，夏 天，賈其輝，王丹丹，鄭 航，田亞東,2,3， 康相濤,2,3，蔣瑞瑞,2,3，劉小軍,2,3*，李 紅,2,3*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州 450046； 2.河南省家禽育種國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450046； 3.河南省雞種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450046)

脂類代謝與家禽生產(chǎn)密切相關(guān)，對(duì)飼料轉(zhuǎn)化率、肉蛋品質(zhì)及產(chǎn)蛋性能等重要經(jīng)濟(jì)性狀都有很大的影響。就雞而言，肝作為脂質(zhì)代謝的中心場(chǎng)所，在雌激素的作用下，產(chǎn)蛋期雞肝脂質(zhì)代謝極為旺盛，合成大量的以甘油三酯(triglyceride，TG)和膽固醇(cholesterol，TC)為主的中性脂肪。這些中性脂肪經(jīng)組裝形成極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)后分泌進(jìn)入血液循環(huán)并被輸送至卵巢，在膜受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入生長中的卵母細(xì)胞形成蛋黃。如果TG等脂類物質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂，會(huì)導(dǎo)致蛋雞營養(yǎng)代謝性疾病—脂肪肝的發(fā)生(fatty liver syndrome, FLS)，使產(chǎn)蛋水平明顯下降，并可進(jìn)一步發(fā)展為脂肪肝出血性綜合征(fatty liver hemorrhagic syndrome, FLHS)，從而影響肝的正常功能，甚至引起肝細(xì)胞破裂，最終導(dǎo)致肝內(nèi)出血而死亡，給蛋雞產(chǎn)業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究雞肝脂質(zhì)代謝對(duì)蛋禽生產(chǎn)具有重要的意義。

在哺乳動(dòng)物，VLDL的組裝是在載脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)以及微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(microsomal triglyceride-transfer protein，MTTP)等分子的協(xié)同作用下完成，其中MTTP是VLDL組裝和分泌的限速因素。抑制MTTP是治療高脂血癥和降低動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的重要途徑。人基因突變會(huì)導(dǎo)致肝內(nèi)的脂蛋白不能正常裝配和轉(zhuǎn)運(yùn)，肝細(xì)胞內(nèi)合成的脂質(zhì)分子不能轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，導(dǎo)致血漿中沒有ApoB脂蛋白，形成無β-脂蛋白血癥。試驗(yàn)證明，改變MTTP活性對(duì)VLDL的形成有直接的影響。然而，在家禽上，Ivessa等研究表明，MTTP不是產(chǎn)蛋雞合成富含ApoB脂蛋白時(shí)所必需的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，VLDL水平的顯著變化與MTTP表達(dá)水平并無相關(guān)性，表明MTTP不是雞肝VLDL組裝和分泌的關(guān)鍵因子。因此，雞肝VLDL組裝和分泌機(jī)理依然不清。

本課題組前期通過對(duì)產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)與產(chǎn)蛋前期(20周齡)雞肝轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，雞基因組中存在一個(gè)微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白樣新基因，命名為-基因()。該基因在產(chǎn)蛋高峰期雞肝中的表達(dá)量顯著高于產(chǎn)蛋前期。因此推測(cè)，可能在雞肝中發(fā)揮重要生物學(xué)功能。本研究對(duì)進(jìn)行了序列克隆以及生物學(xué)特性分析；對(duì)MTTPL進(jìn)行亞細(xì)胞定位；比較分析了雞和的時(shí)空表達(dá)規(guī)律；最后通過在體和離體試驗(yàn)研究雌激素對(duì)和表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，這這些研究結(jié)果將為進(jìn)一步揭示在雞肝脂質(zhì)代謝中的生物學(xué)功能奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽種質(zhì)資源場(chǎng)提供的1日齡、1周齡、10周齡和30周齡盧氏綠殼蛋雞各8只。頸部放血后，分別采集肝、小腸、腹脂、脾、肺、腎、胸肌、心、肌胃、腺胃、胰腺和卵巢12個(gè)組織，DEPC水沖洗后放入1.5 mL無 RNA酶的離心管中，迅速放入液氮中冷凍，-80 ℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

隨機(jī)選取體重相近健康的10周齡海蘭褐蛋雞80只，分成3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組20只雞，飼養(yǎng)在相同的環(huán)境中，按照蛋雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼喂，自由采食和飲水。經(jīng)過1周預(yù)試驗(yàn)后，對(duì)3個(gè)試驗(yàn)組分別進(jìn)行肌肉(胸肌)注射0.5、1 和2 mg·kg體重濃度的17β-雌二醇(Sigma，美國)，對(duì)照組注射等劑量17β-雌二醇的溶劑，分別處理12和24 h后，每個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)選8只雞，采集肝組織樣本，放入液氮中冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 雞胚肝原代細(xì)胞培養(yǎng)及雌激素處理

參照改良的Fischer和Marks方法分離和培養(yǎng)雞胚肝原代細(xì)胞。待細(xì)胞融合80%時(shí)，以5×10cells·mL的細(xì)胞密度接種于6孔板中，于 37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右，用無血清培養(yǎng)基替代完全培養(yǎng)基，饑餓處理6 h后替換成完全培養(yǎng)基。對(duì)照組用等量溶劑無水乙醇處理，試驗(yàn)組用溶于無水乙醇的1、50 和100 nmol·L17β-雌二醇分別處理12 h后，收集細(xì)胞，根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果選取最佳雌激素反應(yīng)濃度與雌激素的不同受體拮抗劑MPP(methyl-piperidino-pyrazole，ERα高度選擇拮抗劑)、ICI182780(ERα和 ERβ受體拮抗劑)(Sigma，美國)和Tamoxifen(ERα和ERβ拮抗劑(Sigma，美國)分別組合處理細(xì)胞，等劑量無水乙醇處理細(xì)胞作為對(duì)照，處理12 h，收集細(xì)胞-80 ℃保存，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

參照RNAiso Plus(TaKaRa)試劑盒說明書分別提取組織和細(xì)胞中的總RNA。用NanoDrop2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，RNA OD/OD比值在1.8～2.0之間為合格RNA，等體積稀釋至相同濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)說明書反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MTTPL基因引物設(shè)計(jì)及序列克隆

以GenBank上發(fā)布的雞基因(XM_001232866.4)預(yù)測(cè)序列為模板，利用Primer3.0在線軟件(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)分段克隆引物，序列送上海生物工程科技服務(wù)有限公司合成引物，具體引物序列如表1所示。以反轉(zhuǎn)錄獲得的30周齡雞肝組織cDNA為模板，雞基因分為4段擴(kuò)增，即-1、-2、-3、-4。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：2×pfu MasterMix 12.5 μL, 第一鏈cDNA 體積1 μL，濃度10 μmol·L的上、下游引物各0.5 μL，然后加雙蒸水至總體積25 μL。采用降落PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃預(yù)變性30 s，68 ℃(-1 ℃/每個(gè)循環(huán))退火30 s，72 ℃延伸30 s，18個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒說明書純化回收目的片段PCR產(chǎn)物，回收純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序后的各段序列進(jìn)行拼接，利用DNAMAN對(duì)CDS序列進(jìn)行分析。

表1 克隆引物信息Table 1 Information of primer sequence used for gene clone

1.5 生物信息學(xué)分析

MTTP和vitellogenin(VTG)為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)家族的主要成員，為探討MTTPL與MTTP和VTG的進(jìn)化關(guān)系，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載人、鼠、雞、火雞、草雀、揚(yáng)子鱷、中華龜、蜥蜴、爪蛙、腔棘魚和斑馬魚等物種的MTTPL、MTTP和VTG氨基酸序列，利用Gblock(http://www.phylogeny.fr/one_task.cgi?task_type=gblocks)和MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用SMART 在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)和TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)軟件預(yù)測(cè)雞的MTTPL、MTTP和人MTTP蛋白的結(jié)構(gòu)域。以人MTTP三維結(jié)構(gòu)為比對(duì)模板，利用SWISS MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)和Pymol軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)。

1.6 pcDNA3.1-MTTPL-EGFP重組質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞爬片制作

在上游引物引入保護(hù)堿基、d III內(nèi)酶切位點(diǎn)、kozaka序列、目的基因序列，下游引物引入保護(hù)堿基、R I酶切位點(diǎn)、His標(biāo)簽和目的基因反向互補(bǔ)序列，利用PCR克隆獲得帶有Kozak 序列及His標(biāo)簽的CDS全長序列擴(kuò)增片段，利用內(nèi)切酶雙酶切后用T4連接酶連接至被d III和R I內(nèi)切酶線性化的pcDNA3.1-EGFP載體上，然后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂板后挑選陽性單克隆，經(jīng)PCR鑒定后提取pcDNA3.1-EGFP-MTTPL重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序、雙酶切鑒定后備用。DsRed-λ質(zhì)粒(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送)是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)簽蛋白載體，用以標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

雞LMH細(xì)胞系培養(yǎng)至融合度為80%時(shí)，將酒精浸泡后并燒干的蓋玻片置于6孔板中，將細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度約每孔1～2×10細(xì)胞)滴加在冷卻后的蓋玻片上，搖勻后置37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。再將2 μg pcDNA3.1-MTTPL-EGFP、2 μg DsRed-λ與4 μL lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞系，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，再替換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行細(xì)胞核DAPI染色后，清洗爬片，然后在75%的酒精中浸泡消毒，將酒精燒干，冷卻后在載玻片上滴加10 μL左右的抗熒光淬滅封片液，將爬片輕輕覆蓋在封片液上，將封好的細(xì)胞爬片置于通風(fēng)處晾干，在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行單細(xì)胞成像拍照，進(jìn)行MTTPL亞細(xì)胞定位分析。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)

根據(jù)克隆的基因CDS序列，以及NCBI數(shù)據(jù)庫公布的雞、、的mRNA序列為模板，按照擴(kuò)增片段橫跨至少一個(gè)外顯子的原則設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)引物，引物信息見表2。

表2 熒光定量PCR引物信息Table 2 The primers information for qPCR

實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)采用SYBR Green I染料法，作為內(nèi)參基因，PCR反應(yīng)體系：2×SYBRGreen I PCR mix 5 μL, cDNA模板1 μL，10 μmol·L濃度的上、下游引物分別加0.5 μL，加雙蒸水至總反應(yīng)體積10 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

參考2法計(jì)算基因在組織中的相對(duì)表達(dá)量，即：目的基因相對(duì)表達(dá)量=任意值*2，ΔCt=目的基因平均Ct值-內(nèi)參基因平均Ct值，目的基因相對(duì)表達(dá)量=1 000*2。利用SPSS24.0處理數(shù)據(jù)，采用one-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析。利用Graphpad Prism 9.0作圖，數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示，≤0.05表示差異顯著，≤0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 雞MTTPL CDS克隆及蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析

利用PCR擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)得到1-4片段序列，然后拼接得到CDS區(qū)長度為2 646 bp，可編碼881個(gè)氨基酸殘基，在GenBank數(shù)據(jù)庫中基因注釋號(hào)為KT899704。

根據(jù)CDS序列推測(cè)其蛋白序列，利用軟件預(yù)測(cè)雞MTTPL和MTTP蛋白的三維結(jié)構(gòu)，然后分別與已知的人MTTP蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖1所示，預(yù)測(cè)的雞MTTPL和MTTP蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)與人MTTP三維結(jié)構(gòu)相似度偏差分別為0.090、0.064。功能結(jié)構(gòu)區(qū)域與人MTTP一致，包括C端、中間區(qū)域和N端，且不存在結(jié)構(gòu)變異。

A.雞MTTPL與人MTTP三維結(jié)構(gòu)比對(duì)圖；B.雞MTTP與人MTTP三維結(jié)構(gòu)比對(duì)圖A. Three-dimensional structure comparison between chicken MTTPL and human MTTP；B. Three-dimensional structure comparison between chicken MTTP and human MTTP圖1 雞MTTPL和 MTTP蛋白分別與人MTTP三維結(jié)構(gòu)比對(duì)分析Fig.1 Three-dimensional structure comparisons analysis of chicken MTTPL and MTTP proteins with human MTTP

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用各物種MTTPL、MTTP和VTG氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。采用NJ法，模型選取JTT模型，Bootstrap選擇2 000次重復(fù)。結(jié)果顯示，MTTPL、MTTP和VTG由同一個(gè)祖先進(jìn)化而來，其中MTTPL和MTTP與VTG歸到平行的二個(gè)大分支中，而MTTPL和MTTP歸到兩個(gè)小分支中(圖2)。

圖2 不同物種間MTTPL、MTTP和VTG系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic trees of MTTPL, MTTP and VTG among different species

2.3 雞MTTPL亞細(xì)胞定位

利用內(nèi)切酶d III和R I對(duì)構(gòu)建的pcDNA3.1-MTTPL-EGFP過表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示，酶切后目的片段大小與預(yù)期相一致。然后將過表達(dá)載體與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)簽蛋白質(zhì)粒DsRed-λ共轉(zhuǎn)染雞肝LMH細(xì)胞系后，激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞爬片進(jìn)行單細(xì)胞成像拍照分析(圖4)，結(jié)果顯示MTTPL蛋白在細(xì)胞中的位置與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)簽質(zhì)粒DsRed-λ標(biāo)記的位置融合，表明MTTPL蛋白定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

1.重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物； 2. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的片段長度和對(duì)應(yīng)分子量1. The double enzyme digestion of recombinant plasmid; 2. The fragments length and corresponding molecular weight of DNA marker圖3 pcDNA3.1-MTTPL-EGFP過表達(dá)載體雙酶切凝膠電泳Fig.3 Double enzyme digestion gel electrophoresis of pcDNA3.1-MTTPL-EGFP overexpression vector

A. DsRed-λ標(biāo)記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；B. EGFP標(biāo)記的MTTPL蛋白；C. DAPI標(biāo)記細(xì)胞核；D. A、B、C的融合圖A. Endoplasmic reticulum labeled by DsRed-λ; B. MTTPL protein labeled by EGFP; C. Nucleus labeled by DAPI; D. Merged image of A, B and C images圖4 MTTPL亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of MTTPL

2.4 雞MTTPL和MTTP基因時(shí)空表達(dá)分布

組織表達(dá)結(jié)果顯示(圖5)，雞在肝和腎中相對(duì)高豐度表達(dá)；基因在肝、十二指腸和腎相對(duì)高豐度表達(dá)。在不同周齡雞肝中的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示(圖6)，隨著日齡的增長，和的表達(dá)量顯著上升(<0.05)，而在1日齡、1周齡和10周齡時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)(<0.05)，在10周齡和30周齡之間表達(dá)量無顯著變化(>0.05)。

圖5 MTTPL和MTTP在30周齡雞不同組織中的表達(dá)Fig.5 The expression distribution of MTTPL and MTTP in different tissues of chickens at the age of 30 weeks

不同的小寫字母表示組間差異顯著(P≤0.05)，相同的小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。下同The different lowercase letters mean significant difference between groups (P≤0.05), and the same lowercase letter indicates no significant difference between groups (P>0.05). The same as below圖6 MTTPL和MTTP在不同生長期雞肝中的表達(dá)規(guī)律Fig.6 The spatio-temporal expression of MTTPL and MTTP in liver tissue of chickens

2.5 雌激素對(duì)雞肝MTTPL和MTTP表達(dá)的影響

不同濃度17β-雌二醇處理10周齡青年母雞12 和24 h后，采集肝組織，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR分析顯示，與對(duì)照組相比，雌激素處理12和24 h后均顯著上調(diào)雞肝組織雌激素應(yīng)答基因mRNA的表達(dá)水平(<0.05)，且這種上調(diào)表達(dá)呈17β-雌二醇劑量依賴性(圖7A、7B)；mRNA表達(dá)的雌激素調(diào)控模式與的雌激素應(yīng)答模式相同(圖7C、7D)；17β-雌二醇處理12 h后，0.5和1 mg·kg濃度處理下，的表達(dá)量沒有顯著變化(>0.05)，2 mg·kg濃度時(shí)可顯著抑制的表達(dá)(<0.05)。17β-雌二醇處理24 h后，的表達(dá)量在0.5 mg·kg濃度處理時(shí)無顯著變化(>0.05)，而在1和2 mg·kg濃度的17β-雌二醇作用下顯著下調(diào)(<0.05，圖7E、7F)。

A, C, E.表示17β-雌二醇處理雞12 h后；B, D, F.表示17β-雌二醇處理雞24 hA, C, E. Chickens treated with 17β-estradiol for 12 h; B, D, F. Chickens treated with 17β-estradiol for 24 h圖7 不同濃度雌激素處理對(duì)雞肝ApoB、MTTPL和MTTP基因表達(dá)的影響Fig.7 The effects of different concentrations estrogen on ApoB, MTTPL and MTTP expression in chicken liver

2.6 雌激素處理雞胚肝原代細(xì)胞對(duì)MTTPL和MTTP的影響

不同濃度的17β-雌二醇處理雞胚肝原代細(xì)胞12 h后，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用qPCR檢測(cè)、和的表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖8)，與對(duì)照組相比，50 和100 nmol·L的17β-雌二醇可顯著上調(diào)的表達(dá)量(<0.05)；不同濃度的17β-雌二醇處理后均可顯著上調(diào)的表達(dá)量(<0.05)，而的表達(dá)沒有顯著變化(>0.05)。

圖8 雌激素對(duì)雞胚肝原代細(xì)胞MTTPL和MTTP表達(dá)的影響Fig.8 Effects of estrogen on the expression of MTTPL and MTTP in chicken embryo primary hepatocytes

2.7 雌激素調(diào)控雞MTTPL表達(dá)的作用途徑

利用不同類型的雌激素受體拮抗劑與100 nmol·L雌激素共轉(zhuǎn)染雞胚肝原代細(xì)胞，利用qPCR分析各組基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(圖9)，與對(duì)照組相比，雌激素單獨(dú)處理時(shí)，的表達(dá)量顯著升高 (<0.05)。與雌激素處理組相比，雌激素與ERα受體的高度選擇性拮抗劑MPP共處理組的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(<0.05)，與對(duì)照組相比無顯著差異(>0.05)，說明阻斷ERα抗體可抑制雌激素對(duì)的調(diào)控作用。與MPP和雌激素共處理組相比，雌激素與ERα和ERβ受體的共同拮抗劑ICI182780和Tamoxifen分別共處理細(xì)胞時(shí)，的相對(duì)表達(dá)量均沒有發(fā)生顯著變化(>0.05)，表明同時(shí)阻斷ERα和ERβ受體相對(duì)于僅阻斷ERα?xí)r，的表達(dá)量沒有發(fā)生顯著變化(>0.05)，說明雌激素對(duì)表達(dá)的調(diào)控主要通過ERα介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。

Control.對(duì)照組； E2.17β-雌二醇；MPP+E2.ERα拮抗劑MPP和17β-雌二醇共處理細(xì)胞；ICI+E2.ERα和ERβ拮抗劑ICI182780和17β-雌二醇共處理細(xì)胞；TAM+E2.ERα和ERβ拮抗劑GPR30興奮劑Tamoxifen和17β-雌二醇共處理細(xì)胞Control. The control group; E2. 17β-estradiol; MPP+E2. The antagonist of ERα MPP and 17β-estradiol co-treated cells; ICI+E2. The antagonist of ERα and ERβ ICI182780 and 17β-estradiol co-treated cells; TAM+E2. The antagonist of ERα and ERβ and GPR30 stimulant Tamoxifen and 17β-estradiol co-treated cells圖9 雌激素不同受體拮抗劑對(duì)雞MTTPL表達(dá)的影響Fig.9 Effects of estrogen receptor antagonists on expression of chicken MTTPL

3 討 論

本研究克隆了雞基因CDS，全長序列2 646 bp，可編碼881個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)MTTPL與VTG和MTTP同源。VTG、MTTP和ApoB是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的主要成員，具有脂質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。暗示MTTPL可能是LLTPs家族的新成員之一，且具有LLTPs家族成員類似的生物學(xué)功能。相關(guān)研究表明，人MTTPα亞基具有漏斗狀的脂質(zhì)結(jié)合腔，脂質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)被包圍在由MTTPα C端結(jié)構(gòu)域的2個(gè)β折疊形成的β-夾層里。雞MTTPL和MTTP三維結(jié)構(gòu)與人MTTPα亞基三維結(jié)構(gòu)相似度偏差都較小，功能結(jié)構(gòu)區(qū)域都包括C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)域、α螺旋結(jié)構(gòu)和N端β折疊結(jié)構(gòu)，且不存在結(jié)構(gòu)變異。同時(shí)雞MTTPL定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，與人MTTP細(xì)胞定位相同。綜上分析，暗示MTTPL可能具有與人MTTP相似的生物學(xué)功能。

研究表明，哺乳動(dòng)物MTTP是一種將磷脂和三?；视娃D(zhuǎn)移到新生ApoB中用于組裝VLDL必不可少的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白，在肝主要參與富含ApoB脂蛋白的組裝和分泌。肝作為雞脂質(zhì)代謝的重要器官，產(chǎn)蛋期肝合成大量的脂肪酸經(jīng)組裝形成VLDL經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)娇焖偕L的卵泡中沉積形成卵黃。和都在肝中高豐度表達(dá)，與10周齡雞相比，在產(chǎn)蛋高峰期雞肝中表達(dá)量無顯著變化，而的表達(dá)量顯著上調(diào)，暗示MTTPL可能在雞肝脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。

雞產(chǎn)蛋期肝VLDL的形成受雌激素調(diào)控，雌激素可促進(jìn)雞肝中ApoB及其他卵黃前體物的合成。研究報(bào)道，鳥類對(duì)內(nèi)源性或外源性雌激素都非常敏感，這一現(xiàn)象可能與雌性卵黃發(fā)生過程中對(duì)脂質(zhì)合成的需求有關(guān)。不同劑量雌激素肌肉注射青年雞(10周齡)，血清中TG、TC和VLDL濃度均顯著升高。無論在體試驗(yàn)還是離體試驗(yàn)，用雌激素處理后，肝內(nèi)和肝原代細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量都顯著升高，與的表達(dá)變化一致，而的表達(dá)量無顯著變化。前期的有關(guān)研究也表明，雞不受雌激素調(diào)控，可能不是肝脂質(zhì)代謝的必需脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?？梢?，基因可能在雞肝脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。雌激素主要通過雌激素受體(ER)發(fā)揮生物學(xué)功能，ER主要包括核受體ERα和ERβ。特異性拮抗劑能夠阻斷雌激素受體的作用，從而抑制雌激素對(duì)靶基因的調(diào)控。本研究中，雌激素可顯著上調(diào)的表達(dá)，當(dāng)阻斷ERα?xí)r，的表達(dá)水平顯著下降，同時(shí)阻斷ERα和ERβ與僅阻斷ERα相比，的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。這表明雌激素主要通過與ERα受體結(jié)合調(diào)控的表達(dá)。綜上分析表明，雞產(chǎn)蛋期在雌激素的誘導(dǎo)下，可能在肝脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的作用，但其生物學(xué)功能還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，雞MTTPL位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，與人和雞MTTP擁有共同的祖先，且具有與人MTTP相似的功能結(jié)構(gòu)域；和均在肝中相對(duì)高表達(dá)，在產(chǎn)蛋期雞肝的表達(dá)顯著高于產(chǎn)蛋前期，而無顯著變化。雌激素可通過與ERα受體結(jié)合調(diào)控雞的表達(dá)，而不受雌激素調(diào)控。表明可能在雞產(chǎn)蛋期肝脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。