郭玉龍，職毅豪，李欣妍，董佳佳，李轉(zhuǎn)見(jiàn),2,3，田亞?wèn)|,2,3，李 紅,2,3，劉小軍,2,3*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州 450046； 2.河南省雞種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450046； 3.河南省家禽育種國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

DNA甲基化是指DNA序列上特定的堿基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的催化作用下，通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合的方式獲得一個(gè)甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾過(guò)程。其中CpG二核苷酸中胞嘧啶(C)上第5位碳原子的甲基化(5 mC)是動(dòng)、植物等真核生物DNA甲基化的主要形式?；蛱囟üδ茉募谆瘯?huì)抑制基因表達(dá)，去甲基化則可以使得基因重新表達(dá)。研究表明，DNA甲基化參與諸多生物學(xué)過(guò)程，包括基因印跡、X染色體的失活、基因組穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)座子及逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子沉默及組織特異性基因沉默等。

肝是動(dòng)物體內(nèi)重要的代謝器官，在脂類分解、合成及運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中均發(fā)揮重要作用。已有的研究表明，DNA甲基化是哺乳動(dòng)物肝脂質(zhì)代謝的重要調(diào)控機(jī)制之一。高脂飲食(HFD)飼喂的小鼠，其肝促炎性半胱天冬酶(1)基因和與能量代謝相關(guān)的NADH脫氫酶1β亞基復(fù)合物9(9)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平分別顯著降低和升高，從而改變了各自的表達(dá)水平。高脂肪蔗糖(HFS)飲食可誘導(dǎo)大鼠肝脂質(zhì)積累，但如果在高脂肪蔗糖飲食中補(bǔ)充甲基供體，會(huì)影響小鼠肝脂肪酸合成酶()基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平，進(jìn)而預(yù)防高脂肪蔗糖飲食誘導(dǎo)的肝甘油三酯積累。然而，在一些特定的生理過(guò)程中，肝基因表達(dá)水平的變化與其甲基化水平并無(wú)必然的聯(lián)系。低劑量(1.5 μg·kg)丙二酚S(BPS)處理小鼠可導(dǎo)致其肝374個(gè)基因表達(dá)水平顯著變化，同時(shí)引起58.5%的不同甲基化區(qū)域(DMR)發(fā)生低甲基化。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，包括涉及脂質(zhì)代謝途徑的4個(gè)基因(、、6、1)在內(nèi)的18個(gè)基因的表達(dá)水平受甲基化狀態(tài)影響，但并未發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)譜和甲基化譜之間存在顯著的關(guān)聯(lián)?？梢?jiàn)，DNA甲基化并不是影響基因轉(zhuǎn)錄的唯一表觀遺傳修飾途徑，還受到其他表觀遺傳修飾的影響。

與哺乳動(dòng)物相比，雞肝在脂質(zhì)代謝過(guò)程中的作用更為重要，超過(guò)90%脂肪酸的從頭合成在肝中進(jìn)行。尤其在產(chǎn)蛋期，在雌激素等生殖激素的協(xié)同作用下，肝脂質(zhì)代謝會(huì)更加旺盛，合成大量的甘油三酯、膽固醇和其他脂類，并組裝為極低密度脂蛋白，然后通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)缴L(zhǎng)中的卵母細(xì)胞用于蛋黃的形成。本研究對(duì)產(chǎn)蛋前期(20周齡)和產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)雞肝轉(zhuǎn)錄組的比較分析表明，與產(chǎn)蛋前期相比，2 567個(gè)基因的表達(dá)水平在產(chǎn)蛋高峰期發(fā)生了顯著的變化，這些差異表達(dá)基因主要富集于脂質(zhì)代謝生物學(xué)過(guò)程和代謝通路。但這些基因的表達(dá)差異是否與基因組甲基化修飾的改變有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

本研究利用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序法(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)分析產(chǎn)蛋前期(20周齡)及產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)盧氏綠殼蛋母雞基因組甲基化模式，結(jié)合肝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探討兩個(gè)生理階段基因組甲基化與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)系，為深入研究蛋雞不同生理階段肝代謝的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集

試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集方法參照文獻(xiàn)[12]。以河南農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽種質(zhì)資源場(chǎng)飼養(yǎng)的地方品種盧氏綠殼蛋雞為試驗(yàn)材料，所有試驗(yàn)雞飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，自由采食和飲水。根據(jù)盧氏綠殼蛋雞開(kāi)產(chǎn)日齡及產(chǎn)蛋曲線分析，平均21周齡開(kāi)始產(chǎn)蛋，28～32周齡達(dá)到產(chǎn)蛋高峰。因此，選取產(chǎn)蛋前期(20周齡)及產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)健康盧氏綠殼蛋母雞各3只，頸部靜脈放血處死后，迅速采集肝組織樣品，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 肝全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序(WGBS)

1.2.1 DNA提取及樣品檢測(cè) 利用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-氯仿法提取基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度，Nanodrop(Life Technologies，美國(guó))檢測(cè)DNA的純度(OD/OD比值)，Qubit 2.0(Life Technologies，美國(guó))檢測(cè)DNA濃度。

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建 基因組DNA檢測(cè)合格后，分別將產(chǎn)蛋前期及產(chǎn)蛋高峰期3個(gè)個(gè)體的DNA樣品等量混合，加入24 ng陰性對(duì)照(λDNA)，使用Covaris S220(Covaris，美國(guó))將基因組DNA隨機(jī)打斷至200～300 bp；對(duì)打斷后的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾，并連接上所有胞嘧啶均經(jīng)過(guò)甲基化修飾的測(cè)序接頭；隨后進(jìn)行Bisulfite處理(EZ DNA Methylation Gold Kit，Zymo Research)。未發(fā)生甲基化的C變成U(PCR擴(kuò)增后變?yōu)門)，而甲基化的C保持不變，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到最終的DNA文庫(kù)。

1.2.3 文庫(kù)質(zhì)檢 文庫(kù)構(gòu)建完成后，將DNA濃度稀釋至1 ng·μL，隨后使用Agilent 2100(Agilent，美國(guó))對(duì)文庫(kù)的插入片段長(zhǎng)度進(jìn)行檢測(cè)，符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度>2 nmol·L)，以保證文庫(kù)質(zhì)量。

1.2.4 上機(jī)測(cè)序 庫(kù)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行Hiseq測(cè)序，測(cè)序方式為雙末端測(cè)序，由Novogene(北京)完成測(cè)序。

1.3 全基因組甲基化測(cè)序數(shù)據(jù)分析

1.3.1 參考序列比對(duì)分析 參照Bolger等的方法對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，然后利用Bismark軟件(version 0.16.1)將測(cè)序的結(jié)果和參考基因組都進(jìn)行了C→T和G→A(反向互補(bǔ))的轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后的測(cè)序結(jié)果和基因組分別進(jìn)行兩兩比對(duì)，計(jì)算并輸出每個(gè)樣品比對(duì)率和Bisulfite(BS)轉(zhuǎn)化率等結(jié)果。

1.3.2 測(cè)序深度統(tǒng)計(jì)、覆蓋度和胞嘧啶甲基化(mC)分析 每個(gè)堿基位點(diǎn)比對(duì)到染色體上的讀數(shù)即為該位點(diǎn)的測(cè)序深度，并對(duì)基因組上每個(gè)單堿基位點(diǎn)的覆蓋深度(即支持該位點(diǎn)的reads數(shù))進(jìn)行計(jì)算，據(jù)此得到覆蓋度統(tǒng)計(jì)結(jié)果。計(jì)算CG、CHH、CHG(H代表A、C或T堿基)3種序列環(huán)境下C位點(diǎn)的測(cè)序深度。單個(gè)位點(diǎn)甲基化水平計(jì)算公式：?jiǎn)蝹€(gè)位點(diǎn)甲基化水平=(覆蓋到mC的序列數(shù)/有效覆蓋序列總數(shù))×100。

1.3.3 差異甲基化區(qū)域(DMR)分析 針對(duì)無(wú)生物學(xué)重復(fù)的試驗(yàn)，采用swDMR軟件(http://122.228.158.106/swDMR/)鑒定差異甲基化區(qū)域(differentially methylated region，DMR)。該軟件基于每個(gè)位點(diǎn)的甲基化信息(設(shè)定reads coverage≥5)，采取滑窗的方法在基因組上掃描，鑒定出甲基化程度存在差異的區(qū)域?；贒MR的重要生物學(xué)意義，利用DMR所在的基因組位置與基因組結(jié)構(gòu)注釋信息，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)注釋。不同區(qū)域發(fā)生甲基化其調(diào)控基因表達(dá)的方式有所區(qū)別，統(tǒng)計(jì)不同功能區(qū)域DMR的數(shù)量。為了更好地了解DNA甲基化與基因表達(dá)之間的關(guān)系，將基因組劃分為幾個(gè)功能區(qū)域，即啟動(dòng)子(promoter，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)上游2 kb區(qū)域)，基因體(gene body，5′非翻譯區(qū)(5′UTR)、外顯子(exon)、內(nèi)含子(intron)和3′非翻譯區(qū)(3′UTR))和重復(fù)序列(repeat，轉(zhuǎn)座子和其他重復(fù)元件)。

1.3.4 差異甲基化基因(differentially methylated gene，DMG)的GO和KEGG富集分析 當(dāng)DMR所在區(qū)域與特定基因功能元件有重疊時(shí)，將相應(yīng)的基因挑選出來(lái)，稱為DMR相關(guān)基因(DMGs)。利用GOseq R軟件包對(duì)DMGs進(jìn)行基因本體(GO)富集分析，并對(duì)基因長(zhǎng)度偏差進(jìn)行校正，校正后<0.05的GO是DMGs顯著富集項(xiàng)。進(jìn)一步使用KOBAS軟件檢驗(yàn)在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路中顯著富集的DMGs。

1.3.5 WGBS和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)數(shù)據(jù)整合分析 將與WGBS同一批次的盧氏綠殼蛋雞產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原始數(shù)據(jù)已上傳國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)，登記號(hào)為GSE70010。對(duì)產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期差異表達(dá)基因CG、CHG和CHH序列環(huán)境下C位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)量的上下四分位數(shù)將基因分為4組：none(FPKM<1)；low(1上四分位數(shù))，默認(rèn)選取FPKM≥1作為基因是否表達(dá)的閾值，分析不同基因表達(dá)水平和甲基化水平的相關(guān)性，繪制折線圖?；虻募谆桨凑諉?dòng)子(promoter)和基因體(gene body)兩種方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析每個(gè)基因的啟動(dòng)子和基因體區(qū)甲基化水平和基因表達(dá)水平的相關(guān)性，繪制箱式圖。將基因的甲基化水平值以20%為梯度，按照甲基化水平值大小(甲基化水平值>0)分為5個(gè)組別：第一組(1 st group)、第二組(2nd group)、第三組(3rd group)、第四組(4th group)及第五組(5th group)。其中，第一組(1 st group)代表甲基化水平最低，第五組(5th group)代表甲基化水平最高，基因沒(méi)有發(fā)生(未)甲基化(unmethylated)代表甲基化水平為0單獨(dú)歸為一組。分析不同甲基化水平和基因表達(dá)水平的相關(guān)性，繪制折線圖。將DMGs與DEGs進(jìn)行整合，分析基因甲基化不同功能區(qū)域與基因表達(dá)的聯(lián)系，篩選與肝脂質(zhì)代謝相關(guān)的候選基因。

2 結(jié) 果

2.1 雞肝全基因組甲基化測(cè)序結(jié)果與雞參考基因組序列比對(duì)分析

產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期盧氏綠殼蛋雞全基因組甲基化測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，平均每個(gè)樣品產(chǎn)出過(guò)濾后數(shù)據(jù)36.39 Gb，平均每個(gè)樣品得到95 572 532條唯一比對(duì)序列，平均唯一比對(duì)率為73.51%，平均BS轉(zhuǎn)化率為99.84%，≥10×平均覆蓋率為73.50%(表1)。

表1 測(cè)序結(jié)果與參考基因組比對(duì)情況Table 1 The comparison of reads to the reference genome

2.2 雞肝全基因組DNA甲基化概況

2.2.1 雞肝全基因組甲基化水平分析 產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期兩個(gè)生理時(shí)期盧氏雞肝全基因組范圍內(nèi)約有4%的胞嘧啶(C)被甲基化(mC)。根據(jù)胞嘧啶(C)序列特征可以將其分為CG、CHH和CHG(H代表A、T或C堿基)3種序列環(huán)境，C位點(diǎn)甲基化主要發(fā)生在CG序列環(huán)境，其次是CHG和CHH(圖1A)。產(chǎn)蛋高峰期mCG百分比(71.40%)要高于產(chǎn)蛋前期(67.73%)，在CHH和CHG序列環(huán)境下，C甲基化比例較低，產(chǎn)蛋前期mCHG和mCHH占比分別為9.39%、22.88%，產(chǎn)蛋高峰期mCHG、mCHH占比分別為7.98%、20.61%(圖1B)。

A.整個(gè)基因組中CG、CHG和CHH的平均甲基化水平；B.不同生理階段的不同序列環(huán)境(CG、CHG和CHH)胞嘧啶甲基化百分比A. Average methylation levels of CG, CHG and CHH in the whole genome; B. The proportion of mCG, mCHH and mCHG in different physiological stages圖1 產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期雞全基因組DNA甲基化模式Fig.1 Genome-wide DNA methylation patterns of hens at pre-laying and peak-laying stages

2.2.2 雞全基因組功能區(qū)域甲基化水平分析 為了更好地理解基因外顯子、內(nèi)含子、3′ UTR、5′ UTR和重復(fù)序列，將每個(gè)基因的各個(gè)功能區(qū)域分別等分成20個(gè)單位長(zhǎng)度，然后對(duì)所有的功能元件區(qū)域相應(yīng)單位長(zhǎng)度C位點(diǎn)甲基化水平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖2)。結(jié)果表明，兩生理時(shí)期不同基因功能元件在CG、CHG和CHH 3種序列環(huán)境下的甲基化水平變化趨勢(shì)一致。DNA甲基化水平在啟動(dòng)子區(qū)域周圍呈現(xiàn)“V”型趨勢(shì)，向基因體區(qū)域上升；同一生理時(shí)期不同基因功能元件的甲基化水平存在差異，外顯子、內(nèi)含子、3′ UTR和重復(fù)序列甲基化水平較高，啟動(dòng)子和5′ UTR的甲基化程度較低。

將每個(gè)基因的各個(gè)功能區(qū)域分別等分成20個(gè)單位長(zhǎng)度，再計(jì)算每個(gè)單位長(zhǎng)度的甲基化水平求平均值繪制成折線圖。橫坐標(biāo)代表不同的基因組功能元件，縱坐標(biāo)為不同序列環(huán)境下各個(gè)功能元件的甲基化水平Each element of each gene was divided into 20 bins and the average of all bins in each gene element was obtained. The abscissa represent different gene elements, and the ordinate represent methylation levels of elements in different sequence contexts圖2 甲基化水平在不同基因組功能元件上的分布Fig.2 Methylation levels of various functional regions of gene

2.3 雞肝全基因組差異甲基化區(qū)域(DMR)分析

DMR分析顯示，與產(chǎn)蛋前期相比，產(chǎn)蛋高峰期盧氏綠殼蛋雞全基因組中有670個(gè)DMRs，其中，405個(gè)超甲基化區(qū)域，265個(gè)低甲基化區(qū)域(圖3A)。重復(fù)序列及內(nèi)含子區(qū)域在DMRs占主導(dǎo)地位，超甲基化區(qū)域數(shù)量分別為300及174個(gè)，低甲基化區(qū)域數(shù)量分別為122及125個(gè)(圖3B)。通過(guò)對(duì)670個(gè)DMRs分析，共鑒定到356個(gè)有注釋的差異甲基化基因(DMGs)，其中超甲基化211個(gè)，低甲基化153個(gè)(同一基因不同功能元件可能發(fā)生不同的甲基化)(圖3C)。

A.不同比較組DMR火山圖：橫坐標(biāo)代表甲基化水平差異，縱坐標(biāo)代表DMR差異顯著性；B.DMR結(jié)構(gòu)注釋：橫坐標(biāo)代表不同功能區(qū)域，縱坐標(biāo)代表處在不同功能區(qū)域DMR所占的數(shù)量；C.全基因組甲基化測(cè)序確定的差異甲基化基因(DMGs)的數(shù)量A. DMR volcano plot for different comparison groups: The abscissa represent differences in methylation levels, and the ordinate represent significant differences in DMR; B. DMR structure notes: The abscissa represent different functional areas, and the ordinate represent the number of DMR in different functional areas; C. The number of differentially methylated genes (DMGs) as determined by WGBS圖3 差異甲基化區(qū)域分析Fig.3 The analysis of differentially methylated regions

2.4 雞肝差異甲基化基因(DMG)功能富集分析

DMGs的GO富集分析表明，超甲基化DMGs主要富集于發(fā)育的正向調(diào)控及細(xì)胞形態(tài)改變的調(diào)控等過(guò)程(<0.05)，而低甲基化DMGs主要富集于胚胎消化道形態(tài)的發(fā)生、間充質(zhì)細(xì)胞增殖的正向調(diào)控(<0.05,圖4A、B)。KEGG通路分析表明，超甲基化DMGs主要參與VEGF信號(hào)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控、黏著斑及間隙連接等生物學(xué)通路(<0.05)，而低甲基化DMGs主要參與淀粉和蔗糖代謝及Wnt信號(hào)等生物學(xué)通路(<0.05，圖5A、B)。

縱坐標(biāo)代表GO條目；橫坐標(biāo)代表基因數(shù)量。柱子長(zhǎng)度代表通路的基因數(shù)，柱子越長(zhǎng)，基因數(shù)越多。不同顏色代表P值，顏色越紅，P值越小The ordinate represent the GO terms, the abscissa represent the number of genes. The length of column represent the number of genes contained in the particular class, the longer the column indicate the more genes. Different colors represent P value, the redder the color, the smaller the P value圖4 GO富集分類柱狀圖Fig.4 GO enrichment classification histogram

縱坐標(biāo)代表KEGG通路；橫坐標(biāo)代表富集因子。圈的大小代表通路的基因數(shù)，圈越大，基因數(shù)越多。不同顏色代表-lg (P-value)，顏色越紅，-lg (P-value) 越大The ordinate represents the KEGG pathways and the abscissa represents the rich factor. The size of circles represent the number of genes contained in the particular class, the larger the circle indicate the more genes. The different colors represent the -lg (P-value), the redder the circles indicate the higher -lg (P-value)圖5 KEGG富集氣泡圖Fig.5 KEGG enrichment bubble chart

2.5 WGBS和RNA-seq數(shù)據(jù)整合分析

2.5.1 雞肝全基因組甲基化與基因表達(dá)關(guān)聯(lián)分析 為了研究DNA不同區(qū)域甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)之間的關(guān)系，將甲基化數(shù)據(jù)與本課題組先前發(fā)表的肝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析。

結(jié)果表明，兩個(gè)時(shí)期雞肝啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平均與基因表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)(產(chǎn)蛋前期：r=-0.56，=5.14×10；產(chǎn)蛋高峰期：r=-0.48，=1.12×10)，基因體(gene body)甲基化水平也與基因表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)(產(chǎn)蛋初期：r=-0.78，=3.55×10；產(chǎn)蛋高峰期：r=-0.68，=6.89×10)；隨著甲基化水平降低(5th group～unmethylated)，基因表達(dá)水平也會(huì)相應(yīng)升高(圖6A、B)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CG序列環(huán)境下，甲基化水平越低基因表達(dá)水平越高，特別是甲基化發(fā)生在啟動(dòng)子、外顯子及5′ UTR區(qū)域時(shí)，但在3′ UTR和內(nèi)含子處甲基化水平與基因表達(dá)水平無(wú)明顯關(guān)系。在CHG和CHH序列環(huán)境下也觀察到相似結(jié)果(圖6C、D)。產(chǎn)蛋前期與產(chǎn)蛋高峰期結(jié)果一致。

A.20周齡甲基化水平組別下的基因表達(dá)水平分布圖，基因甲基化水平和表達(dá)水平分布盒形圖；C.20周齡在不同區(qū)域的甲基化水平分布圖，橫坐標(biāo)代表基因功能區(qū)域(gene body)；縱坐標(biāo)代表不同序列環(huán)境下C位點(diǎn)的甲基化水平，以不同顏色區(qū)分不同的表達(dá)水平分組；B、D.30周齡同A、CA. Distribution of gene expression levels under methylation level groups in 20 weeks, the box plots of gene methylation levels and expression level distribution; C. Methylation level distribution of whole genome in 20 weeks, the abscissa represents the functional region of the gene (gene body), the ordinate represent methylation levels of C sites in different sequence environments, with different colors to distinguish different expression level groups; B, D. The same as the A, C in 30 weeks, respectively圖6 甲基化水平與基因表達(dá)水平分析Fig.6 Analysis of methylation levels and gene expression levels

2.5.2 DMG與DEG共有基因篩選 前期對(duì)盧氏雞產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期肝轉(zhuǎn)錄組的研究表明，與產(chǎn)蛋前期相比，產(chǎn)蛋高峰期有2 567個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，包括1 082個(gè)上調(diào)基因及1 485個(gè)下調(diào)基因。

將全基因組甲基化數(shù)據(jù)中超甲基化基因及低甲基化基因分別與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中下調(diào)表達(dá)、上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行整合分析發(fā)現(xiàn)，交集中共有8個(gè)超甲基化表達(dá)下調(diào)的DMGs(DEGs)，9個(gè)低甲基化表達(dá)上調(diào)的DMGs(DEGs)(圖7A、B)。其中4個(gè)與肝脂質(zhì)代謝相關(guān)基因(即1、1、2O、3)的表達(dá)水平受到甲基化調(diào)控(表2)。

圖7 肝DMGs和DEGs分析Fig.7 Analysis of DMGs and DEGs in liver

表2 雞肝異甲基化基因與差異表達(dá)共有基因信息Table 2 The genes information shared by DMGs and DEGs in chicken liver

3 討 論

DNA甲基化作為重要的表觀遺傳修飾之一，在哺乳動(dòng)物肝發(fā)育及脂質(zhì)代謝調(diào)控等生理過(guò)程的研究較多，但在家禽，尤其是在蛋雞不同生理時(shí)期肝全基因組甲基化方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用WGBS對(duì)盧氏綠殼母雞不同生理階段肝全基因組甲基化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，比較分析了產(chǎn)蛋前期與產(chǎn)蛋高峰期盧氏綠殼母雞肝全基因組甲基化差異及其與轉(zhuǎn)錄之間的聯(lián)系，進(jìn)一步加深了對(duì)產(chǎn)蛋期雞肝代謝的表觀調(diào)控機(jī)制的理解。

總體而言，產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期全基因組胞嘧啶(C)甲基化(mC)率分別為4.08%和3.82%，兩生理階段甲基化水平差異不顯著。在CG、CHH和CHG 3種序列環(huán)境中，CG序列環(huán)境中C甲基化率最高。同時(shí)，雞基因組中甲基化水平在TSS之前急劇下降，而向基因體內(nèi)區(qū)域上升，這與前人研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，雞基因組中>75%的DMR位于內(nèi)含子及重復(fù)序列區(qū)域，而位于基因5′UTR、3′UTR和啟動(dòng)子區(qū)域的DMR較少，這與在人上的研究結(jié)果相似。內(nèi)含子區(qū)域及重復(fù)序列區(qū)域甲基化的生物學(xué)功能和生理意義還有待進(jìn)一步研究，以闡明雞肝代謝復(fù)雜的表觀調(diào)控機(jī)制。

此外，機(jī)體可通過(guò)改變基因組甲基化狀態(tài)調(diào)控基因的表達(dá)，以適應(yīng)不同的生理和病理?xiàng)l件。本研究中，雖然兩個(gè)不同生理時(shí)期雞基因組DMGs均富集在與生長(zhǎng)發(fā)育及維持細(xì)胞基本功能有關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，但超甲基化DMGs主要參與VEGF信號(hào)、肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、黏著斑及間隙連接等生物學(xué)通路，而低甲基化DMGs主要參與淀粉和蔗糖代謝及Wnt等生物學(xué)通路。而淀粉和蔗糖代謝與肝脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，R-spndin(RSPO)能夠與LGR4/5跨膜受體相互作用激活Wnt/β-catenin通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)肝發(fā)育以及參與代謝過(guò)程?？梢?jiàn)，在不同生理階段，可通過(guò)基因組中甲基化水平的變化調(diào)控肝中相關(guān)基因的功能，以滿足生理需要。

眾所周知，DNA甲基化的主要遺傳效應(yīng)是基因沉默，但甲基化位點(diǎn)在基因中的位置與其效應(yīng)密切相關(guān)。本研究通過(guò)對(duì)DNA甲基化圖譜與RNA-seq數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，確定了功能區(qū)域相關(guān)DNA甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系，啟動(dòng)子及基因體區(qū)域甲基化與基因表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)，這與已有的研究結(jié)果一致?；騿?dòng)子區(qū)域的甲基化可抑制基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，基因體甲基化可能通過(guò)延緩RNA聚合酶Ⅱ的速度導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄延伸的速率延緩來(lái)影響基因表達(dá)水平。也有研究表明，人腦細(xì)胞及山羊皮膚組織中基因體甲基化與基因表達(dá)的變化無(wú)關(guān)，甲基化和表達(dá)的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受多種因素影響。本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋高峰期與產(chǎn)蛋前期母雞肝轉(zhuǎn)錄組相比，有2 567個(gè)DEGs，包括1 082個(gè)上調(diào)基因及1 485個(gè)下調(diào)基因，但只有17個(gè)DEGs受到甲基化水平變化的影響?？梢?jiàn)，基因組甲基化在產(chǎn)蛋高峰期母雞肝轉(zhuǎn)錄組顯著變化過(guò)程中并不起主要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)受到基因組甲基化的調(diào)控。其中HAO1是肝特有的一種具有高脂肪酸氧化酶活性的過(guò)氧化物酶，該基因的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肝代謝紊亂，進(jìn)而促使脂肪肝的形成。而2O基因敲除小鼠對(duì)胰島素敏感性增加，血漿總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)和低密度脂蛋白(LDL)水平降低；同時(shí)，該基因還參與調(diào)控細(xì)胞脂質(zhì)的形成。3參與多種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，其作用之一就是參與骨化和脂肪沉積，直接調(diào)節(jié)動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育。1受雌激素調(diào)控參與各種細(xì)胞過(guò)程(如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化等)，參與雞生殖系統(tǒng)發(fā)育，對(duì)雞生產(chǎn)性能有重要作用。這些基因在盧氏雞產(chǎn)蛋高峰期的甲基化水平均顯著降低，且表達(dá)水平均顯著上調(diào)，從而促進(jìn)產(chǎn)蛋高峰期肝脂質(zhì)代謝。

4 結(jié) 論

本研究利用WGBS測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了盧氏綠殼蛋雞肝全基因組甲基化圖譜，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，通過(guò)比較產(chǎn)蛋前期(20周齡)及產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)的DMRs，鑒定到356個(gè)差異甲基化基因(DMGs)，闡述了DNA甲基化在基因表達(dá)方面的調(diào)控作用，篩選到4個(gè)受甲基化調(diào)控參與肝脂質(zhì)代謝的基因。該研究結(jié)果有助于了解全基因組甲基化在蛋雞不同生理階段肝代謝的表觀遺傳機(jī)制。