孟祥光 譯自，Vol.287(2020)，10月

王祎汀 校 潘雪男 審 張濤 制圖

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是一種病毒性、出血性疾病，對家豬和歐亞野豬具有極高的致死率。盡管引發(fā)該病的病毒非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的宿主范圍有限，也不可能引發(fā)人畜共患病，但其對社會、經(jīng)濟(jì)的影響巨大，許多利益相關(guān)者都被牽涉其中。出于這個原因，一旦豬群暴發(fā)該病，發(fā)病地所在行政管理部門應(yīng)向世界動物衛(wèi)生組織(Word Oranisation for Animal Health，OIE)通報。在最壞的情況下，ASF 會涉及到家豬、野生動物的病毒貯藏宿主(即野豬)、無生命的寄生體(如豬的尸體、被污染的棲息地、畜牧生產(chǎn)工具、其他機(jī)械載體)以及活的節(jié)肢動物載體(如軟蜱)。非洲豬瘟控制仍依賴于嚴(yán)格的衛(wèi)生措施，因為目前既沒有獲得許可的疫苗，也沒有任何有效的治療方法。

2007 年，起源于撒哈拉以南非洲森林循環(huán)(sylvatic cycle)中的ASF 傳入格魯吉亞，隨后跨高加索地區(qū)侵入俄羅斯。該病毒進(jìn)一步傳播，在2014 年傳入歐盟。2018 年8 月，ASFV 傳入世界上最大的生豬生產(chǎn)國——中國，目前該病毒正在亞洲一些國家或地區(qū)的豬群中蔓延。最近受影響的國家是澳大利亞和與之相鄰的巴布亞新幾內(nèi)亞，以及2020 年暴發(fā)ASF的印度。因此，在過去的13 年，ASF 發(fā)生了空前絕后的傳播，并得到了各國或各地行業(yè)管理部門空前重視，目前的大流行甚至影響到了毫不相關(guān)的行業(yè)。亞洲的非洲豬瘟疫情暴露了當(dāng)?shù)孬F醫(yī)和農(nóng)業(yè)行政管理部門在防控方面的弱點，也暴露了養(yǎng)豬業(yè)與副產(chǎn)品回收使用之間的各種直接和間接聯(lián)系。非洲豬瘟疫情不僅導(dǎo)致肝素以及用于食品和糖果生產(chǎn)的明膠的供應(yīng)受到影響，而且還導(dǎo)致動物脂肪、皮和毛的利用受到影響。此外，如果不小心將豬源性產(chǎn)品作為養(yǎng)豬生產(chǎn)中豬蛋白質(zhì)營養(yǎng)的來源，那么這些產(chǎn)品將會成為ASF 的“加速器”。

在此背景下，本文力圖總結(jié)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，特別是在過去5 年中獲得的知識，并就主要的知識空白進(jìn)行歸納總結(jié)。對于后者，筆者借鑒了全球非洲豬瘟研究聯(lián)盟最近的差距分析報告(2018 年的報告可在網(wǎng)上查閱：https://www.ars.usda.gov/GARA/reports.htm)。

1 病毒特性

1.1 ASFV 的特征和復(fù)制

ASFV 是一種大型雙鏈DNA 病毒，屬于非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae) 非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)。根據(jù)國際病毒分類委員會2019 年的分類公告(EC 51，德國柏林，2019 年7 月)，非洲豬瘟病毒科已被納入痘疹病毒綱(Pokkesviricetes)、阿福病毒目(Asfuvirales)。除了這一官方命名外，人們還討論了將ASFV 納入暫定的巨型病毒目(Megavirales)，該目包含單源但異質(zhì)的核胞質(zhì)大DNA 病毒(nucleo-cytoplasmatic large DNA viruses，NCLDV)支目。該暫定目還包括痘病毒科(現(xiàn)在屬于Chitovirales新目)、Iridoviridae科(現(xiàn)在屬于Pimascovirales目)、Asfarviridae科、Phycodnaviridae科(現(xiàn)在屬于Algavirales目)、Mimiviridae科(現(xiàn)在屬于Imitervirales目)、Ascoviridae科 (現(xiàn)在屬于Pimascovirales目)和Marseilleviridae科(現(xiàn)在屬于Pimascovirales目)。由于新的巨型病毒不斷被發(fā)現(xiàn)，如潘多拉病毒(Pandoraviruses)、福斯特病毒(Faustoviruses)、軟體病毒(Molliviruse)、高茅巴病毒(Kaumaoebavirus)、塞德魯特病毒(Cedratviruses) 以及帕克曼病毒(Pacmanvirus)，這組病毒在不久的將來可能會增加新成員，命名法則仍在討論中。

ASFV結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，直徑為175～215 nm。到目前為止，研究認(rèn)為，ASFV 由一個核蛋白核心(直徑70～100 nm)、一個由內(nèi)部脂質(zhì)層包圍的核心殼、一個具有1 892～2 172 個帽狀體的二十面體蛋白衣殼和一個可有可無的脂質(zhì)包膜組成。然而，有關(guān)ASFV 結(jié)構(gòu)和構(gòu)造的詳細(xì)情況仍不清楚。

最近，ASFV 粒子三維結(jié)構(gòu)單粒子的低溫電鏡分析結(jié)果顯示，病毒核心(病毒基因組和相關(guān)蛋白，即DNA 結(jié)合蛋白p10、pA104R 和部分轉(zhuǎn)錄機(jī)制復(fù)合物) 實際上被兩個不同的二十面體蛋白衣殼和兩個脂蛋白膜包圍。一個是圍繞著對稱性二十面體的內(nèi)殼；一個是外層，源于出芽過程(budding process)。內(nèi)蛋白層以T=19 衣殼的形式組織，限制了該核心殼。它包含來自病毒多聚蛋白pp220(p5 蛋白、p14 蛋白、p34 蛋白、p37 蛋白和p150 蛋白) 和pp62(p35 蛋白、p15 蛋白和p8 蛋白)的多個蛋白質(zhì)。鑒于β 鏈的含量，p15 蛋白可能是該層的主要衣殼蛋白。外層衣殼[T=277的三角(triangulation) 分?jǐn)?shù)] 形成一個六邊形晶格(lattice)，由主要衣殼蛋白p72 的8 280 個拷貝（以三聚體排列)和位于頂端的五聯(lián)體蛋白(penton protein) 的60 個拷貝組成。簡而言之，細(xì)胞外病毒由通過出芽獲得的外膜、外衣殼、二十面體膜、二十面體內(nèi)衣殼以及封閉的核殼和類核組成，該病毒結(jié)構(gòu)示意圖如圖1 所示。

最近，ASFV 復(fù)雜的衣殼結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步解開，顯示主要的衣殼蛋白(p72 蛋白) 和四個穩(wěn)定的次要蛋白(H240R 蛋白、M1249L 蛋白、p17蛋白、p49 蛋白)以五邊形和三邊形對稱體的方式相互作用。在p72 蛋白的形成過程中，需要B602L 蛋白作為伴侶蛋白。

ASFV 基因組由一個170～190 kb 的雙鏈DNA 分子組成，包含151～167 個開放閱讀 框(open reading frames，ORFs)，ORFs的數(shù)量取決于ASFV 的毒株。ASFV 基因組的兩端由末端反向重復(fù)序列(inverted terminal repeats) 和發(fā)夾環(huán)(hairpin loops) 組成。ASFV 基因組編碼了許多參與病毒組裝、DNA 復(fù)制和修復(fù)的蛋白質(zhì)；還編碼參與免疫調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，如干擾I 型干擾素和細(xì)胞死亡途徑的蛋白質(zhì)。大約一半的ASFV 基因仍無任何已知或可預(yù)測的功能。

直到最近，根據(jù)二維分析結(jié)果，已知ASFV擁有54 種結(jié)構(gòu)蛋白。如上所述，ASFV 外膜是通過出芽方式從宿主細(xì)胞中獲得的，病毒附著蛋白p12 似乎定位于外膜。另一個值得關(guān)注的外膜蛋白是EP402R基因產(chǎn)物CD2v 蛋白。它與T 淋巴細(xì)胞表面黏附受體CD2 具有序列同源性。這種蛋白是血細(xì)胞吸附現(xiàn)象所必需的，可能對病毒的致病機(jī)制極為重要，對病毒在節(jié)肢動物體內(nèi)的復(fù)制也很重要。它還與適配蛋白1(adaptor protein 1，AP-1)相互作用，并可能參與細(xì)胞通路重塑(cellular traffice remodeling)。ASFV 弱毒株通常為CD2v 蛋白截短。外膜中的另一個蛋白為名叫p24 蛋白的細(xì)胞蛋白。該衣殼的主要成分是p72 蛋白，還含有pB438L蛋白(p49蛋白)、pE120R蛋白(p17蛋白)、H240R 蛋白和M1249L 蛋白等。其內(nèi)膜似乎來自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，包含膜蛋白p54、p17、p12(在外膜中也被發(fā)現(xiàn)) 和pE248R 蛋白。所謂的核心殼，現(xiàn)在被定義為內(nèi)衣殼，由pp220 蛋白和pp62 蛋白以及pS273R 蛋白組成。后者是一種處理病毒多聚蛋白的酶。順序切割生成p150蛋白、p37 蛋白、p34 蛋白、p14 蛋白、p35蛋白和p15 蛋白。如上所述，p15 蛋白可能是該內(nèi)衣殼的主要衣殼蛋白。該核心殼中的核蛋白是p10 蛋白和pA104R 蛋白(組蛋白樣蛋白)，核心應(yīng)該包含轉(zhuǎn)錄機(jī)制。

最近，蛋白質(zhì)組學(xué)工具的使用使人們能夠更好地掌握病毒蛋白和病毒宿主之間的相互作用。沿著這些思路，Alejo 等利用質(zhì)譜和免疫電鏡對檢測到的蛋白質(zhì)進(jìn)行定位，建立了一個更新的ASFV 粒子與vero 細(xì)胞適應(yīng)株“BA71V”的圖譜。該方案總共確定了68 種病毒蛋白，其中包括所有以前已知的結(jié)構(gòu)蛋白(見上文)和44 種迄今未被識別的蛋白。有趣的是，23 種蛋白質(zhì)與病毒的某些功能無法關(guān)聯(lián)起來，但這些蛋白質(zhì)卻是病毒體的重要組成部分。

Kessler 等在另一項研究中利用ASFV 低致死毒株OURT88/3 株的重組衍生物研究ASFV在易感(野豬) 和非易感宿主(人、猴)的哺乳動物細(xì)胞系中的基因表達(dá)。在ASFV OURT88/3 株的157 個ORFs 中，94 個被鑒定為蛋白質(zhì)。有趣的是，一些最豐富的蛋白質(zhì)也未被定性，其中包括pK145R 蛋白和pI73R 蛋白，它們是今后需要研究的候選蛋白。Karger等總結(jié)并比較了上述兩項研究?？梢钥闯觯瑢τ诖蠖鄶?shù)預(yù)測的ORFs 來說，可以證明蛋白質(zhì)的存在。然而，對于其他的ORFs 來說，例如多基因家族的成員，仍然缺乏表達(dá)的證據(jù)。這些ORFs 可能只在被感染的宿主或其主要靶細(xì)胞中發(fā)揮作用。這也可以解釋為什么這些基因在ASFV 的細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)株中經(jīng)常被剔除。

上述研究是利用永久細(xì)胞系而非ASFV 主要靶細(xì)胞進(jìn)行的，這可能會對研究結(jié)果產(chǎn)生重大影響。到目前為止，很難產(chǎn)生一個又大又純的受感染的巨噬細(xì)胞群。不過，相關(guān)研究機(jī)構(gòu)正在探討分類、同步和改進(jìn)的方案，以備將來研究使用。

ASFV 主要在單核吞噬系統(tǒng)的細(xì)胞中復(fù)制，并且通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和縊斷蛋白(dynamin)依賴的內(nèi)吞作用和巨胞飲作用進(jìn)行。研究表明，肌動蛋白依賴性的內(nèi)吞作用和涉及微管活性的內(nèi)吞通量也與此有關(guān)，即經(jīng)典吞噬作用。其細(xì)胞受體及其病毒配體尚不清楚，一個假定的CD163 受體仍存在爭議，但CD163 基因敲除的豬對ASFV 仍然易感。Lithgow 等在與豬骨髓黏附細(xì)胞易感性相關(guān)的表面標(biāo)記中發(fā)現(xiàn)了CD45 受體。

ASFV 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，要解開病毒的衣殼需要啟動整個內(nèi)肢體途徑(endosomal pathway)，衣殼在內(nèi)體腔的酸性環(huán)境中分解。在pE248R 蛋白介導(dǎo)下衣殼和融合膜降解，病毒核心被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。病毒DNA 的釋放需要泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的作用。病毒的復(fù)制和組裝在靠近細(xì)胞核的特殊病毒工廠中進(jìn)行，新形成的病毒通過出芽從感染的細(xì)胞中釋放出來。至于強(qiáng)烈調(diào)控轉(zhuǎn)錄和RNA 加工，則需要病毒編碼的酶。Almazan 等指出，可以區(qū)分即時的、早期的、中期的和晚期的RNA 轉(zhuǎn)錄物。雖然病毒復(fù)制的主要階段在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，但Rojo 等指出早期的成核階段也發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，此階段牽涉核纖層網(wǎng)絡(luò)(lamina network) 的解體和核蛋白的重新分布。最近，Sim?es 等詳細(xì)回顧了成核階段的作用，并對目前掌握的信息進(jìn)行了匯編?？梢宰C明，ASFV 感染激活了DNA 損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR) 途徑，改變了細(xì)胞核形態(tài)(nuclear landscape)和細(xì)胞表觀遺傳特征，促進(jìn)了有效感染和后代的形成。例如，ASFV的有效復(fù)制取決于與細(xì)胞周期控制、凋亡和免疫反應(yīng)相關(guān)的早幼粒細(xì)胞白血病核體的相互作用。此外，異染色質(zhì)是經(jīng)誘導(dǎo)形成的，很可能是為了使編碼不利于病毒復(fù)制的蛋白質(zhì)的宿主基因保持沉默。這些病毒誘導(dǎo)的重排可能解釋了上述的核纖層網(wǎng)絡(luò)的裂解。綜上所述，ASFV破壞了亞核結(jié)構(gòu)域和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，并誘導(dǎo)核結(jié)構(gòu)改變，以加強(qiáng)壓制性核環(huán)境，使病毒能在宿主細(xì)胞中有效復(fù)制。然而，細(xì)胞核的全部作用仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。

最近，Galindo 和Alonso 對ASFV 一般復(fù)制進(jìn)行了更詳細(xì)回顧，Rodríguez 和Salas 則特意對轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了詳細(xì)綜述。

差距和進(jìn)一步研究的方向：

○對ASFV 毒力基因、宿主范圍和病毒-載體-宿主的相互作用知之甚少。需要大量ASFV 基因型高質(zhì)量的全長基因組序列，以便能夠?qū)Σ《居懈钊氲牧私狻?/p>

○在ASFV 的150～170 個ORFs 中，大多數(shù)只是預(yù)測，很少有RNA 水平或蛋白質(zhì)水平上的實驗性證據(jù)。因此，需要進(jìn)一步研究以更好地了解病毒蛋白及其在不同條件下的表達(dá)。

○還需要了解宿主方面的反應(yīng)，特別是病毒受體、先天性免疫反應(yīng)以及病毒與宿主在細(xì)胞水平上的互作。

○應(yīng)加快對ASFV 蛋白質(zhì)功能的研究。

1.2 ASFV 活力的穩(wěn)定性和滅活

ASFV 在環(huán)境和生豬肉制品中高度穩(wěn)定，低溫、潮濕和富含蛋白質(zhì)的環(huán)境有利于其存活。因此，ASFV 在冷藏豬肉中的感染期可長達(dá)15 周，在腌制的火腿中可長達(dá)6 個月，在帕爾瑪火腿中可達(dá)399 d。在液態(tài)豬糞中，ASFV能夠穩(wěn)定存活100 d 以上；在豬的液態(tài)血液中，室溫下ASFV 可存活18 個月，在4 ℃下最多存活6 年。歐洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA) 在《非洲豬瘟科學(xué)報告》中給出了詳細(xì)的清單。最近和正在進(jìn)行的研究探討了與ASFV 間接傳播有關(guān)的材料，如飼料、食物、土壤和尸體。對于飼料原料，Stoian 等的研究重點是跨洋運(yùn)輸時ASFV的穩(wěn)定性。在這些條件下計算出的ASFV 的半衰期從9.6 d 到14.2 d 不等，具體時間取決于ASFV 所處的基質(zhì)。此外，Niederwerder 等研究發(fā)現(xiàn)，ASFV 可以通過被污染的液體和干飼料傳播。在考察這些研究的結(jié)果時，病毒的載量和拷貝數(shù)是重要的影響因素，因此需要進(jìn)行更多的研究。在一項關(guān)于ASFV 在受污染作物中活力穩(wěn)定性的實驗室規(guī)模的研究中，研究人員探討了干燥和熱滅活對病毒活性的影響?？傊?，ASFV 在干燥的室溫環(huán)境中經(jīng)過2 h 被滅活。關(guān)于ASFV 在豬胴體中的穩(wěn)定性，最近立陶宛的研究人員進(jìn)行了一項研究。Zani 等將于不同時間掩埋在不同地點的感染了ASFV的野豬尸體挖掘出，隨后利用體外檢測法檢測傳染性ASFV，用qPCR 法測定病毒的基因組。出乎意料的是，從尸體中只檢測出病毒基因組，而所有的病毒分離嘗試結(jié)果均為陰性。Carlson 等在最近一項尚未發(fā)表的研究中探討了土壤對ASFV 活性的影響。簡言之，在不同的土壤基質(zhì)中摻入感染野豬的ASFV 陽性血液，隨后檢測病毒的活性。土壤pH、結(jié)構(gòu)和環(huán)境溫度對ASFV 活力的穩(wěn)定性起著重要的作用。對于沙地或花園類的土壤，幾周后仍可分離到活病毒；對于沼澤地的土壤，幾天后可分離到病毒；未能從森林的酸性土壤中分離出病毒。用檸檬酸或氫氧化鈣緩解土壤的酸堿性，結(jié)果顯示ASFV 在所有類型的土壤中均完全失活。

研究人員提出的另一個問題是ASFV 在以豬糞便為原料的沼氣廠廢棄物中的滅活情況。Davies 等調(diào)查了ASFV 在實驗性感染豬的糞便和尿液中的存活時間。根據(jù)計算出的半衰期可以認(rèn)為，在37 ℃下，ASFV 經(jīng)過約4 d(尿液)或3 d(糞便)后仍具有傳染力。在沼氣廠的沼氣生產(chǎn)環(huán)境中，應(yīng)考慮如pH 和代謝物等次要因素，因此上述這些時間可以下調(diào)。Turner和William 的研究表明，在40 ℃下，豬糞中ASFV 經(jīng)4 h 即可滅活。Moss 得出的結(jié)論是，如果沼氣廠采用正確的生產(chǎn)工藝，數(shù)小時(采用高溫生產(chǎn)工藝的沼氣廠)或數(shù)天(采用中溫生產(chǎn)工藝的沼氣廠) 可使ASFV 滅活。然而，必須考慮到(與高度安全的實驗室或現(xiàn)代熬煉廠相比)，這些工廠在設(shè)計生產(chǎn)工藝時通常沒有考慮嚴(yán)格的黑/白分離。在工廠中，例如緊隨其后的是化肥廠，可以認(rèn)為再次污染的情況也將不會發(fā)生，因為在真空生產(chǎn)環(huán)境中發(fā)酵基質(zhì)的數(shù)量會逐步減少。

世界各地都在使用不同種類的消毒劑。在實驗條件下，過氧乙酸或甲酸消毒劑顯示出良好的殺病毒效果。一般來說，ASFV 對脂類溶劑、洗滌劑以及氧化劑敏感。EFSA 發(fā)表了一份科學(xué)報告，介紹了在田間條件下(與氫氧化鈉和碳酸鈉相比)被授權(quán)消毒劑功效的最新數(shù)據(jù)。原則上可以認(rèn)為，對其他包膜DNA 病毒顯示出良好滅活功效的消毒劑對ASFV 也有效。

差距和進(jìn)一步研究的方向：

○飼料、飲水和墊料對ASFV 傳播的作用仍有爭議，需要進(jìn)一步研究。

○病死豬掩埋地是否需要采用消毒措施仍然是一個沒有定論的問題，需進(jìn)一步測試ASFV 的穩(wěn)定性，如使用不同種類的土壤，對改進(jìn)風(fēng)險評估是必要的。

○雖然抗包膜病毒的消毒劑在標(biāo)準(zhǔn)化條件下能夠有效殺滅ASFV，但需要找到切實有效的方法，以在資源有限的環(huán)境和表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜的物體(如木質(zhì)物資、開放性混凝土或其他種類的地板)上測試消毒劑的有效性，并選擇合適的針對ASFV 的消毒劑。

1.3 遺傳多樣性和分型

在過去幾十年里，研究人員利用不同的遺傳區(qū)域，通過測定小DNA 片段中部分基因序列對ASFV 分離株進(jìn)行定型。用于基因型命名的區(qū)域通常是p72 編碼區(qū)，對p54、p72 和pB602L基因進(jìn)行測序，可以獲得更好的鑒別能力?；谶@一思路，Boshoff 等已經(jīng)在非洲鑒定出24 種ASFV 基因型。遺傳多樣性通過森林循環(huán)得到提高，但這些地區(qū)之外并不存在這種情況。此外，病毒的基因型與其毒力或致病性沒有關(guān)系?！皣H”基因型是Ⅰ型和Ⅱ型。

總體而言，ASFV 非常穩(wěn)定，基因突變率非常低。這導(dǎo)致該病毒在發(fā)病地區(qū)的遺傳變異性很低，即使使用下一代測序技術(shù)，通常也不能以更高的分辨率對病毒毒株進(jìn)行分子追蹤，例如在發(fā)生疫情時的分子流行病學(xué)。只有全基因組才可能有所區(qū)別，并可推斷出毒力因子。同樣，通過全基因組測序也能更好地識別新毒株的基因缺失變種。在過去的十年中，一些科學(xué)實驗計劃已得到了優(yōu)化，包括長片段牛津納米孔技術(shù)(Oxford Nanopore MinION)測序技術(shù)。

在目前的流行狀態(tài)下，ASFV 每天都會產(chǎn)生新的基因序列，控制檢測質(zhì)量是最重要的。否則，測序的錯誤率可能高于病毒復(fù)制過程中的錯誤率，而測序錯誤會被誤解和過度解讀為重大差異。最近，為獲得可靠和高質(zhì)量的全基因組序列，已經(jīng)建立了一個深度測序流程(deep-sequencing workflow)。這個工作流程基于靶向富集和使用不同測序平臺來規(guī)避特定的缺點。國際合作是為未來研究提供可靠數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。

差距和進(jìn)一步研究方向：

○必須努力優(yōu)化和協(xié)調(diào)樣本選擇、基因測序、生物信息學(xué)工作流程和數(shù)據(jù)文檔的協(xié)議，最有效地利用財政和技術(shù)資源。

○在一個有針對性的方法中，應(yīng)該生成所有可用基因型和宿主物種的全基因組序列，作為進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。

○應(yīng)加快發(fā)現(xiàn)與非洲豬瘟病毒科有關(guān)的病毒，以便進(jìn)行進(jìn)化分析。

原題名：African swine fever -A review of current knowledge(英文)

原作者：Sandra Blome、Kati Franzke和Martin Beer