許 霞,朱致君,李靈軍,李功玉,3
(1.南開大學化學學院分析科學研究中心,天津市生物傳感與分子識別重點實驗室,天津 300071; 2.威斯康星大學麥迪遜分?;瘜W系和藥學院,威斯康星州 53705; 3.物質(zhì)綠色創(chuàng)造與制造海河實驗室,天津 300192)
圖1 立體化學修飾多肽蛋白的發(fā)現(xiàn)年代(a),分子質(zhì)量(b)及突變位點統(tǒng)計(c)分布Fig.1 Distributions of temporal (a), molecular weight (b) and mutation site distribution (c) of stereochemically modified peptide/protein
立體化學修飾的多肽蛋白(stereochemically modified peptide/protein, SCMP)是天然存在的一種含量較低,但與多種疾病相關的蛋白形式。與其他常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類似,立體化學修飾(stereochemical modification, SCM)調(diào)控著一系列重要蛋白的結構和功能。大量研究表明[1],信號轉(zhuǎn)導神經(jīng)肽的修飾直接影響生物活性。因此,研究以SCMP異構體形式存在的神經(jīng)肽和蛋白質(zhì)結構對于闡明其構效關系具有重要意義[2-7]。
多肽蛋白立體化學修飾可導致天然氨基酸空間立體異構化。目前報道最多的SCMP是單位點或極少數(shù)位點由L-構型異構化為D-型,這類蛋白和多肽最早被美國伊利諾伊大學香檳分校Jonathan Sweedler課題組[7]命名為包含D-型氨基酸的多肽/蛋白(D-amino acid-containing peptide/protein, DAACP)。立體化學修飾數(shù)據(jù)庫正在逐年擴大,截至目前,至少有55種蛋白多肽體系中存在立體化學修飾,列于附表1(請登錄《質(zhì)譜學報》官網(wǎng)http:∥www.jcmss.com.cn下載)。已報道的大部分SCMP分子質(zhì)量集中分布在400~2 200 u之間,少數(shù)的分子質(zhì)量超過5 000 u;氨基酸的突變位點大多發(fā)生在N端的第2、3位上,其中以苯丙氨酸、亮氨酸和丙氨酸的突變數(shù)量最多,示于圖1。突變位點規(guī)律性主要取決于宿主生物的酶促體系,而分子質(zhì)量分布范圍在很大程度上受限于立體化學修飾鑒定手段和儀器設備的靈敏度及適用范圍。
這些SCMP的發(fā)現(xiàn)主要來源于單細胞甲殼類等低等生物,包括海蛞蝓加利福尼亞海兔[8-9]、美洲龍蝦[10]、小龍蝦克氏原螯蝦[11]、鴨嘴獸[12]、錐螺的毒液[13]、漏斗網(wǎng)蜘蛛和南美樹蛙[14-15]等。立體化學修飾經(jīng)常在動物毒液中被檢測到,也有在人類各種組織(包括牙齒、皮膚和大腦)的衰老蛋白中D-異構化氨基酸殘基的報道[16]。由于內(nèi)源性酶只識別由L-氨基酸組成的蛋白質(zhì)和肽,而在大多數(shù)神經(jīng)肽中DAACP通常含有1個D-氨基酸,對內(nèi)源性酶具有更大的抗性。因此,SCMP往往比天然蛋白多肽具有更長的壽命[17-18]。一般認為,動物細胞中大多數(shù)SCMP的生成與酶促反應相關,與此同時,酶促反應之外的化學調(diào)控因子也可能參與人體組織中幾種年齡依賴型蛋白的立體化學修飾[19]。與內(nèi)源性神經(jīng)肽相比,在許多情況下,立體化學修飾的神經(jīng)肽異構體具有更高的生物活性[7,18]。但也有報道[20]指出,相比于全位點突變,單位點或者部分位點突變的DAACP具有更高的毒性。這表明,增加立體化學修飾的檢測和識別能力,對探究SCMP的發(fā)生過程與機制、化學調(diào)控、以及靶向SCMP藥物開發(fā)與設計都起著重要的支撐作用。
與其他修飾不同,立體化學修飾并沒有引起蛋白和多肽分子質(zhì)量的改變,基于質(zhì)譜的常規(guī)蛋白多肽檢測技術難以實現(xiàn)對SCMP的有效分離與鑒定。離子淌度質(zhì)譜(ion mobility-mass spectrometry, IM-MS)受益于離子淌度儀在質(zhì)譜基礎上進行的二維分離,不僅具備分析速度快和耗樣量少的優(yōu)點,而且可以根據(jù)目標離子的構象與尺寸在毫秒級時間尺度上進行高效分離分析。隨著硬件、軟件和數(shù)據(jù)分析等方面的快速發(fā)展,近些年來IM-MS技術已成為SCMP分離分析與快速鑒定的一種重要方法[2,4,21-27]。
本文將圍繞離子淌度質(zhì)譜和非變性質(zhì)譜的核心技術,重點介紹多種商業(yè)化離子淌度儀的性能差異、SCMP高分辨離子淌度質(zhì)譜分離分析與鑒定方法的最新進展、SCMP與受體相互作用的結構質(zhì)譜表征策略,并展望立體化學修飾與離子淌度儀的發(fā)展方向與應用前景。
離子淌度質(zhì)譜(也稱“離子遷移質(zhì)譜”)是在常規(guī)質(zhì)譜的基礎上串聯(lián)離子淌度儀,根據(jù)質(zhì)荷比(m/z)以及離子遷移率實現(xiàn)目標離子的二維在線分離。IM-MS的基本工作原理是離子在漂移管飛行時與緩沖氣體(通常為氮氣、氦氣和氬氣)碰撞,由于離子形狀、大小和電荷數(shù)不同而受到的阻力不同,在相同電場中通過相同距離漂移管所需要的時間不同,由此實現(xiàn)對目標離子的快速分離。通過一定的物理模型與近似處理,可將遷移時間轉(zhuǎn)換成與離子結構相關的物理參數(shù)——碰撞截面積(collisional cross-section, CCS)。與傳統(tǒng)質(zhì)譜相比,離子淌度質(zhì)譜可以對m/z相同的離子在離子淌度維度進行二維分離,提高了構象分析效果。IM-MS分離的基本原理可以用 Chapman-Enskog 和 Mason-Schamp[28]方程的理論來解釋,示于式(1)。
(1)
式中,K為緩沖氣體中特定離子的遷移率,提供了有關離子在穿過緩沖氣體時所經(jīng)歷的相互作用信息;μ(μ=mM/(m+M))為擴散離子(m)和載氣分子(M)這一碰撞粒子對的約化質(zhì)量;kB為玻爾茲曼常數(shù);T為開爾文溫度;z為離子電荷數(shù);e為元電荷所帶的電荷量(C);N為中性氣體數(shù)密度(m-3);Ω為碰撞截面積(m2)。式(1)給出了離子遷移率K與CCS之間的直接關系。離子在漂移管中受庫侖力和氣體分子碰撞阻礙力的作用,其通過漂移管所需的時間(td)與K直接相關,而這取決于離子的形狀、質(zhì)量和電荷量。在簡化模型中,K取決于離子與氣體分子的碰撞頻率,該頻率與氣體數(shù)密度(N=每單位體積的氣體分子數(shù))有關。因此,離子遷移率與氣體壓力(p)和溫度(T)相關。實驗室常用的約化遷移率(K0)通過式(2)計算:
(2)
式中,p為氣體壓力,p0為IUPAC標準壓力(即100 kPa),T0為標準溫度(即273.15 K)。根據(jù)氣體動力學理論,假設漂移管在低電場條件下發(fā)生純彈性碰撞,td可轉(zhuǎn)化為CCS,示于式(3):
(3)
式中,變量E、L、P分別對應電場強度(V/m)、漂移區(qū)長度(m)和壓力(Torr)。
IM-MS的儀器構造大部分是將IMS連接到TOF-MS上,近些年也有將IMS連接到Orbitrap MS上的報道[29]。IM-MS主要根據(jù)IMS分型進行分類,根據(jù)技術特點,離子淌度儀主要分為時間擴散型(time-dispersive)、空間擴散型(spatially dispersive)以及場分散掃描型(field-dispersive scan)[28,30-31]3類。根據(jù)基本構造,目前商業(yè)化的IMS主要包括5大類,示于圖2。其中,漂移管離子淌度儀(DTIMS)和行波離子淌度儀(TWIMS)屬于時間擴散型,微分遷移率分析儀(DMA)和高場不對稱離子淌度儀(FAIMS)屬于空間擴散型,而捕獲離子淌度儀(TIMS)則屬于場分散掃描型。提升結構分辨率一直是離子淌度儀發(fā)展的主要方向,包括硬件升級改造、原理方法創(chuàng)新以及高級數(shù)據(jù)采集與分析系統(tǒng)開發(fā)等。5種離子淌度儀的主要特點及分辨率信息列于表1。
1.2.1漂移管離子淌度儀 漂移管離子淌度儀(DTIMS)是最早出現(xiàn)、最為經(jīng)典的IMS技術。早在20世紀30年代,Bradbury等[32]就采用DTIMS研究氣相離子遷移率K。DTIMS由一系列疊環(huán)電極組成,在這些電極上,漂移管的軸線上產(chǎn)生了近似均勻的電場。載氣和氣態(tài)樣品被引入電離區(qū),而逆流流動的中性氣體(主要是氮氣、氦氣或氬氣,被稱為漂移氣體)從檢測區(qū)的一側(cè)引入[33],在漂移管腔體內(nèi)沒有特定的流動方向。離子在有中性氣體分子存在的漂移管中通過均勻、連續(xù)的電場,以恒定的速度移動。從離子通過漂移管的時間可得離子遷移率K。一般來說,CCS越小、電荷量越高,離子的遷移速度越快?;衔镌谳^高分辨DTIMS中能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離,并通過第一性原理可直接得出CCS值,實驗中,通常在不同電場下多次測量以獲得最準確的CCS值。由于DTIMS分析采用離子脈沖模式,其占空比相較于連續(xù)IMS要低。
注:a.構造示意圖,由文獻[36]改編;b.氣體動力學描述;c.離子運動規(guī)律示意圖圖2 目前市場上5種主要離子淌度儀的結構特點示意圖Fig.2 Schematic diagrams of different types of IM-MS on the market
1.2.2行波離子淌度儀 2006年,美國Waters公司推出首個商業(yè)化的基于行波離子淌度儀(TWIMS)的Synapt HDMS[34]離子淌度質(zhì)譜儀,隨后,于2011年和2013年推出二代基于TWIMS的離子淌度質(zhì)譜儀,分別為Synapt G2-S和Synapt G2-Si。目前,TWIMS已成為最成熟的IMS技術。TWIMS由施加了行波電壓的堆疊環(huán)離子導向器組成,將相反相位的射頻電壓施加到相鄰的環(huán)形電極以提供徑向離子捕獲,從而實現(xiàn)高效率傳輸。脈沖直流電壓從設備的一端到另一端連續(xù)疊加到每個電極的射頻電壓上,從而軸向推動離子。在固定的脈沖停留時間后,電壓施加到下一個電極對,由此產(chǎn)生行波。針對第一、二代儀器相對較低的分辨率,儀器廠商對TWIMS結構進行了優(yōu)化,如無損離子淌度儀(structure lossless ion manipulation, SLIM)[24-25,35-36]。SLIM氣相分離的基本原理與TWIMS類似。由于SLIM中工作氣壓較低,在射頻聚焦電場的輔助下,離子可以在SLIM中穩(wěn)定存儲數(shù)小時以上,同時實現(xiàn)近乎無損的傳輸[37]。TWIMS能夠在比DTIMS更小的裝置中實現(xiàn)相近分辨率的淌度分離,大大縮小儀器體積。在實現(xiàn)較高分辨率的同時,TWIMS還可以更好地與商品化質(zhì)譜儀聯(lián)用。環(huán)狀離子淌度儀(cyclic IMS, cIMS)[38]是Waters公司最新推出的高分辨離子淌度儀,與TOF MS聯(lián)用,實現(xiàn)了超過200結構分辨率(基于離子遷移時間計算)的高分辨分離分析,可用于微小結構差異區(qū)分。該儀器未來可以改進的空間包括:改善由于多圈掃描引起離子損耗而靈敏度下降的問題、建立完善的多圈掃描后CCS校正方法以及提高操作界面用戶友好性等方面。
1.2.3微分遷移率分析儀 微分遷移率分析儀(DMA)是IMS的一種特殊結構[39-40],其工作方式與DTIMS類似,都是利用恒定電場,并且均可以測量K值。DMA是基于一個方向的電泳遷移和正交方向的流體驅(qū)動遷移在空間上分離離子。在DMA中,所有離子必須移動相同的距離到達探測器,只有具有指定遷移率的離子才能從 DMA 的入口穿越到出口。圓形柱是最常用的DMA類型,它由2個圓柱形和同心金屬電極組成[41]。DMA的分離是通過2個垂直的力疊加在離子上完成的,2個阻力分別來自高流速的鞘氣和1個垂直的電場。利用高鞘流速進行空間分離,可以獲得更高的分辨率和靈敏度。DMA通常用作過濾裝置,僅允許在給定的時間傳輸具有特定淌度值或淌度特性的離子,可以提高分析的選擇性,但對于較寬范圍的淌度分析,其速度較慢、靈敏度較低。
1.2.4高場不對稱離子淌度儀 高場不對稱離子淌度儀(FAIMS)最早是由前蘇聯(lián)人發(fā)明的,于20世紀90年代中期被引入北美后迅速發(fā)展。與基于時間分離的DTIMS和TWIMS不同,F(xiàn)AIMS是一種空間電遷移譜儀[42-43]。作為離子遷移譜中較為特殊的一類,F(xiàn)AIMS是利用離子遷移率在高電場下的非線性變化規(guī)律進行分離。在FAIMS中,帶電粒子暴露于具有相反極性的不對稱波形中,這種高電場和低電場周期性交替的非對稱波形導致帶電粒子在一對等間距的電極之間遵循鋸齒形模式運動,并且由于離子遷移率對非線性電場的依賴性而發(fā)生分離。FAIMS具有連續(xù)的離子監(jiān)測能力,并基于離子遷移率正交分離的功能實現(xiàn)高分離選擇性;此外,能夠同時檢測正、負離子,并且具有核心部件小等優(yōu)點。但在FAIMS儀器中檢測到的離子豐度相對較低,降低了其檢測靈敏度。
1.2.5捕獲離子淌度儀 捕獲離子淌度儀(TIMS)是一種相對較新的氣相分離儀器[44],由Park等[45-46]于2011年提出,是Bruker公司的專利技術。TIMS將一組電極劃分為入口漏斗、TIMS遷移區(qū)和出口漏斗3個區(qū)域。入口和出口均可控制離子的偏轉(zhuǎn)和聚焦,TIMS的遷移區(qū)域可以通過同向平行氣流和反向電場之間的相互作用來積累、捕獲和洗脫目標離子。首先,離子在TIMS中被捕獲,利用徑向約束的射頻電場和軸向非均勻電場使離子在氣流中保持靜止;隨后,離子在遷移區(qū)受高速氣流推動力和反向電場阻力的作用,而反向電場強度隨分離區(qū)軸線位置呈線性變化,其方向與高速氣流相反[47-48]。當氣流速率與離子遷移速率相等時,離子相對于漂移管保持靜止,即不同離子根據(jù)遷移率K的差異分布在不同電場強度的位置。離子截面積越大,離子淌度越小,維持靜止所需的電場強度越高,即穩(wěn)定在高場區(qū)域[47,49]??鏘MS隧道區(qū)域施加的電壓梯度使多種異構體被同時捕獲,但在不同的電壓值處被富集,通過逐步降低電場釋放離子,以實現(xiàn)離子的逐步洗脫。TIMS通常與四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用,在保證靈敏度的前提下,可以有效提高儀器的分離能力。
一般認為,SCMP的發(fā)現(xiàn)基于傳統(tǒng)蛋白組多肽組學工作流程[50],主要包括大規(guī)模蛋白多肽提取,樣品純化分析與氨基酸序列鑒定,結構、功能表征并與試管合成標準物比對,立體異構化氨基酸的鑒定與驗證4個關鍵步驟,示于圖3。
本文主要關注離子淌度儀在SCMP發(fā)現(xiàn)過程中的作用,即其在立體異構氨基酸分離分析與鑒定中的應用方法學開發(fā)。與其他分離技術,如高效液相色譜(HPLC)[51],毛細管電泳(CE)[52]等相比,離子淌度儀可以在更短的時間尺度上對異構體進行分離,同時還可以測定異構體的結構信息[53]。離子淌度質(zhì)譜分析的一大挑戰(zhàn)是使用傳統(tǒng)商業(yè)化儀器時往往受到固有結構分辨率以及總分離時間等因素的影響,難以對大部分SCMP混合物實現(xiàn)基線分離。因此,本文將以如何提高離子淌度質(zhì)譜的結構分辨率為主線,圍繞串聯(lián)質(zhì)譜、硬件改造以及多維差異放大等方面,總結近些年來的研究進展。
串聯(lián)質(zhì)譜是一種快速檢測與測序的方法[54-58]。對于同分異構體的鑒別,一級質(zhì)譜(MS1)只能提供相同的m/z信息,無法實現(xiàn)異構體的區(qū)分;而二級質(zhì)譜(MS2),如高能碰撞解離(higher-energy collisional dissociation, HCD)和碰撞誘導解離(collision-induced dissociation, CID),可以通過提供不同的碎裂途徑生成信息豐富、結構重要的產(chǎn)物離子,為識別和鑒定異構體提供互補的結構信息[59]。雖然異構體在串聯(lián)質(zhì)譜中可能產(chǎn)生難以區(qū)分的離子遷移率到達時間相似的碎片離子,但通過CID技術結合化學計量學方法可以有效區(qū)分離子淌度重疊的異構體。Julian課題組[57]利用自由基誘導解離(radical directed dissociation, RDD)和CID串聯(lián)質(zhì)譜技術鑒定多肽異構體,并發(fā)現(xiàn)了新的異構化位點。李靈軍課題組[25]開發(fā)了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-行波離子淌度質(zhì)譜(LC-MS/MS-TWIMS)法快速、可靠地鑒定手性突變多肽中D-氨基酸位點,示于圖4a。該方法通過反相液相色譜從復雜混合物中分離手性多肽,用離子淌度質(zhì)譜對其經(jīng)CID產(chǎn)生的b、y碎片離子進行結構檢測,通過評估與L型對映體的b、y碎片離子的漂移時間或者碰撞橫截面間的變化差異定位D-氨基酸殘基。研究者使用該方法揭示了龍蝦體內(nèi)甲殼類高血糖激素從N端起第3個氨基酸(L-苯丙氨酸到D-苯丙氨酸)的異構化。此外,還可以通過串聯(lián)質(zhì)譜與金屬加合物結合的策略增強IM-MS的分離性能,如DAACP中D-殘基的定位、拓撲異構體鑒別和肽異構體的改進分離等[22,24,60-61]。
圖3 發(fā)現(xiàn)、鑒定SCMP的常用工作流程[50]Fig.3 Workflow for discovering and identifying SCMP[50]
注:a.LC-MS/MS-TWIMS鑒定手性多肽D-氨基酸殘基位點[25];b.CE-TIMS-MS超高分辨分析與 鑒定單細胞中多肽立體化學修飾[62];c.SLIM SUPER IM-MS高分辨分離分析Aβ17-28多肽差向異構體[64]; d.2D-LC-DTIMS-MS鑒定阿爾茲海默癥病人的Aβ蛋白片段差向異構體[68]圖4 4種基于離子淌度質(zhì)譜的手性多肽快速分離分析與鑒定方法Fig.4 Fast separation and identification of DAACP based on IM-MS
近年來離子淌度技術發(fā)展迅速,在儀器分辨率方面獲得了顯著提升。Fouque等[24]報道了一種利用TIMS儀器實現(xiàn)SCMP異構體超高分辨率分離分析的方法,其中基于CCS值計算的分辨率可達340。研究者利用TIMS對一些CCS值差異低至1%的手性多肽與其L型對映體實現(xiàn)了基線分離。以一種含有29個氨基酸殘基的手性多肽(GRF)為例,該方法在D/L-GRF多肽400∶1的混合物中實現(xiàn)了基線分離和手性定量分析。Mast等[62]成功將毛細管電泳技術與TIMS-MS聯(lián)用,并應用于海兔單個神經(jīng)結細胞中手性多肽的分析,示于圖4b。結果顯示,神經(jīng)組織中來自胸膜前體的Plrn2多肽有44%存在D-氨基酸殘基。Berthias等[63]使用FAIMS對含有42個氨基酸殘基的手性多肽及其差向異構體實現(xiàn)了基線分離,最大分辨率可達159。Nagy等[64]將一種基于TWIMS的新型超高分辨離子淌度質(zhì)譜(TW SLIM SUPER IM-MS)[65]用于研究β淀粉樣蛋白(Aβ)片段Aβ17-28肽段,示于圖4c。由于Asn27可以通過異構化脫酰基生成Asp,與Asp23相同,均存在4種外消旋化異構體,研究者采用直接進樣的方法對16種Aβ17-28多肽異構體進行分離分析。得益于SLIM的超高分辨率,在1 s內(nèi)實現(xiàn)了這16種異構體鈉加合離子[M+H+Na]2+的基線分離。此外,Waters公司研發(fā)的基于TWIMS的環(huán)形離子淌度質(zhì)譜儀也被應用于手性多肽的研究[66]。通過與超高效液相色譜聯(lián)用,在45 s色譜保留時間窗口內(nèi),通過4圈環(huán)形離子淌度循環(huán)(~50 ms,R~130)使共洗脫的手性多肽達到有效分離。該技術基于保留時間-漂移時間二維分離策略,對11種異構化的多肽實現(xiàn)了分離。結合b、y碎片離子的漂移時間,成功鑒別出手性多肽的單位點及雙位點修飾。
在無法實現(xiàn)快速更新儀器硬件的情況下,多維手性差異放大和多維分離技術的應用顯得尤為重要。在某些情況下,還需要串聯(lián)其他分離技術(如 LC 和 CE),以提高復雜混合物中肽異構體的檢測覆蓋率[4,67-68],同時結合多維數(shù)據(jù)可視化[69]和計算建模[70],輔助基于IM-MS的多肽異構體結構分析。
本課題組[61]利用TWIMS平臺發(fā)現(xiàn),有些D-和L-多肽單體在離子淌度檢測中的差異很小,但以寡聚體形式存在的D/L多肽結構差異比單體更大,放大了單體的手性結構差異。在此基礎上,本課題組[71]提出了一種基于金屬離子結合的多維手性差異放大策略,適用于從單體、寡聚到受體相互作用的手性效應研究,被稱為復合型手性分析平臺(integrative chiral anatomy platform, iCAP)。通過建立以多肽質(zhì)子化峰、結合1個金屬峰和結合2個金屬峰這3種形式的以CCS為坐標的三維體系,成功放大了多肽的手性效應,將原本在較低分辨率淌度平臺難以區(qū)分的D-和L-神經(jīng)肽在三維空間中有效地區(qū)分開來。離子淌度數(shù)據(jù)采集模式的創(chuàng)新提升了分離效果。Agilent公司將基于阿達瑪變換(Hadamard transform)的多重復用離子注射法[72]應用于DTIMS,在不需增加數(shù)據(jù)采集時間和離子淌度掃描范圍的前提下,產(chǎn)生了7~8倍的信號增益,并且將占空比提高到50%,離子淌度分辨率從60提升到了180~250[73]。運用這種新型數(shù)據(jù)采集方式,Mukherjee等[68]搭建了2D-LC-IMS-MS平臺,從阿爾茲海默癥病人的腦組織中檢測到了一系列由天冬氨酸異構導致的Aβ手性多肽異構體,示于圖4d。
目前,手性神經(jīng)肽受體分析研究受到廣泛關注,例如,全氨基酸手性反轉(zhuǎn)的多肽異構體由于對抗酶消化的顯著抗性,有望用于開發(fā)新的候選藥物[20,74]。盡管異構化有著獨特的功能,但其結構變化往往不顯著,這是因為大部分神經(jīng)肽只有個別氨基酸位點會發(fā)生D-異構化[7]。為了有效解析立體化學修飾對重要蛋白多肽的構效關系,開發(fā)高分辨的神經(jīng)肽異構體結構分析工具是重要的發(fā)展方向。
目前關于DAACP的完整生理作用研究較少,尤其是缺乏探討DAACP與其同源受體相互作用方面的報道。Sweedler課題組[50]在加利福尼亞海兔中新發(fā)現(xiàn)了一種包含D-氨基酸的多肽(ATRP),該多肽既能激活受體(G-蛋白偶聯(lián)受體),又能激活神經(jīng)元靶點。與之前報道的DAACP及其全L-殘基類似物不同,L-ATRP和D2-ATRP都是G-蛋白偶聯(lián)受體的強效激動劑,且均在電生理實驗中具有活性。在此基礎上,該課題組又研究了來自單一神經(jīng)肽前激素,即海兔素樣神經(jīng)肽前體(apALNP)的幾個DAACP信號轉(zhuǎn)導與結構的關系。為了深入了解通過apALNR的配體信號,該課題組建立了來自apALNP的天然和非天然神經(jīng)肽類似物的數(shù)據(jù)庫,并評估它們在與apALNR和混雜的Gα亞基Gα-16共轉(zhuǎn)染細胞中的活性。這不僅研究了常規(guī)神經(jīng)肽與受體的作用關系,還對DAACP與其神經(jīng)肽受體的構效關系進行構象研究[75]。關于DAACP三維構象如何影響受體活性,以及D-殘基在這些肽構象中發(fā)揮作用的研究很少。為了研究構效關系,該課題組使用建立計算模型、DTIMS分析和受體激活分析相結合的方法創(chuàng)建了簡單模型,預測了一系列多肽GdFFD類似物的生物活性。該模型有助于建立GdFFD類似物結構與活性之間的聯(lián)系,并強調(diào)GdFFD受體apALNR上1號位置肽活性的空間效應。
碰撞誘導去折疊(CIU)是非變性離子淌度質(zhì)譜技術的重要工具,可以實現(xiàn)氣相蛋白結構的快速精準操控。目前,基于CIU-IM-MS技術的神經(jīng)肽受體研究報道較少,主要是由于受體來源有限、表達量低,且難以從現(xiàn)有的蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)中分離純化。IM-MS在包括膜蛋白在內(nèi)的其他蛋白體系中取得了重要的研究進展,因此,利用IM-MS技術對神經(jīng)肽受體的結構研究將得到越來越多的關注[76-77]。
由于商用IM-MS裝置分辨率的限制,在保持對神經(jīng)肽受體等生物大分子足夠的靈敏度的同時,往往需要其他氣相結構操縱技術的協(xié)助,以獲得目標神經(jīng)肽受體的詳細信息[78]。將CIU[79-84]集成到IM-MS中可以增加分辨維度,并且能夠有效區(qū)分CCS非常接近的蛋白質(zhì)構象。當?shù)鞍踪|(zhì)離子在氣相中受到碰撞加熱時,通常遵循特定的去折疊路徑,得到結構特異性的CIU指紋圖譜[85-86]。因此,CIU技術有望成為分析神經(jīng)肽受體的有力工具。
基于CIU-IM-MS的手性多肽與蛋白受體相互作用的研究過程包含溶液相孵育、非變性質(zhì)譜測定和CIU構象操控3個關鍵步驟,示于圖5a。D/L-構型的多肽與蛋白受體結合后,通過非變性質(zhì)譜可以觀測到顯著不同的結合力和結合計量學信息。更重要的是,不同手性的多肽與受體結合形成的復合物可能展示顯著不同的氣相去折疊路徑,這種差異可以通過相關的數(shù)據(jù)分析軟件進行可視化和定量比較。本課題組[71]通過繪制CCS值與碰撞電壓的關系圖,初步探索了CIU技術在立體化學修飾受體作用復合物構象差異分析中的應用方案,示于圖5b。CIU指紋圖譜的特征條帶數(shù)量及其變換信息可用于蛋白構象及結構域穩(wěn)定性的快速分析。圖5b展示了人血清白蛋白的CIU指紋圖譜,從中可以推斷出至少4個主要構象中間體以及3個核心結構域信息,這與人血清白蛋白的晶體結構相符。為了定量表征D/L-構型多肽在受體結合時的結構差異,本課題組使用Ruotolo課題組[87]開發(fā)的CIUSuite工具包,其中2個關鍵參數(shù)是半數(shù)構象去折疊電壓(CIU50)和均方根差(RMSD)。通過對比結果,發(fā)現(xiàn)雖然CIU50值并沒有顯著差異,但不同手性多肽結合受體復合物的整體構象與去折疊CIU路徑卻有較顯著的差別(RMSD達到14.30%,一般基線背景RMSD小于5%)。
注:a.L-和D-構型多肽與受體結合流程示意圖;b.IM-MS在解決D/L構型方面的實例[71]圖5 IM-MS在區(qū)分D/L構型多肽與受體結合時的工作流程圖及實例Fig.5 Flow schematic diagrams and examples of IM-MS in differentiating the binding of D/L peptides to receptors
離子淌度質(zhì)譜聯(lián)用技術有效加速了蛋白質(zhì)立體化學修飾的分離分析和定性定量鑒定,在人類疾病相關的蛋白體系方面的應用有了初步進展。但目前立體化學修飾的離子淌度質(zhì)譜大部分集中在簡單體系(如單細胞生物)的研究,相比于其他翻譯后修飾的鑒定分析方法,該方法不夠成熟,在樣品提取、富集分離、儀器參數(shù)、數(shù)據(jù)采集和可視化分析等方面仍有很大的改進空間。為了繪制人類多種重大疾病相關的蛋白質(zhì)立體化學修飾圖譜,需要進一步開發(fā)定量分析方法及其在生物組織內(nèi)空間分布的測定方法,以獲得更全面的生物學信息。
1) 立體化學修飾的定量組學分析:現(xiàn)行大部分離子淌度質(zhì)譜方法主要集中于純化體系的研究,在組學水平上的立體化學修飾鑒定方法仍有較大的改進空間,如開發(fā)立體化學修飾特異性、兼容的多重等質(zhì)量同位素定量標簽標記技術,有望實現(xiàn)對不同生物環(huán)境下分析物中手性多肽的相對和絕對定量。
2) 立體化學修飾的空間分辨組學分析:將離子淌度與質(zhì)譜成像相結合,基于手性多肽分析物的碰撞截面積信息,可將其與對應的L型多肽異構體區(qū)分開,從而特異性地獲取其在生物組織切片中的分布,直觀地呈現(xiàn)手性多肽產(chǎn)生與作用的區(qū)域。與此同時,可以比較手性多肽與其潛在受體在同一組織內(nèi)的空間分布,探究其與受體相互作用的規(guī)律。
3) 立體化學修飾的高分辨儀器開發(fā):隨著儀器設備和分析方法的發(fā)展,更高分辨率的離子淌度儀可以使較大的手性多肽(>40殘基)及其L型多肽異構體在不需要酶解的前提下快速拆分和鑒定,簡化了分析步驟,并縮短了檢測時間。
4) 立體化學修飾的串聯(lián)質(zhì)譜分析:近年來,基于新型碎裂模式的串聯(lián)質(zhì)譜技術逐漸用于分析手性多肽。RDD模式對前體離子結構較為敏感,可以根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜圖中碎片離子的相對強度實現(xiàn)對手性多肽的鑒定及定量[57]?;谒槠x子的相對強度,電子捕獲裂解(electron capture dissociation, ECD)也被用于區(qū)分多肽中的Asp和isoAsp[88]。未來還可嘗試將紫外光致解離(ultraviolet photodissociation, UVPD)、電子誘導解離(electron induced dissociation, EID)和紅外多光子解離(infrared multiple photon dissociation, IRMPD)等串聯(lián)質(zhì)譜模式與離子淌度分離相結合,建立更有力的手性多肽鑒定與定量方法。
5) 立體化學修飾的構效關系研究:立體化學修飾的構效關系是其發(fā)揮生物學功能的重要分子基礎之一。目前,相互作用分析儀在結構分析靈敏度和樣品消耗等方面均存在不利于立體化學修飾分析的因素。超高靈敏結構分析技術的開發(fā)將大大推進該領域的發(fā)展。此外,分子動力學模擬能夠從原子層面給出體系的微觀演變過程,尤其是結合實驗測量數(shù)據(jù),如離子淌度質(zhì)譜指導下的分子動力學模擬,將為解構SCMP高分辨三維構象和全景式構象分析提供可能。